美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種LAMP快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

姚學(xué)良,蔡琰,徐曉麗,鐘文慧,包海巖

美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種LAMP快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

姚學(xué)良,蔡琰,徐曉麗,鐘文慧,包海巖*

天津市水產(chǎn)研究所, 天津 300221

建立了美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)。針對(duì)基因保守序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)2對(duì)特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫65 ℃下保溫40 min。采用鈣黃綠素作為顯色劑，F(xiàn)TA卡采集病樣肝組織中病原菌核酸。結(jié)果顯示：以基因建立的LAMP方法能夠特異性檢測(cè)美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種，檢測(cè)靈敏度為2.6×102cfu/mL。針對(duì)美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種基因建立的LAMP檢測(cè)方法具有較好的特異性和穩(wěn)定性，可用于美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種的野外現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

豹紋鰓棘鱸; 美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種;; LAMP

豹紋鰓棘鱸(Lacépède)俗稱(chēng)東星斑、豹鲙、花斑刺鰓鮨，隸屬鱸形目、鮨科、鰓棘鱸屬。主要分布于西太平洋至印度洋海區(qū)，東至斐濟(jì)，西到非洲東岸，紅海等地，南到澳洲，北自日本南部。該魚(yú)屬高檔食用魚(yú)類(lèi)，在國(guó)際市場(chǎng)上深受歡迎，市場(chǎng)前景廣闊，同時(shí)具有較高的觀賞價(jià)值。目前對(duì)豹紋鰓棘鱸的分子分類(lèi)、仔魚(yú)的行為、生態(tài)學(xué)、胚胎發(fā)育[1-4]、基礎(chǔ)代謝[5]，病害防治[6]等進(jìn)行了詳細(xì)而深入的研究。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)?；s化發(fā)展，豹紋鰓棘鱸病害凸顯，有關(guān)豹紋鰓棘鱸疾病診斷與防治的研究鮮有報(bào)道，生產(chǎn)上亟需簡(jiǎn)便、快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)病害的方法。

Loop-mediated isothermal amplification，LAMP是2000年由Notomi等[7]發(fā)明的一種新型的體外等溫?cái)U(kuò)增特異核酸片斷的技術(shù)。LAMP是利用靶序列上6個(gè)關(guān)聯(lián)區(qū)域設(shè)計(jì)的兩對(duì)特異引物和1種高活性鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在60 ℃~65 ℃等溫條件下，30 min~60 min完成核酸擴(kuò)增，通過(guò)鈣黃綠素等顏色反應(yīng)即時(shí)觀察檢測(cè)結(jié)果。LAMP技術(shù)的關(guān)鍵在于引物靶標(biāo)基因的選擇與引物的篩選。靶標(biāo)基因要在種內(nèi)不同菌株間高度保守，在種間變異性較高，一般選取靶基因約130~200 bp的保守序列。同時(shí)要注重引物之間的距離、引物退火溫度值的高低、引物長(zhǎng)度和GC/AT含量等綜合因素。2002年，Nagamine等[8]將Loop引物加入到反應(yīng)中間產(chǎn)物環(huán)狀物F1、F2（或者B1c、B2c）之間的區(qū)域上，減少反應(yīng)時(shí)間。2012年，Tanner等[9]同時(shí)進(jìn)行多個(gè)靶基因的多重LAMP檢測(cè)。自Notomi等[7]發(fā)明LAMP技術(shù)以來(lái)，在水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)病原的快速檢測(cè)中被廣泛研究與應(yīng)用[10-13]。早期診斷對(duì)于水生動(dòng)物疾病的預(yù)防具有重要作用，已有傳統(tǒng)的檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，做不到及時(shí)快速，LAMP 法因其簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異，在水生動(dòng)物疾病檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病中，針對(duì)諾卡氏菌[14]、無(wú)乳鏈球菌[15]，鯊魚(yú)弧菌[16]等建立的LAMP，均證實(shí)LAMP是一種簡(jiǎn)單快速的診斷方法。

