葡萄酒泥中甘露聚糖堿提工藝優(yōu)化

黃倩，李潔，王斌，史學(xué)偉

石河子大學(xué)食品學(xué)院（石河子 832000）

酒泥是葡萄酒加工釀造過程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物之一，其主要成分酵母菌殘體中含有大量的有益物質(zhì)，如酵母細胞壁中的甘露聚糖[1]。甘露聚糖占酵母細胞壁的比重達40%[2]，具有較強免疫活性[3-5]，可以抵御由沙雷氏菌引起的細菌性疾病[6]；從不同水平上調(diào)節(jié)體內(nèi)細胞免疫反應(yīng)[7]；對抵抗輻射[8]、癌癥、腫瘤具有著重要的作用[9-10]；它還是一種既經(jīng)濟又高效的純天然無公害的防腐劑和保鮮劑，能夠有效地防止新鮮水果以及海產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)，可以增強保鮮物品的風(fēng)味，提升其食用品質(zhì)，在食品保鮮領(lǐng)域具有重大應(yīng)用前景[11-12]。

綜上可知，提高甘露聚糖的提取率，為大規(guī)模生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)，同時有效地利用葡萄酒加工副產(chǎn)物——酒泥，減輕葡萄酒泥對環(huán)境的污染，使資源得到合理的配制，有著重要的現(xiàn)實意義和良好的應(yīng)用前景。目前甘露聚糖提取的方法主要有酸式浸提法、堿式浸提法、酶法浸提和熱水浸提等[13-14]；其中，酸法提取原理簡單，操作便捷，但對甘露聚糖的結(jié)構(gòu)破壞較大。酶法浸提專一性較高，但價格昂貴，且提取物富含蛋白質(zhì)等雜質(zhì)[15]。熱水浸提法操作簡單，對環(huán)境污染小，但因其要達到的溫度較高，高溫設(shè)備昂貴，不適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。而比較幾種提取方法發(fā)現(xiàn)堿性提取可有效地保證甘露聚糖的結(jié)構(gòu)，且操作簡單，儀器簡便，故優(yōu)化此法。而朱紅蕾等[16]、楊學(xué)山等[17]的高濃度堿法提取，甘露聚糖的提取率較低，此次試驗希望能夠降低堿液使用的同時也能提高甘露聚糖的提取率，為促進葡萄酒泥酵母資源化開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

葡萄酒泥（新疆張裕天珠葡萄酒業(yè)有限公司）；CH3CH2OH、NaCl（分析純，天津湘昊化工有限公司）；CH3COONa（分析純，淄博藍昊化工有限公司）；NaOH（分析純，滄州劉氏化工有限公司）；CCl3COOH（分析純，南京幫諾生物科技有限公司）；CH3COOH（分析純，湖北興銀河精細化工有限公司）；CH3COCH3（分析純，東莞市宏川化工有限公司）；H2SO4（分析純，淄博建龍化工有限公司）；H3BO3（分析純，鄭州優(yōu)然化工有限公司）。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

電子天平（JCS001型，天衡儀器制造廠）；分析天平（JJ223BC型，雙杰測試儀器廠）；離心機（Model型，上海創(chuàng)萌生物科技有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-W420型，金壇市醫(yī)療器械廠）；pH計（SIN-PH4.0型，上海雷磁儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄酒泥預(yù)處理[9]

將從葡萄酒廠中帶回來的廢棄葡萄酒泥密封好，并放入4 ℃的冰箱中冷藏，以防止微生物對酒泥造成污染而使酒泥變質(zhì)。將酒泥從冰箱中取出，取足量酒泥，用蒸餾水以料液比1∶1（g/mL）混合，用孔徑0.180 mm篩篩分后以4 000 r/min離心10 min，取沉淀，重復(fù)上述步驟多次，直至酵母菌體顏色淡化至白色為止，于4 ℃保存待用。

