超高壓對仙人掌有孢漢遜酵母的損傷機(jī)理

雷雨晴，郝靜怡，吳 傲，甘芝霖，孫愛東

（1. 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2. 林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

0 引言

非釀酒酵母常出現(xiàn)在漿果表面，并可在果酒天然發(fā)酵早期發(fā)揮作用，影響酒類發(fā)酵質(zhì)量，給產(chǎn)品帶來或積極或消極的影響[1-3]。根據(jù)其特性，可以分為好氧型、低發(fā)酵活性型、高發(fā)酵活性型三大類，其中最常見的品種為檸檬形克勒克酵母（Klockera apiculata）、有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）兩種[4]。但在果蔬制品（果蔬汁、鮮果、非酒精性飲料等）中，非釀酒酵母的生長繁殖及代謝會產(chǎn)生乙醇等容易引起產(chǎn)品質(zhì)變的成分，因而被視為腐敗菌種。熱處理是殺滅果蔬制品腐敗菌的常用手段，可以有效抑制其生長，但容易造成熱敏性活性物質(zhì)的損失，并導(dǎo)致食品感官品質(zhì)下降[5]。因此，以超高壓、脈沖電場等為代表的非熱殺菌技術(shù)開始被應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域，這些技術(shù)可以較好保持食品原有的品質(zhì)[6-9]，同時滿足食品衛(wèi)生要求。

超高壓（High Hydrostatic Pressure，HHP）是近年來被廣泛研究的一種冷殺菌技術(shù)，在海產(chǎn)品、肉類、果蔬加工等領(lǐng)域均已得到應(yīng)用[10-14]。該技術(shù)不僅可以有效殺滅病原微生物、延長食品貨架期，還擁有改變食品性質(zhì)得到新結(jié)構(gòu)食品的可能性[14]。相比于傳統(tǒng)熱殺菌技術(shù)，超高壓有效克服了熱處理的弊端，在保證食品的微生物安全的基礎(chǔ)上，還可以較好地保持食品原有的質(zhì)構(gòu)、營養(yǎng)、風(fēng)味以及新鮮度等，更加符合當(dāng)前市場對保持食品原汁原味的消費(fèi)需求[15]。超高壓對食品微生物的殺菌機(jī)理一直是近年來的研究熱點(diǎn)之一，目前超高壓對于細(xì)菌的殺菌研究較為全面和透徹，已有研究表明，高壓狀態(tài)下細(xì)胞膜損傷、活性氧水平的提升是導(dǎo)致細(xì)菌失活的原因[16]。對于酵母菌，研究報(bào)道超高壓對于釀酒酵母的殺菌效果較好，可以破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使得細(xì)胞壁碎片化，細(xì)胞質(zhì)大量流出[17]，然而針對非釀酒酵母的殺菌研究卻十分少見，因此本文擬以一種非釀酒酵母-仙人掌有孢漢遜酵母為研究對象探究超高壓對其的損傷機(jī)理。

仙人掌有孢漢遜酵母是一種較為常見的非釀酒酵母，可從天然采收的葡萄等漿果中分離出來[18]，具有生產(chǎn)乙醇的能力并可導(dǎo)致漿果的腐敗[19-21]。漿果采收后，表面酵母菌的生長繁殖是導(dǎo)致其腐敗的主要因素，因此采取有效措施抑制非釀酒酵母的生理活性對提高產(chǎn)品的質(zhì)量、減少價值損失具有重要意義。但目前針對殺滅仙人掌有孢漢遜酵母的研究鮮有報(bào)道，因此進(jìn)行超高壓殺菌對其損傷機(jī)制的探究是十分必要。

本文中對仙人掌有孢漢遜酵母菌液進(jìn)行超高壓處理，通過測定碘化丙啶染色情況、紫外260及280 nm吸光度、電導(dǎo)率等方式表征細(xì)胞膜損傷情況，利用圓二色譜儀、流式細(xì)胞儀等儀器探究超高壓對菌體胞內(nèi)物質(zhì)的影響，再基于掃描電鏡、透射電鏡觀察得到損傷菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化圖像，從試驗(yàn)結(jié)果中推斷出可能的損傷機(jī)理，從而為非釀酒酵母的滅活研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種及培養(yǎng)基：仙人掌有孢漢遜酵母（序列號FM199954.1），由本實(shí)驗(yàn)室從早期腐敗的愛國者藍(lán)莓汁中自主分離純化，采用方法參考本實(shí)驗(yàn)室Zhu等[22]的研究內(nèi)容；麥芽汁瓊脂（Malt Extract Agar，MEA）培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基（Malt Extract Medium，MEM），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS，pH值5.6）、氯化鈉、碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）、戊二醛、吖啶橙（Acridine Orange，AO），北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；超微量ATP酶試劑盒（Na+/K+、Ca2+/Mg2+、T-ATP酶），南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