美人魚(yú)發(fā)光桿菌（）包括美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種（subsp）和美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種。本研究在工廠化養(yǎng)殖的豹紋鰓棘鱸中首次分離到美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種（subsp），經(jīng)攻毒試驗(yàn)驗(yàn)證了該菌具有致病性。目前對(duì)于魚(yú)類(lèi)美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種的檢測(cè)，主要采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定、血清學(xué)反應(yīng)和PCR檢測(cè)技術(shù)等[17,18]，前者費(fèi)時(shí)且缺乏準(zhǔn)確性，后者的應(yīng)用大大提高了微生物的檢測(cè)準(zhǔn)確性，但需要昂貴的儀器及相關(guān)技術(shù)人員進(jìn)行操作，在生產(chǎn)實(shí)踐中尚未被廣泛應(yīng)用。養(yǎng)殖生產(chǎn)中急需一種能夠應(yīng)用于養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)的、操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確的美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種檢測(cè)產(chǎn)品。LAMP技術(shù)利用鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下無(wú)需變性即可完成目標(biāo)病原基因的擴(kuò)增，在合成新鏈的同時(shí)置換出原鏈，為下一輪擴(kuò)增制備模板，基于該原理的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病原檢測(cè)，與常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)相比該技術(shù)因其對(duì)設(shè)備的要求低、檢測(cè)時(shí)間短、結(jié)果判斷簡(jiǎn)便等在現(xiàn)場(chǎng)操作中的優(yōu)勢(shì)突顯。本研究旨在建立美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種的LAMP檢測(cè)技術(shù)，為生產(chǎn)中該病的防治提供簡(jiǎn)便、快速的診斷方法。

1 材料方法

1.1 菌株

美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種標(biāo)準(zhǔn)株購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種、無(wú)乳鏈球菌(）、柱狀黃桿菌()、諾卡氏菌()、哈維氏弧菌()、嗜水氣單胞菌()、創(chuàng)傷弧菌()、愛(ài)德華氏菌()、維氏氣單胞菌()，鰻利斯頓氏菌()參考株為天津市水產(chǎn)研究所保藏。

1.2 主要試劑

DNA ploymerase large fragment購(gòu)自New England Biolab公司，DL2000 DNA Marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，鈣黃綠素購(gòu)自Sigma公司，F(xiàn)TA卡購(gòu)自GE公司。

1.3 LAMP引物設(shè)計(jì)合成

采用BLAST軟件分析美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種基因序列，根據(jù)LAMP技術(shù)引物設(shè)計(jì)原則篩選出美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種subsp.（AJ535849.1）基因的核酸序列，針對(duì)該片段設(shè)計(jì)LAMP引物，引物序列見(jiàn)表1。

表 1 美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種IGS2基因LAMP檢測(cè)的引物序列

1.4 LAMP反應(yīng)建立及條件優(yōu)化

1.4.1 LAMP反應(yīng)的建立方法參照Notomi等[7]，LAMP反應(yīng)體系25 μL：包括10 mmol/L dNTP 1.5 μL 、10 x Thermo Polbuffer 2.5 μL、模板1 μL、5 μmol/L內(nèi)引物各1 μL、40 μmol/L外引物各1 μL、8UDNA polymerase 1 μL、鈣黃綠素1 μL、ddH2O 14 μL，反映體系于60 ℃孵育40 min，85 ℃終止反應(yīng)10 min。搖勻反應(yīng)產(chǎn)物可肉眼判讀結(jié)果，本研究采用1.5%凝膠電泳分析結(jié)果。

1.4.2 條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)優(yōu)化美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種LAMP技術(shù)擴(kuò)增條件，包括反應(yīng)時(shí)間（20、30、40、50、60 min）、反應(yīng)溫度（53、56、59、62、65 ℃）、內(nèi)外引物濃度（0.4, 0.05；0.8, 0.1；1.2L, 0.15；1.6, 0.2 μmol/L），反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，根據(jù)電泳條帶，篩選出最佳反應(yīng)條件。

1.4.3 引物特異性檢測(cè)根據(jù)1.4.1建立的LAMP檢測(cè)方法分別對(duì)美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種、無(wú)乳鏈球菌、柱狀黃桿菌、諾卡氏菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、創(chuàng)傷弧菌、愛(ài)德華氏菌、維氏氣單胞菌、鰻利斯頓氏菌進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)電泳結(jié)果篩選出特異性較好的引物。

1.4.4 引物靈敏度驗(yàn)證將28 ℃過(guò)夜培養(yǎng)的菌液濃度調(diào)整至2.6×108cfu/mL，經(jīng)10倍梯度稀釋分別作模板，按照1.4.1進(jìn)行LAMP檢測(cè)靈敏度。同時(shí)取濃度2.6×108cfu/mL美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種培養(yǎng)液1.0 mL，按文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行梯度稀釋、傾注培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，驗(yàn)證引物靈敏度的準(zhǔn)確性。

