三種方法誘導熊本牡蠣三倍體的比較研究

李玲蔚 李海昆 于瑞海 馬培振 張 哲 王永旺

(中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室, 青島 266003)

熊本牡蠣(Crassostrea sikamea)屬于巨牡蠣屬(Crassostrea), 在中國、日本和韓國的沿海均有分布[1—3], 其獨特的口味深受消費者的喜愛,被美國引進并成功地開展了生產養(yǎng)殖[4—6]。我國熊本牡蠣的野生群體主要分布于江蘇以南的海區(qū), 是我國自然分布的幾種巨牡蠣屬牡蠣之一, 但因個體小、產量低, 未被開發(fā)利用[5,7,8]。美國的熊本牡蠣大小適中,出肉率較高, 肉質細膩具甜味, 在美國頗受消費者的青睞, 價格是長牡蠣的1倍以上,也是我國酒店進口高檔牡蠣的主要品種之一。目前國內養(yǎng)殖戶迫切需要大量熊本牡蠣滿足日益增長的客戶需求, 因此, 熊本牡蠣在我國具有較大的開發(fā)潛力。同時,開發(fā)熊本牡蠣作為我國一個新的養(yǎng)殖品種對解決我國牡蠣養(yǎng)殖業(yè)面臨的養(yǎng)殖品種單一, 種質退化等問題具有重要意義[8]。目前, 熊本牡蠣已經在國內已經開展了人工繁育[5—9]、單體培育[8]、多倍體育種[10]、性狀選擇育種[11,12]和雜交育種[13,14]等方面的研究, 取得了一定的成效。

熊本牡蠣雖然品質好、殼形規(guī)則, 但殼厚、生長緩慢、產量低[5]。貝類的三倍體因不育性往往比二倍體生長快[15,16], 熊本牡蠣的三倍體育種有望改善其生長慢的劣勢, 提高生長速度。武祥偉等[10]報道了用CB誘導熊本牡蠣三倍體的研究, CB誘導的效率較高, 但是其成本較高且毒性大。6-DMAP及鹽度誘導也是常見的牡蠣三倍體的誘導方法, 與CB相比這2種方法在經濟性、安全性上具有一定的優(yōu)勢, 但誘導效率稍低。本次研究探討了6-DMAP、低鹽和高鹽3種方式對熊本牡蠣的誘導效果, 以期獲得更加環(huán)保、經濟、無毒害的誘導方案,為獲得四倍體熊本牡蠣進而開展三倍體熊本牡蠣的規(guī)?；N提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 親貝暫養(yǎng)

本次實驗所用的熊本牡蠣來自美國俄勒岡州,挑選貝殼完整、活力良好親貝, 將其表面附著物洗刷干凈后, 運至山東省煙臺萊州市長漁水產有限公司室內育苗車間暫養(yǎng)。暫養(yǎng)期間水溫26—27℃, 鹽度28—30。每天換水2次, 采用吸底的方式換水?；旌贤段骨虻缺藿鹪?Isochrysis galbana)和新月菱形藻(Nitzschia closterium), 根據具體的攝食和水體中殘餌情況調整投餌量。

1.2 解剖受精

采用解剖的方式獲得精卵, 獲得的卵液先經60 μm的尼龍篩絹過濾除去大組織塊, 之后用25 μm的尼龍篩絹洗卵3次, 最后將卵液濃縮至一定的體積, 便于確定誘導濃度(鹽度)。置于過濾海水中浸泡促熟, 促熟時間30—60min。精液經25 μm的篩絹過濾, 稀釋后直接使用。下列每個實驗均重復3次。

1.3 6-DMAP誘導

誘導濃度實驗參考秦艷平等[17]報道的香港牡蠣三倍體誘導的最佳誘導時機, 誘導時機設為受精后15min, 分別將受精卵置于55、60、65、70、75和80 mg/L 的6-DMAP 中持續(xù)誘導20min。