CAU-HHP-700-7型超高壓設(shè)備，包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司；TS-100B型搖床，上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；SW-CJ-2D型超凈臺，中興儀器設(shè)備有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械；TM-03筆型電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV 6100型紫外-可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；BD FACS Calibur型流式細(xì)胞儀，上海普迪生物技術(shù)有限公司；Quanta FEG250型掃描電子顯微鏡，美國Sprite biotwin有限公司；Fei tecnai G2型透射電子顯微鏡，美國Sprite biotwin有限公司；Chirascan plus型圓二色光譜儀，美國Photo Physics儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 菌液制備

挑取仙人掌有孢漢遜酵母單菌落接種至2 mL PBS緩沖液中，混勻后取0.5 mL菌懸液加入150 mL MEM培養(yǎng)基，28 ℃搖床180 r/min培養(yǎng)16 h，將培養(yǎng)好的菌液離心（5000 r/min，10 min，4 ℃）去上清液，用PBS清洗菌體兩次，重懸，調(diào)整菌液濃度為106～107CFU/mL備用。

1.3.2 超高壓處理

將樣品置于7 L的超高壓密閉圓筒中，以水為傳壓介質(zhì)，水溫不超過25 ℃，升壓速率與降壓速率分別為3.3 MPa/s和133.3 MPa/s。恒定壓力500 MPa，處理150、300、450、600 s；恒定處理時間300 s，設(shè)定壓力100、200、300、400、500 MPa 。升降壓時間不算在處理時間內(nèi)。

1.3.3 微生物計(jì)數(shù)方法

采用GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：霉菌和酵母計(jì)數(shù)》的方法檢測酵母細(xì)胞總數(shù)。即將菌液用PBS緩沖液梯度稀釋至合適濃度后取0.1 mL通過涂布法接種在MEA培養(yǎng)基上，在（28±0.1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。用酵母菌死亡數(shù)lgS表示殺菌效果，公式如下

式中N0表示處理前酵母菌數(shù)量，N表示處理后酵母菌數(shù)量，CFU/mL。

1.3.4 細(xì)胞膜完整性檢測

參考Huang等[23]的方法進(jìn)行細(xì)胞膜完整性檢測。樣品用PI染料（終質(zhì)量濃度為5μg/mL）在4 ℃下染色10 min后用PBS洗滌2次備用。用流式細(xì)胞儀測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)和發(fā)射波長分別設(shè)置為495 nm和615 nm。

1.3.5 細(xì)胞膜通透性檢測

核酸的共軛雙鍵在紫外260 nm處有最大吸光度，蛋白的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在280 nm處有最大吸光度，因此通過光度法測定菌液上清液的OD260nm及OD280nm值可以顯示核酸與蛋白泄漏情況[24]，即將處理后的菌懸液離心（4 ℃，5000 r/min，10 min），取上清液分別在260和280 nm波長條件下測定吸光度。利用電導(dǎo)率儀測定上清液電導(dǎo)率。

1.3.6 胞內(nèi)酶活檢測

用超微量ATP酶試劑盒進(jìn)行測定，參照試劑盒方法：將處理前后菌液在冰水浴中超聲破碎（功率200 W，工作時間2 s間隔3 s，工作次數(shù)100）得菌體裂解液，稀釋至合適濃度后進(jìn)行酶促反應(yīng)，與試劑混勻后于37 ℃反應(yīng)10 min，離心（3500 r/min，10 min）取上清液，靜置5 min后在636 nm處測定吸光度。胞內(nèi)酶活力單位以prot計(jì)，表示為U/mg。

1.3.7 蛋白質(zhì)變性檢測

參考Zhong等[25]的方法，用圓二色譜儀進(jìn)行測定。將1.3.6中獲得的菌體裂解液離心（4 ℃，8000 r/min，15 min），取上清液置于圓二色譜儀進(jìn)行測定，比色皿厚度0.1 cm，譜帶寬度1.0 nm，分辨率0.2 nm，掃描波長范圍200～250 nm。