1.5 美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種LAMP技術(shù)在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的應(yīng)用

對(duì)保存的攜帶美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種病原的豹紋鰓棘鱸病樣進(jìn)行LAMP檢測(cè)，健康的豹紋鰓棘鱸作陰性對(duì)照。取豹紋鰓棘鱸的肝臟約0.1 g，置于采樣管內(nèi)研磨至漿狀。吸取漿狀的樣品將FTA膜片充分潤(rùn)濕，靜置5 min，吸取快速干燥液滴于FTA膜片上，將FTA膜片室溫靜置5 min后轉(zhuǎn)移至漂洗管內(nèi)，將漂洗管震蕩3 min，再將漂洗管內(nèi)的FTA膜片轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增檢測(cè)管內(nèi)，同步取美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種標(biāo)準(zhǔn)株制成膜片，做陽(yáng)性對(duì)照。反應(yīng)體系于65 ℃孵育40 min，85 ℃終止反應(yīng)10 min。同時(shí)取樣品魚(yú)肝臟組織接種，進(jìn)行細(xì)菌分離、培養(yǎng)鑒定，用傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測(cè)方法驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP檢測(cè)方法的建立

本研究建立了美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種LAMP檢測(cè)技術(shù)（圖1），該技術(shù)檢測(cè)結(jié)果通過(guò)鈣黃綠素顯色肉眼可判讀，對(duì)該技術(shù)的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，就本研究擬定的反應(yīng)體系而言，反應(yīng)溫度60 ℃時(shí)效果最佳（圖2）。反應(yīng)時(shí)間40 min（圖3）減少非特異性反應(yīng)，內(nèi)外引物濃度0.8 μmol/L，0.1 μmol/L（圖4）為最佳。

圖 1 美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種LAMP檢測(cè)結(jié)果

注: M: 分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: 美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種; 2: 陰性對(duì)照

Note: M: Molecular weight standard; 1:subsp.; 2:Negative control

圖 2 溫度對(duì)美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種LAMP擴(kuò)增的影響

注: M:分子量標(biāo)準(zhǔn); 1:53 ℃; 2:56 ℃; 3:59 ℃; 4:62 ℃; 5:65 ℃

Note: M: Molecular weight standard; 1:53 ℃; 2:56 ℃; 3:59 ℃; 4:62 ℃; 5:65 ℃

圖 3 時(shí)間對(duì)美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種LAMP擴(kuò)增的影響

注: M:分子量標(biāo)準(zhǔn); 1:20 min; 2:30 min; 3:40 min; 4:50 min; 5:60 min

Note: M: Molecular weight standard; 1:20 min; 2:30 min; 3:40 min; 4:50 min; 5:60 min

圖 4 內(nèi)外引物濃度對(duì)美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種LAMP的影響

注：M:分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: 0.4 μmol/L, 0.05 μmol/L; 2: 0.8 μmol/L, 0.1 μmol/L; 3: 1.2 μmol/L, 0.15 μmol/L; 4: 1.6 μmol/L, 0.2 μmol/L

Note: M:Molecular weight standard;1: 0.4 μmol/L,0.05 μmol/L; 2: 0.8 μmol/L,0.1 μmol/L; 3: 1.2 μmol/L,0.15 μmol/L; 4: 1.6 μmol/L,0.2 μmol/L

2.2 引物特異性檢測(cè)

按照1.4.1建立的擴(kuò)增方法，對(duì)海豚鏈球菌、柱狀黃桿菌、哈維氏弧菌、維氏氣單胞菌、諾卡氏菌、美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種擴(kuò)增，除美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種外其他病原菌均呈陰性反應(yīng)（圖5）。

2.3 引物靈敏度檢測(cè)

菌液濃度從2.6×108cfu/mL稀釋至2.6×101cfu/mL，2.6×101cfu/mL濃度為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增無(wú)產(chǎn)物。計(jì)數(shù)結(jié)果表明：1×106倍稀釋的細(xì)菌培養(yǎng)液的菌濃度為2.6×102cfu/mL，即美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種LAMP檢測(cè)技術(shù)的靈敏度為2.6×102cfu/mL（圖6）。

圖 5 美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種 LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果

注: M: 分子量標(biāo)準(zhǔn); 1-8分別為美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種標(biāo)準(zhǔn)菌株、美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種、陰性對(duì)照、海豚鏈球菌、柱狀黃桿菌、維氏氣單胞菌、哈維氏弧菌、諾卡氏菌