誘導時機實驗分別在受精后12min、15min、18min和21min四個時刻, 用濃度實驗中最適宜濃度, 持續(xù)處理受精卵20min 。

誘導持續(xù)時間實驗采用濃度試驗和誘導時機試驗的最佳組合, 將受精卵分別持續(xù)誘導10min、15min、20min和25min。

1.4 鹽度誘導

高鹽海水用海鹽加海水母液配置獲得, 低鹽海水用經24h曝氣后的淡水與海水母液混合獲得, 配置不同鹽度海水時將濃縮后卵液的體積計算在內,確保最終的誘導鹽度。

誘導鹽度實驗參考秦艷平等[17]報道的香港牡蠣三倍體誘導的最佳誘導時機, 誘導時機設為受精后15min, 將受精卵分別在鹽度為35、40、45、50、55和60的高鹽海水及3、6、9、12、15和18的低鹽海水中持續(xù)誘導20min。

誘導時機實驗分別在受精后的12min、15min、18min和21min 四個時刻內分別用高鹽和低鹽實驗中的最適誘導鹽度持續(xù)誘導20min。

誘導持續(xù)時機實驗用誘導時機實驗中最適誘導時機, 將受精卵分別在高鹽和低鹽實驗中的最適誘導鹽度中持續(xù)誘導10min、15min、20min和25min。

1.5 幼蟲的培養(yǎng)

分別用1.3中獲得的6-DMAP、低鹽和高鹽最佳誘導組合誘導熊本牡蠣三倍體, 將不同三倍體誘導組的幼蟲繼續(xù)培育。培育期間, 水溫26—28℃,鹽度30; 每天投喂球等鞭金藻4次, 日投餌量6000—8000 cells/mL, 具體投餌量根據攝食和殘餌情況進行調整; 每天換水兩次, 每次換水1/2。

1.6 倍性檢測

將收集獲得的幼蟲置于PBS緩沖液(pH=7.4)中,用1 mL注射器抽打3—5次制成細胞懸液, 將細胞懸液用25 μm的篩絹過濾至75%的酒精中固定24h以上。上機檢測前用DAPI(2 μg/mL)將獲得的幼蟲細胞從酒精中置換出, 避光染色30min, 隨后用流式細胞儀(CytoFLEX, 美國)檢測三倍體率。

1.7 數據測量與處理

受精后24h收集D形幼蟲檢測三倍體率。幼蟲培育期間每隔3d測量幼蟲殼高和存活率; 各組分別在幼蟲培育的第5、第9、第13和第17天隨機取500—1000個幼蟲檢測三倍體率。卵裂率為受精4h后發(fā)生卵裂的受精卵占總受精卵的百分比, 孵化率為受精后24后D形幼蟲占卵裂的受精卵的百分比;三倍體率為組內所有幼蟲中三倍體幼蟲占的百分比; 誘導效率為孵化率與三倍體率乘積的百分數;幼蟲的平均存活率為所有的幼蟲在培育24d內的平均存活率; 幼蟲的生長率為所有幼蟲在培育24d內的平均生長速度。使用SPSS19.0進行數據分析, 采用單因素方差分析(One-way ANOVA), 并進行Duncan多重比較, 顯著性水平設為0.05。

2 結果

2.1 三種誘導方式在不同的誘導組合下卵裂率、孵化率、三倍體率比較

在6-DMAP誘導組中, 隨誘導濃度的增加, 卵裂率和孵化率持續(xù)下降, 而三倍體率先增大后減小;濃度為75 mg/L時誘導三倍體率最高為(58.0±3.67)%,對應的卵裂率和孵化率分別為(75.42±5.33)%和(73.26±3.15)%(圖1A)。在低鹽誘導組中隨鹽度的增加, 卵裂率和孵化率逐漸升高, 三倍體率先升高后降低; 在鹽度為6時, 三倍體率最高可達(42.25±2.63)%, 顯著高于其他各組(P＜0.05), 此時對應的卵裂率和孵化率分別為(76.51±7.22)%和(74.33±3.71)%(圖2B)。在高鹽誘導組中, 對照組與實驗組各組的卵裂率和孵化率差異較小, 實驗組內的三倍體率隨鹽度的增加先增大后減小; 在鹽度為55時, 三倍體率最高可達(60.03±3.03)%, 卵裂率和孵化率分別可達(80.26±3.78)%和(78.39±4.32)%(圖1C)。

