衣康酸衍生物通過調(diào)控肺上皮細胞趨化因子減輕急性肺損傷的研究

章曉辰 李盈科

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是以肺部炎癥和肺泡毛細血管屏障破壞為特征的臨床綜合征，常繼發(fā)于重癥肺炎、膿毒癥、嚴重創(chuàng)傷等疾病[1]。多種炎癥細胞參與了ALI肺部炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程。中性粒細胞在清除肺部病原體的同時破壞了肺泡毛細血管屏障，甚至促使疾病進展為呼吸窘迫綜合征。趨化因子在中性粒細胞、巨噬細胞的定向聚集過程中發(fā)揮重要作用。趨化因子CXCL15在小鼠黏膜上皮細胞中特異性表達[2]，其與人類IL-8基因同源，在肺部發(fā)生炎癥時對炎癥細胞的聚集和浸潤起到重要作用[3-4]。

衣康酸由免疫應(yīng)答基因1(immune-responsive gene 1，IRG1)編碼的順烏頭酸脫羧酶與三羧酸循環(huán)中的順烏頭酸發(fā)生脫羧反應(yīng)而來，在活化狀態(tài)的巨噬細胞中大量產(chǎn)生并分泌[5-6]。衣康酸可在巨噬細胞中發(fā)揮殺菌活性[7-8]，還可以通過影響細胞因子的表達和炎癥細胞的分化發(fā)揮重要的抗炎作用[9-11]，但其是否對上皮細胞發(fā)揮作用尚不明確。二甲基衣康酸(DMI)和四辛基衣康酸(OI)是兩種膜浸潤性較強的衣康酸衍生物，在細胞培養(yǎng)過程中可以自由透過細胞膜，在細胞內(nèi)發(fā)揮作用。 本研究利用小鼠肺上皮細胞系膿毒癥模型，探索衣康酸對肺上皮細胞趨化因子的表達影響，對趨化因子介導(dǎo)的炎癥細胞浸潤的調(diào)節(jié)作用，以及其在膿毒癥條件下的器官保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物和細胞株來源與主要試劑 6～8周C57BL/6小鼠，購自海軍軍醫(yī)大學實驗動物中心[動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2012-0003，使用許可證號SYXK(滬)2012-0003]。小鼠Ⅱ型肺上皮細胞系MLE-12(CRL-2110)和人非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549(CCL-185)均購自美國模式菌種收集中心(ATCC)。脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；DMI購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；OI購自美國Cayman Chemical公司；實時定量PCR引物購自上海生工生物科技有限公司；紫草素葉綠素(PerCP)標記的抗小鼠CD45抗體、藻紅蛋白(PE)標記的抗小鼠CD11b抗體購自BioLegend公司。多聚甲醛、PBS等常用試劑均由海軍軍醫(yī)大學醫(yī)學免疫學研究所提供。

1.2 小鼠膿毒癥模型的建立 采用數(shù)字表法將8只C57BL/6小鼠隨機分為PBS組和LPS組，每組4只。LPS組小鼠予腹腔內(nèi)注射5 mg/kg LPS，PBS組注射等量PBS。24 h后處死小鼠，收集其肺組織進行后續(xù)實驗。

1.3 衣康酸衍生物干預(yù)LPS處理的肺上皮細胞 將MLE-12細胞培養(yǎng)于含2%的胎牛血清(FBS，購自美國Gibco公司)和1%的青霉素、鏈霉素、兩性霉素溶液(購自美國Thermo Fisher公司)的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后換液，將細胞懸液接種于24孔板中，隨機分為二甲基亞砜(DMSO)組、低濃度DMI組、高濃度DMI組、低濃度OI組、高濃度OI組，每組4孔。低濃度和高濃度衣康酸組分別加入終濃度為62.5 μmol/L和125 μmol/L的DMI或OI溶液，DMSO組加入等體積DMSO；3 h后，加入LPS(終質(zhì)量濃度為10 mg/L)，刺激6 h后收集細胞，提取細胞總RNA，繼續(xù)后續(xù)實驗。將A549細胞培養(yǎng)于含10%FBS(購自美國Gibco公司)和1%的青霉素、鏈霉素、兩性霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基， 置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后換液，將細胞懸液接種于24孔板中，隨機分為DMSO組、低濃度DMI組、高濃度DMI組，每組4孔，分別加入DMSO和終濃度為62.5 μmol/L、125 μmol/L DMI預(yù)處理3 h后，加入LPS(終質(zhì)量濃度為10 mg/L)；刺激6 h后收集細胞，提取細胞總mRNA，進行后續(xù)實驗。