Note:M: Molecular weight standard; 1-8 such assubsp.standard strain，subsp.Negative control，，

圖 6 美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種LAMP靈敏度的檢測(cè)結(jié)果

注: M: 分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: 2.6×101cfu/mL; 2: 2.6×102cfu/mL; 3: 2.6×103cfu/mL; 4: 2.6×104cfu/mL; 5: 2.6×105cfu/mL; 6: 2.6× 106cfu/mL; 7: 2.6×107cfu/mL; 8: 2.6×108cfu/mL

Note: M: Moelcular weight standard; 1: 2.6×101cfu/mL; 2: 2.6×102cfu/mL; 3: 2.6×103cfu/mL; 4: 2.6×104cfu/mL; 5: 2.6×105cfu/mL; 6: 2.6× 106cfu/mL; 7: 2.6×107cfu/mL; 8: 2.6×108cfu/mL

2.4 美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種LAMP檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確性驗(yàn)證

對(duì)取自美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種攻毒的豹紋鰓棘鱸的肝臟組織進(jìn)行LAMP技術(shù)檢測(cè)應(yīng)用，結(jié)果表明：該技術(shù)檢測(cè)結(jié)果與同步取樣進(jìn)行的細(xì)菌分離鑒定結(jié)果一致（圖7），驗(yàn)證該技術(shù)的準(zhǔn)確性，該技術(shù)比普通PCR靈敏度高10倍~100倍，可以在病害流行之前檢測(cè)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)攜帶病原菌的情況，有利于及時(shí)采取有效防控措施，做到早發(fā)現(xiàn)早治療，減少經(jīng)濟(jì)損失。

圖 7 采用FTA卡提取豹紋鰓棘鱸肝組織中美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種DNA進(jìn)行LAMP檢測(cè)

注：M:分子量標(biāo)準(zhǔn); 1:陰性對(duì)照; 2: 陽(yáng)性對(duì)照(帶有美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種的FTA卡做模板); 3: FTA卡提取病魚(yú)肝組織中美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種做模板

Note: M: molecular weight standard; 1: Negative control; 2: positive control（FTA card withsubsp.）; 3: FTA card with liver of thesubsp.disease fish

3 討論

美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種為一種具溶血性的革蘭氏陰性短桿狀或球桿菌，有莢膜，感染宿主無(wú)特異性，對(duì)多種養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)均有致病性。1963年，美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種被報(bào)道，曾命名為巴斯德氏菌（）[20]、殺魚(yú)巴斯德氏菌（）[21]，Nicolas等基于rRNA研究又將殺魚(yú)巴斯德氏菌劃分為美人魚(yú)弧菌，后經(jīng)Ruimy等[22-25]多位科學(xué)家先后研究將其命名為美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種（subsp）。后Truper將“”修正為“”，即subsp。美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種對(duì)多種養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)均有高致病性，最早在美洲狼鱸（）和條紋狼鱸（）[20]野生種群中分離到，命名為殺魚(yú)巴斯德氏菌（），后陸續(xù)在黃尾鰤（）[26]、黑鯛（）[27]、雜交條紋鱸（）[28]等發(fā)病，在國(guó)內(nèi)，已從發(fā)病的半滑舌鰨（）[29]、龍膽石斑魚(yú)(）[30]、大黃魚(yú)[17]等分離到該菌，是養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的重要致病菌之一，一旦發(fā)病，可造成較高的死亡率。為了更好地用于養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)疾病的快速檢測(cè)，亟需美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種的快速檢測(cè)技術(shù)。

LAMP技術(shù)是2000年Notomi等[7]建立的等溫鏈置換擴(kuò)增核酸的方法，近年來(lái)被廣泛研究、應(yīng)用于各領(lǐng)域。該技術(shù)具有檢測(cè)速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)物檢測(cè)簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。目前尚未有關(guān)于美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種LAMP檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道。