在6-DMAP誘導組中, 隨著起始誘導時間的增大, 卵裂率和三倍體率先增大后減小; 起始誘導時間為受精后15min時, 誘導獲得三倍體率最高為(53.92±7.07)%, 顯著高于起始誘導時間為受精后12min和21min時的三倍體率(P＜0.05), 此時的卵裂率和孵化率分別可達(86.08±2.94)%和(76.13±5.12)%(圖2A)。在低鹽誘導組中, 隨起始誘導時間的增加, 三倍體率先增大后減小; 在起始誘導時間為15min時, 三倍體率最高達(40.89±3.13)%, 卵裂率和孵化率也相對較高, 分別可達(76.51±3.11)%和(75.17±4.01)%(圖2B)。在高鹽誘導組中, 隨起始誘導時間的增加, 三倍體率先增大后減小; 起始誘導時間為受精后15min時, 三倍體率最大可達(59.52±4.32)%, 卵裂率和孵化率分別可達(81.4±3.76)%和(78.1±3.59)%(圖2C)。

圖1 不同的誘導濃度(鹽度)下3種誘導方法對熊本牡蠣三倍體誘導效果Fig.1 Effects of three induction methods on triploid induction of C.sikamea at different induction concentrations (salinity)

圖2 不同的起始誘導時間下3種誘導方法對熊本牡蠣三倍體誘導效果Fig.2 Effects of three induction methods on triploid induction of C.sikamea at different initial induction times

在6-DMAP誘導組中, 隨誘導持續(xù)時間的增大,三倍體率先增大后減小, 卵裂率和孵化率逐漸降低。在誘導持續(xù)時間20min時, 三倍體率最高可達(51.77±5.42)%, 此時對應的卵裂率和孵化率分別為(79.04±4.77)%和(81.76±6.72)%(圖3A)。在低鹽誘導組中, 各組的三倍體率普遍較低, 三倍體率只有16.74%—37.98%; 隨誘導持續(xù)時間增加, 各組的卵裂率逐漸降低, 三倍體率先增加后減小, 但孵化率無明顯的變化; 在誘導持續(xù)時間為20min時, 三倍體率最高達(37.98±5.05)%, 此時卵裂率和孵化率分別為(77.40±5.52)%和(84.51±7.61)%(圖3B)。在高鹽誘導組中, 各組間三倍體率可達35.26%—56.48%;隨誘導持續(xù)時間的增大, 三倍體率先增大后減小, 卵裂率和孵化率逐漸降低; 在誘導持續(xù)時間20min時, 三倍體率最高可達(56.48±4.83)%, 卵裂率和孵化率分別可達(82.16±3.29)%和(83.46±3.78)% (圖3C)。

2.2 不同誘導條件下3種誘導方法三倍體誘導的誘導效率比較

在不同的鹽度條件下, 低鹽組和高鹽組的誘導效率變化范圍均較大, 其最大誘導效率出現在鹽度為6和55時, 分別可達31.41%和49.41%; 在不同的6-DMAP濃度條件下, 誘導效率變化相對較小, 濃度為75 mg/L時, 誘導效率最大可達42.50%(圖4A)。隨起始誘導時間的增大, 3種誘導方式的誘導效率均呈現先增大后減小的趨勢, 6-DMAP、低鹽和高鹽3種誘導方式的最大誘導效率均出現在起始誘導時間15min時, 分別可達40.75%、30.47%和46.48%(圖4B)。隨誘導持續(xù)時間的增大, 3種誘導方式的誘導效率均呈現先增大后減小的趨勢; 6-DMAP、低鹽和高鹽3種誘導方式的最大誘導效率均出現在誘導持續(xù)時間20min時, 分別可達42.33%、32.10%和47.14%(圖4C)。

2.3 三種誘導方式獲得的幼蟲的生長、存活、三倍體率比較

在幼蟲培育的前6天, 對照組以及各三倍體誘導組的幼蟲殼高無顯著性差異(P＞0.05)。自培育的第9天開始, 處理組幼蟲生長逐漸加快。培育的第9至第24天處理組的幼蟲殼高始終大于對照組。在3個三倍體誘導組中, 高鹽誘導組的幼蟲生長速度最快, 其次是6-DMAP誘導組和低鹽誘導組的幼蟲,但在培育期間各組之間的幼蟲殼高均無顯著性差異(P＞0.05, 圖5)。

對照組幼蟲的存活率始終顯著高于3個誘導組的幼蟲存活率, 培育至24d, 對照組的存活率達(15.58±2.17)%, 而三個實驗組的幼蟲存活率均不到5%。在3個實驗組中, 6-DMAP三倍體誘導組幼蟲的存活率始終最低, 第24天時幼蟲存活率只有(2.78±0.23)%, 不到對照的30%。低鹽和高鹽誘導組獲得的幼蟲群的存活率差異較小, 培育至24d幼蟲存活率分別達(3.51±0.77)%和(4.37±2.57)%(圖6)。