1.2.2 酵母菌體誘導(dǎo)自溶

將從上述步驟中獲得的濕酵母取出，取一定量的酵母細胞，以料液比1∶3（g/mL）添加蒸餾水，攪拌多次后制成酵母細胞懸浮液。在該懸浮液中加入適量2% NaCl溶液以及pH 4.5醋酸-醋酸鈉緩沖溶液。將所配制的酵母細胞懸浮液在45 ℃的水浴鍋中誘導(dǎo)自溶30 h。溫度降至常溫后以4 000 r/min離心20 min，取沉淀，備用。

1.2.3 提取甘露聚糖

取3 g酵母細胞壁，在料液比1∶15（g/mL）、NaOH質(zhì)量分數(shù)3%、溫度90 ℃的條件下提取1.5 h，將提取物冷卻到室溫后，以4 000 r/min離心15 min，沉淀保留上清液；添加9%三氯乙酸，至pH降到3后放于4 ℃冰箱中靜置12 h。以4 000 r/min離心10 min除去其中的蛋白質(zhì)[18]，保留上清液，將上清液倒入錐形瓶中，添加2倍體積的無水乙醇，靜置12 h，取沉淀物，將從上述步驟中得到的沉淀物用丙酮浸濕，緩慢地洗滌2次，每次10 min，最后再在溫度50 ℃條件下干燥沉淀物，得到甘露聚糖。

1.2.4 單因素試驗

1) 料液比對甘露聚糖提取率的影響：取3 g酵母細胞壁，在NaOH質(zhì)量分數(shù)3%的條件下，于90 ℃下提取1.5 h，考察不同料液比（1∶10.0，1∶12.5，1∶15.0，1∶17.5和1∶20.0 g/mL）對甘露聚糖提取率的影響。

2) NaOH質(zhì)量分數(shù)料液比對甘露聚糖提取率的影響：考察不同NaOH質(zhì)量分數(shù)（1%，2%，3%，4%，和5%）對甘露聚糖的影響，料液比為1∶15.0（g/mL），其他同1.2.4（1）。

3) 浸提時間對甘露聚糖提取率的影響：考察不同提取時間（0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h）對甘露聚糖的影響，NaOH質(zhì)量分數(shù)為2%，其他同1.2.4（2）。

4) 浸提溫度對甘露聚糖提取率的影響：考察不同提取溫度（70，80，90，100和110 ℃）對甘露聚糖的影響，提取時間為1.5 h，其他同1.2.4（3）。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定葡萄酒泥酵母甘露聚糖提取的試驗因素和水平，利用Design-Expert. V 10.0.4軟件對甘露聚糖提取進行試驗方案的設(shè)計和數(shù)據(jù)結(jié)果的分析。

1.2.6 甘露聚糖含量的測定

根據(jù)紫外分光光度法，參考文獻[19]進行修改。

1) 繪制標準曲線：分別稱取250，500，750，1 000，1 250，1 500，1 750和2 000 μg甘露聚糖，配制成溶液后再分別稀釋為25，50，75，100，125，150，175和200 μg/mL系列溶液，將標準液分為2份（A和B），A中加入0.2 mL甘露聚糖溶液、4.5 mL 90%濃硫酸，B中加入0.2 mL甘露聚糖溶液、4.5 mL 90%濃硫酸與0.2 mL 0.1 mol/L NaCl-H3BO3溶液，在70 ℃水浴鍋中水浴25 min，在280 nm波長處測量溶液吸光度，測得的吸光度分別為A1和A2，計算其差值A(chǔ)（A1-A2），可得到甘露聚糖含量與A的相關(guān)關(guān)系。

2) 樣品處理：稱取20 mg標準的甘露聚糖樣品，添加3.5 mL 72%濃硫酸，室溫靜置4 h，然后加蒸餾水使硫酸的濃度為5 mol/L左右，在90 ℃水浴鍋中添加酸，水解3 h；冷卻至常溫后用堿液調(diào)節(jié)pH至中性，最后再添加一定量的0.2 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液定容至100 mL，以備后續(xù)試驗操作。

3) 甘露糖樣品質(zhì)量濃度測定：取0.2 mL制得的樣液，其他同1.2.6（1）來測定該樣液的吸光度，并求出A值，再根據(jù)圖1求出甘露聚糖標準曲線方程Y=0.001 4X+0.002 3（R2=0.999 1），以求出甘露聚糖的質(zhì)量濃度。