1.4 應(yīng)用衣康酸衍生物干預(yù)小鼠肺損傷模型 采用數(shù)字表法將18只C57BL/6小鼠隨機分為PBS組、DMI組、OI組，每組6只。 按照50 mg/kg分別計算DMI和OI的用量，用PBS配置成懸液。DMI組、OI組小鼠氣管內(nèi)滴注相應(yīng)的藥物懸液15 μL，PBS組氣管內(nèi)滴注等體積PBS。6 h后，所有小鼠予腹腔內(nèi)注射LPS(5 mg/kg)，飼養(yǎng)24 h。每組隨機選取3只小鼠提取其支氣管肺泡灌洗液，之后取所有小鼠肺組織，繼續(xù)后續(xù)實驗。

1.5 肺組織病理學檢查 右下葉肺組織以4%多聚甲醛固定24 h。制備石蠟切片(厚度為4 μm)，經(jīng)H-E染色后置于光學顯微鏡下觀察。以鏡下肺泡壁寬度評估肺組織水腫情況，通過肺泡壁周圍有核細胞密度評估炎癥細胞浸潤情況。

1.6 支氣管肺泡灌洗液的獲取和流式細胞術(shù)檢測 各組小鼠經(jīng)PBS或衣康酸衍生物預(yù)處理，腹腔內(nèi)注射LPS 24 h后，用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，手術(shù)暴露氣管，并插管。用2 mL PBS反復(fù)沖洗后吸出，置于eppendort管中；立即于4 ℃ 200×g離心5 min， 獲取的細胞用1∶50加入熒光抗體的PBS重懸，并避光孵育10 min，再次離心(200 ×g，5 min， 4 ℃)，并以100 μL PBS重懸后，使用流式細胞儀檢測。

1.7 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測 利用總RNA極速抽提試劑盒(上海飛捷生物技術(shù)有限公司)按照實驗步驟提取各組MLE-12和A549細胞總RNA，置于-80 ℃保存至使用。對于每個樣本，在20 μL反轉(zhuǎn)錄體系中，使用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV反轉(zhuǎn)錄1 000 ng RNA。實時定量PCR反應(yīng)按照TB Green(日本TaKaRa公司)說明書混合轉(zhuǎn)錄模版、引物和試劑，進行定量PCR。以GAPDH作為內(nèi)參對照，對比TNF-α、IL-6、CXCL15(或IL-8)mRNA相對表達量，引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型和肺上皮細胞模型特征 在LPS誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥模型中發(fā)現(xiàn)，LPS組小鼠肺部中性粒細胞浸潤較PBS組明顯，見圖1。與未處理的MLE-12細胞(0 h)相比，LPS誘導(dǎo)小鼠MLE-12細胞3、6 h后，TNF-α、IL-6和CXCL15的mRNA相對表達量均顯著升高(P值分別<0.01, 0.05)。見表2。

A PBS組 B LPS組圖1 腹腔內(nèi)注射LPS誘導(dǎo)膿毒癥模型小鼠肺部炎癥細胞浸潤情況(H-E染色，×100)

表2 LPS誘導(dǎo)的各時間點MLE-12細胞各炎癥因子mRNA相對表達量的比較

2.2 衣康酸衍生物降低LPS誘導(dǎo)的MLE-12細胞炎癥因子mRNA表達量 低濃度和高濃度DMI組各細胞炎癥因子mRNA相對表達量均顯著低于DMSO組(P值均<0.01)。高濃度OI組各細胞炎癥因子mRNA相對表達量均顯著低于低濃度OI組和DMSO組(P值分別<0.01，0.05)；低濃度OI組僅IL-6 mRNA相對表達量顯著低于DMSO組(P<0.01)。見表3。

表3 兩種衣康酸衍生物預(yù)處理后MLE-12細胞各炎癥因子mRNA相對表達量的比較

2.3 DMI降低LPS誘導(dǎo)的A549細胞炎癥因子mRNA表達量 低濃度DMI預(yù)處理后，A549細胞的TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA相對表達量與DMSO組的差異無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。高濃度DMI預(yù)處理的A549細胞的TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA相對表達量均顯著低于低濃度DMI組和DMSO組(P值分別<0.01、0.05)。見表4。

表4 DMI預(yù)處理后A549細胞各炎癥因子mRNA相對表達量的比較

2.4 衣康酸衍生物經(jīng)氣管內(nèi)給藥減輕膿毒癥模型小鼠肺損傷 觀察小鼠肺臟大體標本發(fā)現(xiàn)，DMI組和OI組小鼠肺泡內(nèi)出血面積均小于PBS組，見圖2。H-E染色示：DMI和OI組小鼠肺組織肺泡內(nèi)炎癥細胞浸潤水平均低于PBS組，見圖3。