1.3.8 遺傳物質(zhì)變化檢測

AO染料可以對酵母菌細(xì)胞中的DNA和RNA進(jìn)行染色并測定含量[26]。將樣品用AO染液（終質(zhì)量濃度為5μg/mL）于37 ℃避光染色10 min，用PBS沖洗兩次洗去多余染料。用流式細(xì)胞儀檢測其熒光強(qiáng)度，設(shè)置激發(fā)波長495 nm，發(fā)射波長615 nm，狹縫寬度10 nm。

1.3.9 掃描電鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）與透射電鏡（Transmission Electron Microscope，TEM）觀察

SEM與TEM樣品前處理：將處理前后菌懸液離心（4 ℃，5000 r/min，10 min）后棄去上清液，菌體用無菌超純水清洗兩次后置于體積分?jǐn)?shù)2.5 %戊二醛中，在4 ℃冰箱中固定12 h后用PBS（pH值5.6）漂洗3次。進(jìn)行梯度乙醇脫水，30%、50%、70%、90%乙醇各一次，100%乙醇兩次，10 min/次。

對于SEM樣品，乙醇脫水后用30%、50%、70%、90%和100%叔丁醇溶液逐級取代乙醇，真空冷凍干燥后噴金觀察。掃描電鏡下電子束加速電壓10 kV，放大倍數(shù)5000倍。

對于TEM樣品，乙醇脫水后進(jìn)行常規(guī)滲透，用樹脂包埋聚合后進(jìn)行超薄切片（厚度70 nm），經(jīng)染料染色后上鏡觀察[27]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)做3次重復(fù)，用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，并使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析、Duncan多重比較及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（P＜0.05），試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓處理對仙人掌有孢漢遜酵母的滅活效果

如圖1所示，當(dāng)壓力在200 MPa以下時，幾乎無滅活效果，300 MPa時酵母菌死亡數(shù)顯著（P＜0.05）提升至4.36 lg(CFU/mL)，壓力繼續(xù)增大時死亡數(shù)緩慢升高，推測300 MPa處為高壓致死轉(zhuǎn)折點(diǎn)；處理時間小于300 s時，已有較好的滅活效果，死亡數(shù)達(dá)4.30 lg(CFU/mL)，當(dāng)處理時間延長時，酵母菌死亡數(shù)反而下降，這可能是由于菌體在高壓刺激下產(chǎn)生了應(yīng)激防御[28]而導(dǎo)致的。考慮到超高壓短時處理殺菌不徹底易產(chǎn)生亞致死狀態(tài)的細(xì)胞[29]（是一種存活但非可培養(yǎng)狀態(tài)，又稱“假死”狀態(tài)），同時300 s處為死亡數(shù)下降的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，因此選定300 MPa、300 s作為后續(xù)超高壓處理的條件。

2.2 超高壓處理對細(xì)胞膜的影響

2.2.1 超高壓處理對細(xì)胞膜完整性的影響

PI是一種可以通過損傷細(xì)胞膜與細(xì)胞DNA結(jié)合發(fā)出紅色熒光的染料，而完整細(xì)胞則不會被其染色，常用于細(xì)胞活性鑒定[30]。圖2結(jié)果顯示，未處理細(xì)胞幾乎不被PI染色，而超高壓處理后則有70.50%的細(xì)胞被染色，以上結(jié)果表明，300 MPa超高壓條件導(dǎo)致了細(xì)胞膜損傷。研究表明，細(xì)胞膜最重要的功能就是作為選擇性屏障保護(hù)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，膜完整性受損會導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)流出和膜蛋白失活，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞死亡[31]。

2.2.2 超高壓處理對細(xì)胞膜通透性的影響

當(dāng)微生物細(xì)胞處于不利環(huán)境時，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的K+、Na+等電解質(zhì)外泄，從而導(dǎo)致菌懸液電導(dǎo)率提高[32]。根據(jù)表1可知，超高壓處理后，菌懸液電導(dǎo)率從4μS/cm增加至26μS/cm，表明細(xì)胞膜通透性升高，細(xì)胞內(nèi)的離子發(fā)生外泄，導(dǎo)致電導(dǎo)率發(fā)生變化。