圖1 甘露聚糖的標準曲線

1.2.7 甘露聚糖提取率

甘露聚糖提取率按式（1）計算。

式中：R為甘露聚糖提取率，%；m1為甘露聚糖的質(zhì)量，mg；m2為酵母細胞壁干質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果分析

2.1.1 料液比與甘露聚糖提取率的關(guān)系

由圖2可知，當(dāng)料液比為1∶10.0，1∶12.5和1∶15（g/mL）時，甘露聚糖的提取率與溶劑用量呈正相關(guān)，提取率隨著溶劑的增多而不斷升高。其原因是堿提取液作用不充分，因而溶劑越多，提取率越高。當(dāng)料液比為1∶15（g/mL）時提取率達到最大值。當(dāng)料液比為1∶15.0，1∶17.5，1∶20.0（g/mL）時，甘露聚糖提取率與溶劑用量呈負相關(guān)，當(dāng)溶劑使用量增加時，溫度上升、時間延長，增加了甘露聚糖后續(xù)提取的難度，同時引起提取物的損失[20]，使得甘露聚糖提取率降低。綜上所述，甘露聚糖最佳的提取料液比為1∶15.0（g/mL）。

圖2 料液比與甘露聚糖提取率的關(guān)系

2.1.2 NaOH質(zhì)量分數(shù)與甘露聚糖提取率的關(guān)系

由圖3可知，當(dāng)NaOH質(zhì)量分數(shù)為1%～2%時，甘露聚糖提取率與NaOH呈正相關(guān)，這是因為低質(zhì)量分數(shù)的NaOH有利于甘露聚糖不斷地從溶劑中溶出來，加速了甘露聚糖的提取過程，所以在這濃度范圍內(nèi)提取率不斷上升。當(dāng)NaOH質(zhì)量分數(shù)為2%～5%時，甘露聚糖提取率與堿的質(zhì)量分數(shù)呈負相關(guān)。原因是酵母細胞壁對酸堿性變化較敏感，高pH會促使甘露聚糖的提取，而甘露聚糖的結(jié)構(gòu)易被高濃度NaOH破壞，導(dǎo)致其降解，而且濃度越大對甘露聚糖的降解越厲害，損失的甘露聚糖也就越多，從而導(dǎo)致提取率降低[18]。綜上所述，選擇2%的NaOH作為最佳的提取堿液的濃度。

2.1.3 浸提時間與甘露聚糖提取率的關(guān)系

由圖4可知，當(dāng)浸提時間為0.5～1.5 h時，甘露聚糖提取率與浸提時間呈正相關(guān)。其原因是堿的水解作用需要一個過程，同時也需要一定的時間，因而使得提取也不充分，但此時產(chǎn)生的效果卻是比較明顯的。因此短時間內(nèi)甘露聚糖提取率呈現(xiàn)上升的趨勢。當(dāng)浸提時間為1.5～2.5 h時，時間過長，使得堿液發(fā)揮的水解作用過度，導(dǎo)致甘露聚糖的結(jié)構(gòu)被嚴重破壞，最終使提取率快速下降。綜上所述，選擇1.5 h作為提取酒泥中廢酵母甘露聚糖的最佳提取時間。

2.1.4 浸提溫度與甘露聚糖提取率的關(guān)系

由圖5可知，當(dāng)溫度為70～90 ℃時，甘露聚糖的提取率與浸提溫度呈正相關(guān)，說明溫度還沒有達到浸提最適溫度，在較低水平會促進提取效率，且在低溫度范圍內(nèi)提取率隨溫度變化而變化。當(dāng)溫度為90～110℃時，甘露聚糖的提取率與浸提溫度呈負相關(guān)，浸提溫度越高，甘露聚糖提取率越低，甘露聚糖結(jié)構(gòu)在高溫下易被破壞，故高溫使提取率呈現(xiàn)下降趨勢。綜上所述，選擇90 ℃作為提取酒泥中廢酵母甘露聚糖的最佳提取溫度。