圖2 不同預(yù)處理的膿毒癥模型小鼠肺部損傷情況

各組小鼠的肺泡灌洗液流式細胞術(shù)檢測示：DMI組和OI組小鼠肺泡灌洗液中CD11b陽性細胞(中性粒細胞)分別占總細胞數(shù)的(41.467±6.850)%和(39.767±9.393)%，均較PBS組的(65.433±5.179)%顯著降低(P值均<0.05)，見圖4。

A PBS組 B DMI組 C OI組圖4 不同預(yù)處理的膿毒癥模型小鼠肺泡灌洗液中CD11b陽性細胞比例

3 討 論

中性粒細胞參與肺部炎癥的發(fā)生與發(fā)展，而過度的中性粒細胞浸潤，可能引起上皮細胞和內(nèi)皮細胞的死亡[12]，加重局部組織損傷。趨化因子對炎癥條件下中性粒細胞的局部定向性聚集有重要影響，尤其是IL-8(小鼠體內(nèi)表達為CXCL15)在肺黏膜等部位表達水平較高[2]，在局部炎癥趨化反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。 所以，限制中性粒細胞的過度聚集，維持適當?shù)慕M織炎癥反應(yīng)程度，在控制ALI的發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用。

經(jīng)組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的膿毒癥模型小鼠肺臟出現(xiàn)了明顯的炎癥細胞浸潤。在小鼠MLE-12細胞系中也觀察到，細胞系經(jīng)LPS誘導(dǎo)3、6 h后，TNF-α、IL-6和CXCL15 mRNA相對表達量即明顯升高，說明在膿毒癥的早期，上皮細胞即可對炎癥細胞有直接的趨化作用，誘導(dǎo)中性粒細胞聚集，從而使ALI的發(fā)生成為可能。

衣康酸除可在小鼠巨噬細胞內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)控的作用外，在整個免疫調(diào)節(jié)過程中也發(fā)揮著重要的作用。作為線粒體能量代謝和細胞免疫功能之間的橋梁[10]，衣康酸可作用于包括Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)-核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)[6]、IκBζ-ATF3[7]等通路，調(diào)節(jié)巨噬細胞免疫功能[8]，發(fā)揮抗炎作用。同時，衣康酸被發(fā)現(xiàn)對體內(nèi)組織有一定的抗氧化作用，衣康酸預(yù)注射可以縮小心肌缺血小鼠模型心肌梗死的面積[8]，提示衣康酸存在潛在的器官保護作用。IRG1不僅僅在活化狀態(tài)下的巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞等免疫細胞中表達；在病毒感染的肺組織、神經(jīng)元，甚至妊娠期的子宮內(nèi)膜細胞中，IRG1的表達水平也有提高[13-18]；這些都提示了IRG1和衣康酸不僅表達于免疫細胞，同時也在實質(zhì)細胞的病理生理過程中表達，并可能發(fā)揮作用。

本研究使用DMI和OI預(yù)處理MLE-12和A549細胞系，小鼠氣管內(nèi)滴注衣康酸衍生物，以探索衣康酸在ALI中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然LPS可誘導(dǎo)肺上皮細胞炎癥細胞因子和趨化因子mRNA相對表達量增加，但兩種衣康酸衍生物均對LPS誘導(dǎo)的炎癥有抑制作用；并且，OI在較高濃度下(125 μmol/L)可以降低CXCL15 mRNA的表達，而DMI在較低濃度下(62.5 μmol/L)即可發(fā)揮炎癥抑制作用。在后續(xù)的小鼠體內(nèi)實驗中，經(jīng)氣管內(nèi)給予DMI或OI的小鼠在LPS誘導(dǎo)后肺出血面積較小、肺上皮毛細血管屏障破壞較少，肺泡內(nèi)炎癥細胞浸潤程度較低。經(jīng)肺泡灌洗液細胞組成比例分析驗證，經(jīng)DMI或OI處理的小鼠肺泡灌洗液中，中性粒細胞的比例均較對照組顯著下降。

綜上所述，在肺泡內(nèi)局部應(yīng)用衣康酸衍生物可以減少膿毒癥小鼠肺泡內(nèi)炎癥細胞的聚集和浸潤，其機制可能與衣康酸衍生物可以減少肺上皮細胞在膿毒癥條件下細胞因子和趨化因子的表達相關(guān)。說明了衣康酸在膿毒癥或全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展過程中具有潛在的器官保護作用。