蛋白質(zhì)和核酸作為細(xì)胞內(nèi)重要的大分子物質(zhì)，在膜通透性正常的情況下不會泄漏到細(xì)胞膜外，除非細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變[33]。通過測定菌液離心后上清液在260、280 nm的吸光度可以反映其核酸、蛋白的泄漏情況，而胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏程度可間接反映膜損傷的情況[34]。如表 1所示，超高壓處理可導(dǎo)致胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏，OD260nm、OD280nm值分別提高至1.132、0.374。以上結(jié)果表明，超高壓處理酵母細(xì)胞膜壁造成了較為嚴(yán)重的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性升高，核酸和蛋白外泄，進(jìn)而導(dǎo)致菌體死亡。

表1 超高壓處理對仙人掌有孢漢遜酵母電導(dǎo)率、紫外260與280 nm吸光度的影響 Table 1 Effects of HHP on conductivity, OD260nm and OD280nm of Hanseniaspora opuntiae

目前研究學(xué)者普遍認(rèn)為，超高壓對微生物的滅活作用是由于其破壞了膜結(jié)構(gòu)，與本文的結(jié)果相符。這可能是因?yàn)槌邏禾幚砜墒菇湍讣?xì)胞膜發(fā)生相變[35]，磷脂雙分子層上脂肪?；溇奂ち鲃有越档蚚36]，使得自由基積累引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[37]，從而造成酵母細(xì)胞的失活。

2.3 超高壓處理對細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 掃描電鏡觀察

掃描電鏡可反映不同處理后細(xì)胞外部形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。在圖3中可以發(fā)現(xiàn)，未處理的仙人掌有孢漢遜酵母菌呈橢球狀，表面光滑完整；在超高壓處理后，菌體仍保持橢球狀，但表面不再光滑，出現(xiàn)凹陷、裂縫。根據(jù)Shimada等[38]的研究，室溫條件下，當(dāng)壓力超過300 MPa時釀酒酵母的表面形態(tài)發(fā)生改變，且金屬離子開始發(fā)生外泄，這與本文的研究結(jié)果相似。這表明超高壓會導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變，這可能是細(xì)胞失活的原因之一。

2.3.2 透射電鏡觀察

透射電鏡可反映不同處理后細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。由圖4可知，未處理的酵母菌體有完整的細(xì)胞膜壁，可以看到清晰完整的細(xì)胞器，且細(xì)胞質(zhì)均勻致密；經(jīng)超高壓處理后，細(xì)胞膜出現(xiàn)明顯孔洞，細(xì)胞周質(zhì)空間寬度增大，細(xì)胞器破裂，胞內(nèi)物質(zhì)大量外泄。Shimada等[38]研究中也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果，超高壓處理后釀酒酵母內(nèi)部結(jié)構(gòu)受到影響，大多數(shù)細(xì)胞器被破壞。Hartmann等[39]通過建立釀酒酵母結(jié)構(gòu)模型發(fā)現(xiàn)，壓力作用在細(xì)胞壁上會引起嚴(yán)重的非靜水壓力，這可能與膜結(jié)合蛋白變性等失活機(jī)制相關(guān)，而非靜水壓力會被傳遞到細(xì)胞內(nèi)部并保持穩(wěn)定，當(dāng)壓力達(dá)到415～460 MPa時達(dá)到臨界值，此時可觀察到細(xì)胞壁損傷，但由于試驗(yàn)用菌種不同，臨界值也會存在差異。

結(jié)合掃描電鏡和透射電鏡圖像可以發(fā)現(xiàn)，超高壓處理會導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的破壞，增強(qiáng)了細(xì)胞膜的通透性，使膜結(jié)構(gòu)穿孔或開裂，從而造成菌體內(nèi)容物泄漏，同時超高壓處理會導(dǎo)致胞內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)被破壞，無法進(jìn)行正常的生理活動，最終導(dǎo)致了酵母的死亡。

2.4 超高壓處理對胞內(nèi)物質(zhì)的影響

2.4.1 超高壓處理對胞內(nèi)酶活力的影響

Na+/K+- ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶廣泛存在于高等真核生物的質(zhì)膜上，分別負(fù)責(zé)驅(qū)動膜內(nèi)外Na+和K+、Ca2+和Mg2+離子的對向運(yùn)動，調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，從而維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[40-41]，對信息運(yùn)送和能量轉(zhuǎn)換等生理活動也具有重要意義[42]。由圖5可以看出，超高壓處理后，仙人掌有孢漢遜酵母胞內(nèi)的Na+/K+- ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶和總ATP酶的活力和空白對照相比分別降低了31.13%，16.01%和20.06%（抑制率）。之前已有研究表明，超高壓處理會造成副溶血性弧菌[43]等菌種的ATP酶活降低。本研究結(jié)果顯示，超高壓同樣會使得仙人掌有孢漢遜酵母細(xì)胞膜ATP酶失活，從而導(dǎo)致胞內(nèi)外離子運(yùn)輸及能量供應(yīng)失衡，使胞內(nèi)多種生理代謝紊亂，導(dǎo)致菌體死亡。