找到美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種的特異性基因片段是LAMP技術(shù)成功與否的關(guān)鍵。細(xì)菌rDNA基因的5'端到3'端分別是16S rDNA、間區(qū)、23S rDNA、間區(qū)和5S rDNA。沒(méi)有特定功能的16S-23S rDNA間區(qū)(intergenic spaser)進(jìn)化速率比16S rDNA大10倍之多。隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，所有細(xì)菌的序列被越來(lái)越多地發(fā)掘出來(lái)，因此序列在細(xì)菌鑒定方面倍受關(guān)注。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增序列鑒別細(xì)菌不同種之間，甚至同一種內(nèi)的差異[34-34]成為可能。在小麥葉銹菌中存在多態(tài)性[35]，付華娥等利用細(xì)菌通用引物對(duì)細(xì)菌的16S-23SrDNA間區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序，BLAST比對(duì)結(jié)果為嗜水氣單胞菌[36]。因此，本研究利用美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種的序列設(shè)計(jì)了LAMP檢測(cè)引物，并建立了該病原菌鑒定的方法。特異性檢測(cè)結(jié)果顯示：僅美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種擴(kuò)增出特異性片段，而其他的致病菌株擴(kuò)增不出該片段，證明基因作為美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種鑒定依據(jù)的可行性。

本研究針對(duì)美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種LAMP技術(shù)反應(yīng)溫度、內(nèi)外引物濃度及反應(yīng)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳檢測(cè)條件，進(jìn)而建立了較穩(wěn)定且特異性較好的美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種LAMP檢測(cè)體系。溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)顯示60 ℃電泳條帶最清晰，而且溫度高可以增加引物的特異性，故反應(yīng)溫度確定為60 ℃。反應(yīng)時(shí)間在20 min和30 min無(wú)電泳條帶，40 min時(shí)電泳條帶清晰，50 min和60 min電泳條帶并未明顯增加亮度，LAMP技術(shù)反應(yīng)時(shí)間越短，可以避免非特異性擴(kuò)增條帶的產(chǎn)生，因此檢測(cè)時(shí)間定為40 min。內(nèi)外引物濃度參照[7]采用內(nèi)引物、外引物8:1的比例，在內(nèi)外引物濃度比例不變情況下，以不同引物濃度梯度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。根據(jù)反應(yīng)結(jié)果將反應(yīng)內(nèi)外引物濃度為0.8 μmol/L，0.1 μmol/L時(shí)可以看到清晰的條帶，為提高引物的特異性，選擇該濃度作為反應(yīng)引物濃度。本研究以鈣黃綠素做為染料加入反應(yīng)體系[37]，自反應(yīng)開(kāi)始至結(jié)果判讀無(wú)需再打開(kāi)反應(yīng)管，避免了因開(kāi)蓋形成氣溶膠而導(dǎo)致的假陽(yáng)性?，F(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用采用FTA卡，F(xiàn)TA卡可以快速提取核酸，只需將樣品組織涂在FTA卡上，再進(jìn)行簡(jiǎn)單操作即可，大大縮短了樣品的處理時(shí)間，進(jìn)而保證從樣本處理到結(jié)果判讀僅需1 h。綜上，本研究建立的豹紋鰓棘鱸美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種的快速檢測(cè)技術(shù)，具有高效快速、判讀簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，普通養(yǎng)殖人員經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單培訓(xùn)可完成操作，因此該技術(shù)在野外現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面具有很好的應(yīng)用前景。

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Establishment of the Rapid Detection Method by Loop-Mediated Isothermal Amplification forsubspand Its Application

YAO Xue-liang, CAI Yan, XU Xiao-li, ZHONG Wen-hui, BAO Hai-yan*

300221,

A Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay was developed and validated for the specific detection of Photobacterium damselae subsp. piscicida of Plectropomus leopardus Lacépède. The IGS2 gene of P. damselae subsp. piscicida was amplified by a set of two pairs specially primers that recognize six distinct sequences of the target.The amplification can be amplified in 40 min by incubating all of the reagents in a single tube with Bst DNA polymerase in a constant temperature of 65 ℃.The resulting amplicons are visualized by adding calcein to the reaction tube. FTA cards was for collection and purification of nucleic acids from a liver with pathogenic bacteria in field applications.The sensitivity of LAMP with detection limits of 2.6×102 cfu/mL. Our results clearly demonstrate that the LAMP-based assay is a sensitive and reliable means for the detection of P. damselae subsp. piscicida,which show that the LAMP assay is suitable for on-site rapid diagnosis.

Lacépède;subsp.gene; Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)

S941.42

A

1000-2324(2021)01-0007-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2021.01.002

2018-12-20

2019-01-14

天津市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(12ZCZDNC00900)

姚學(xué)良(1982-),女,碩士,高級(jí)工程師,主要從事水產(chǎn)動(dòng)物病害防治及技術(shù)研究與推廣工作. E-mail:tjyaoxueliang@126.com

Author for correspondence. E-mail:sscstgk@tj.gov.cn