在3種誘導方式中, 高鹽誘導組獲得的三倍體率最高, 其次是6-DMAP和低鹽組。培育至17d, 3種誘導方式獲得的幼蟲的倍率均有所下降。低鹽誘導組和6-DMAP誘導組三倍體率降低幅度較大, 第13天之后, 其三倍體幼蟲的比例顯著低于高鹽組(P＜0.05)。6-DMAP、高鹽和低鹽3種誘導方式獲得的幼蟲的三倍體率分別由最初的(73.41±3.98)%、(75.69±4.33)%和(66.53±6.72)%降低至(48.47±3.17)%、(58.05±6.455)%和(47.45±4.82)%(圖7)。

2.4 三種誘導方式的綜合比較

3種誘導方式的綜合比較如表1所示, 在3種誘導方式中, 低鹽的誘導效率顯著地低于另外2種誘導方式, 6-DMAP誘導組和高鹽誘導組相比, 6-DMAP誘導的最大三倍體率稍低于高鹽誘導的最大三倍體率。鹽度誘導實驗成本低且無毒, 而6-DMAP誘導組成本較高且有一定毒性。6-DMAP誘導組幼蟲的三倍體率衰退最大, 且幼蟲平均存活率低于2個鹽度組。

圖3 不同的誘導持續(xù)時間下3種誘導方法對熊本牡蠣三倍體誘導效果Fig.3 Effects of three induction methods on triploid induction of C.sikamea at different induction duration times

3 討論

3.1 最佳誘導組合的探討

本次實驗的藥物濃度梯度較大, 發(fā)現隨誘導濃度的增加, 三倍體率先增加后有所下降, 這在6-DMAP誘導三倍體香港牡蠣和長牡蠣中均出現了類似的現象[17,18]。而Gérard等[19]的研究結果表明隨6-DMAP濃度的增加和誘導持續(xù)時間的增長, 誘導獲得的三倍體率先顯著升高, 后逐漸趨于平緩, 這與本次實驗結果有所不同。主要原因可能是當誘導濃度過大時, 幼蟲胚胎受損嚴重, 胚胎畸形率增加, 很多三倍體胚胎無法正常發(fā)育至D形幼蟲, 導致D形幼蟲的三倍體率有所下降[20]。其次誘導強度過大時, 很多胚胎無法完成細胞分裂過程, 這些無法分裂的胚胎往往中往往包含較多的多倍體胚胎。實際上這也可以解釋鹽度實驗中隨鹽度脅迫的增加, 誘導三倍體率先增加后減小的現象, 此外近江牡蠣、長牡蠣的鹽度誘導中均出現了隨鹽度脅迫的增加, 三倍體率先增加后減小的現象[21,22]。

三組均在起始誘導時間為15min時出現了最高的誘導效率, 說明受精后15min時是熊本牡蠣受精卵第二極體集中排放的時間點, 是3種方式的最佳誘導時機; 3種誘導方法中在持續(xù)誘導時間20min時均表現出了最高的誘導效率; 綜合卵裂率、孵化率和三倍體誘導率, 在6-DMAP實驗中, 當6-DMAP濃度為75 mg/L, 起始誘導時間受精后15min, 持續(xù)誘導20min時, 誘導效果最好; 在低鹽誘導組中, 當鹽度為6, 起始誘導時間為, 受精后15min, 持續(xù)誘導20min時, 誘導效果最好; 在高鹽實驗中, 鹽度55, 起始誘導時間受精后15min, 持續(xù)誘導時間15min時,誘導效果最好。

3.2 最佳誘導方法的探討

綜合來看, 低鹽誘導組的效率較低, 其獲得幼蟲的平均存活率低, 且三倍體率不穩(wěn)定, 為3種方法中誘導效果最差的一種。6-DMAP誘導最高三倍體率通常能達到80%以上[17—20], 但本次研究的三倍體率遠低于此, 這可能與卵子的成熟度、操作熟練程度和不同種對不同藥物的耐受性等因素有關[17]。因此在貝類的三倍體誘導過程中每個環(huán)節(jié)都要嚴謹, 否則誘導的不穩(wěn)定性會大大地增加。在本次實驗中, 與6-DMAP誘導組相比, 高鹽誘導組表現出了一定的優(yōu)越性, 其最高誘導效率高于6-DMAP誘導,且誘導獲得幼蟲的三倍體率較穩(wěn)定、平均存活率高、無毒環(huán)保和成本低。因此高鹽誘導熊本牡蠣是3種方法中最優(yōu)的一種。