圖3 NaOH質(zhì)量分數(shù)與甘露聚糖提取率的關(guān)系

圖4 浸提時間與甘露聚糖提取率的關(guān)系

圖5 浸提溫度與甘露聚糖提取率的關(guān)系

2.2 優(yōu)化工藝條件

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以甘露聚糖的最終提取率為考察指標，以料液比、NaOH質(zhì)量分數(shù)、浸提時間和浸提溫度作為考察因素，利用Design-Expert. V 10.0.4軟件對甘露聚糖提取進行試驗方案的設(shè)計和數(shù)據(jù)結(jié)果的分析，結(jié)果見表1～表3。

用Design-Expert. V 10.0.4軟件對表3的試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，甘露聚糖提取率的回歸方程為：Y=12.75-3.89A-0.95B-0.91C+1.76D+0.44AB+2.91AC-1.57AD-0.75BC-0.82CD-0.28A2+0.30B2-1.62C2-1.48D2。利用Design-Expert. V 10.0.4軟件對甘露聚糖提取進行數(shù)據(jù)結(jié)果的分析，結(jié)果見圖6～圖9。

從表3可以看出，模型極為顯著，R2=99.00%，說明模型擬合程度良好。觀察圖7和圖9可以發(fā)現(xiàn)，料液比和甘露聚糖提取率的影響作用明顯，且具有規(guī)律可循，與表3所得顯著性符合，甘露聚糖提取率隨著料液比的變化而明顯變化，且隨著料液比的增加，NaOH使用量降低，甘露聚糖提取率隨之提高。同時通過對比可以看出料液比與NaOH質(zhì)量分數(shù)之間關(guān)聯(lián)性較其他弱些。浸提時間與浸提溫度之間相關(guān)性不強，且對甘露聚糖提取率影響不如料液比明顯，故料液比對甘露聚糖的提取率有重要影響，其次是提取溫度。

表1 響應(yīng)面因素水平

表2 響應(yīng)面結(jié)果

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

由等高線、方程等得到最優(yōu)試驗條件，并進行驗證試驗。在料液比1∶12.5（g/mL）、NaOH質(zhì)量分數(shù)3%、浸提時間1 h、浸提溫度100 ℃的條件下對甘露聚糖進行浸提，經(jīng)過3次平行試驗，結(jié)果顯示平均提取率達到21.97%。這個數(shù)值沒有達到模擬的最大值（22.543%），說明試驗中存在誤差，屬于正?，F(xiàn)象。響應(yīng)面所得最優(yōu)組合與實際操作值所得到的結(jié)論相似，這進一步驗證響應(yīng)面模型擬合程度良好。

圖6 堿法甘露聚糖提取率3D圖

圖7 甘露聚糖提取率料液比與提取時間等高線

圖8 甘露聚糖提取率提取時間與提取溫度等高線

圖9 甘露聚糖提取率料液比與提取溫度等高線

3 結(jié)論與討論

此次試驗以廢棄的葡萄酒泥為原料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過方差分析，確立了最優(yōu)提取工藝參數(shù)，并確保了提取甘露聚糖最優(yōu)工藝參數(shù)的穩(wěn)妥性和可靠性。在料液比1∶12.5（g/mL）、NaOH質(zhì)量分數(shù)3%、浸提時間1 h、浸提溫度100 ℃的條件下對甘露聚糖進行浸提，甘露聚糖的平均提取率可達到21.97%。該試驗結(jié)果與朱紅蕾等[16]、楊學(xué)山等[17]的高濃度堿法提取相比，減少了堿液用量，減輕了對環(huán)境造成的污染，通過此試驗提高了甘露聚糖的提取率，為工業(yè)上從葡萄酒酒泥中提取甘露聚糖提供了一定的理論基礎(chǔ)。但是將其應(yīng)用到工業(yè)提取甘露聚糖，達到酒泥廢物再利用的目的還需要繼續(xù)研究，確保設(shè)備的運行及甘露聚糖的純化。