2.4.2 超高壓處理對胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

圓二色光譜的遠(yuǎn)紫外區(qū)（200～250nm）屬于蛋白質(zhì)中肽鍵的吸收范圍，包含著蛋白質(zhì)主鏈的構(gòu)象信息，可以觀測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)類型。根據(jù)圓二色譜結(jié)果可知（圖6），未處理的仙人掌有孢漢遜酵母菌液裂解液在208及222 nm處顯示有明顯α-螺旋的雙負(fù)峰[44]，但在216 nm處沒有β-折疊的特征峰，說明仙人掌有孢漢遜酵母菌胞內(nèi)蛋白二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主。在經(jīng)過超高壓處理后，仍未出現(xiàn)β-折疊的特征峰，但208 nm處峰強(qiáng)度降低，222 nm處的特征峰消失，說明超高壓處理均可以導(dǎo)致α-螺旋含量下降，對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)造成影響。研究表明，超高壓技術(shù)在蛋白改性方面也有廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)含量改變，蛋白結(jié)構(gòu)變得松散[45]。Gipsy等[46]的研究中也發(fā)現(xiàn)，超高壓會使蛋白二級結(jié)構(gòu)改變。正常細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞膜會傳遞壓力，但突破臨界值后細(xì)胞膜壁破裂，因此在超高壓處理時，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變后壓力作用于細(xì)胞器及細(xì)胞質(zhì)，可能是導(dǎo)致內(nèi)部蛋白結(jié)構(gòu)改變的原因。

2.4.3 超高壓處理對胞內(nèi)核酸結(jié)構(gòu)的影響

吖啶橙（AO）是一種特異性的熒光染料，具有膜通透性，可以自由透過細(xì)胞膜并與菌體細(xì)胞內(nèi)的核酸物質(zhì)結(jié)合[47]。AO與雙鏈DNA結(jié)合，發(fā)出綠色熒光；與RNA或者單鏈DNA結(jié)合，則發(fā)出桔紅色熒光。根據(jù)圖 7結(jié)果，超高壓處理后，單鏈核酸增加至60.75%，而雙鏈核酸降低至38.84%，表明超高壓處理對核酸結(jié)構(gòu)有明顯影響。由此可知，核酸損傷是超高壓可能的殺菌機(jī)制之一。

3 結(jié)論

本研究分析了超高壓處理對仙人掌有孢漢遜酵母細(xì)胞的影響，通過對細(xì)胞膜、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、胞內(nèi)物質(zhì)變化的研究，探討了可能的損傷機(jī)理，研究結(jié)果如下：

1）超高壓處理對仙人掌有孢漢遜酵母有較好的滅活效果，300 MPa和300 s殺滅的菌落數(shù)為4.36 lg(CFU/mL)。在對其損傷機(jī)理的探究中發(fā)現(xiàn)，超高壓通過破壞仙人掌有孢漢遜酵母的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)使得胞內(nèi)核酸、蛋白、離子大量外泄，同時，在高壓的作用下，胞內(nèi)Na+/K+- ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶和總ATP酶活均有所降低，胞內(nèi)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)改變、DNA解旋。因此，推測膜的破損、胞內(nèi)物質(zhì)的失活是超高壓損傷仙人掌有孢漢遜酵母的可能機(jī)制。

2）超高壓處理后仙人掌有孢漢遜酵母的生理指標(biāo)有所改變，但本文研究還不夠深入，僅憑所測指標(biāo)無法闡述損傷具體機(jī)制。后續(xù)試驗(yàn)可以考慮借助組學(xué)研究手段，探究超高壓處理后該酵母菌基因?qū)用娴淖兓?，從而探究菌體細(xì)胞在分子水平上對外界環(huán)境做出的應(yīng)答反應(yīng)以及相關(guān)機(jī)制。