3.3 三種誘導方式獲得幼蟲的生長、存活和三倍體率探討

圖4 不同的誘導條件下3種誘導方法誘導熊本牡蠣三倍體的誘導效率Fig.4 Induction efficiency of three induction methods on triploid induction of C.sikamea at different induction conditions

3種誘導方式獲得的浮游幼蟲在生長上無顯著性差異(P＞0.05), 但在培育的第9至第24天, 其幼蟲的殼高均顯著高于對照組(P＜0.05)。三倍體誘導組幼蟲在殼頂期幼蟲之后表現出了一定的生長誘導優(yōu)勢, 在殼頂期之前未表現出任何的生長優(yōu)勢, 分析原因是殼頂前期存在一定比例的非整倍體幼蟲,這些非整倍體幼蟲與正常的二倍體個體相比存在一定的生長劣勢[23], 導致其沒有表現出生長優(yōu)勢,而殼頂期之后這些幼蟲被淘汰[10], 幼蟲逐漸表現出生長優(yōu)勢。三倍體誘導組的幼蟲的存活率顯著低于對照組, 主要是與非整倍體的死亡以及存活力弱的D形幼蟲的淘汰有關[10]。

圖5 三種誘導方式獲得的幼蟲的殼高比較Fig.5 Comparison in shell height of larvae induced by three methods

圖6 三種誘導方式獲得的幼蟲的存活率比較Fig.6 Comparison on survival rate of triploid larva population induced by three methods

自Stanley等[24]1981年首次報道三倍體美洲牡蠣以來, 雙殼貝類的多倍體育種發(fā)展迅速, 三倍體牡蠣的規(guī)?；B(yǎng)殖是雙殼貝類進行多倍體育種的一個成功的典范[25,26], 但是在貝類的多倍體育種中也存在一些問題。多倍體群體的倍率衰退是貝類多倍體育種的一個重要的問題, 限制了穩(wěn)定的三倍體和四倍體牡蠣群體的形成[27—29]。在本研究中3種誘導方式獲得的幼蟲均出現了不同程度的倍率衰退, 分析原因有三: 首先是個體的選擇性死亡, 被抑制第二極體排放而獲得三倍體屬于非正常的個體,一部分個體由于不能適應這種現象在培育前期大量死亡, 造成整體的三倍體率下降[10]; 其次是非整倍體個體存在, 其染色體不穩(wěn)定性也可能造成三倍體率的下降; 此外研究中檢測倍率的方法是流式細胞儀檢測, 流式細胞儀并不能檢測出DNA含量的微小差別, 檢測的三倍體中可能包含一定比例的非整倍體個體[30], 隨著非整倍體的死亡三倍體率逐漸下降; 最后一個原因就是染色體的丟失, 三倍體個體的染色體丟失逆轉成為二倍體或者非整倍體會造成三倍體群體的三倍體率的下降。目前認為這種染色體丟失現象主要是由于細胞分裂過程中形成染色體叢造成的[29,31], 并且這種現象廣泛地存在于三倍體[29]和四倍體牡蠣[31]中。

圖7 三種誘導方式獲得的幼蟲的三倍體率比較Fig.7 Comparison on triploidy rate of larva induced by three methods

表1 三種三倍體誘導方法的綜合比較Tab.1 Comprehensive comparison on three triploid induction methods

4 結論

在6-DMAP、高鹽和低鹽3種誘導方式中, 低鹽的誘導效果最差, 不適合三倍體熊本牡蠣的誘導。高鹽誘導的三倍體率最高, 幼蟲的三倍體率穩(wěn)定、存活率高, 且成本低、環(huán)保、無毒害, 是誘導三倍體熊本牡蠣的理想方法。在實際的熊本牡蠣三倍體誘導生產中, 建議以高鹽的誘導方式進行誘導,最佳誘導條件為鹽度55, 起始誘導時間為受精后15min, 持續(xù)誘導時間為20min。