ARTP誘變對三角帆蚌外套膜細胞生長活性及其生物礦化相關(guān)因子的影響

陸阿利 曹玉香 李文娟 , 施志儀 , 夏煌慧 楊婧漪

(1.水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室, 上海 201306; 2.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室,上海 201306; 3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心, 上海 201306)

在珍珠的培育進程中外套膜組織是不可或缺的組織之一[1—4]。在生產(chǎn)實踐上, 培育珍珠(有核珍珠和無核珍珠)的過程均需進行外套膜組織或細胞植片, 被移植的外套膜組織或細胞小片的上皮細胞經(jīng)遷移、增殖和包裹(珠核)形成珍珠囊, 繼而分泌珍珠質(zhì)形成珍珠[2]?？梢? 提高外套膜組織或細胞的活力及其分泌機能是縮短育珠周期的關(guān)鍵因素。

長期以來, 國內(nèi)外學(xué)者一直致力于貝類外套膜組織或細胞培養(yǎng)的研究。1983年石安靜[5]首先報道了離體外套膜組織塊的上皮細胞能夠在體外存活并具有體外增殖及分泌珍珠質(zhì)的能力。2002年施志儀等[6]針對三角帆蚌外套膜組織及細胞分別進行了培養(yǎng), 探明離體組織塊遷移的上皮細胞的增殖能力更強, 又在2007年證明離體外套膜細胞具有與蚌體內(nèi)細胞相同的生物學(xué)結(jié)構(gòu)、增殖能力及分泌珍珠質(zhì)的生物活性[7]。2011年靳雨麗等[4]通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分, 添加促細胞生長因子顯著提高了離體外套膜細胞的活性及珍珠質(zhì)沉積的速度。2014年,Ren等[1]研究證明三角帆蚌離體外套膜組織及珍珠囊組織均具有分泌珍珠質(zhì)的能力, 李倩[8]通過改良緩沖液及培養(yǎng)基成分, 利用乙?；鶃喯趸寮白贤饩€輻照處理外套膜細胞, 不僅大大提升了離體外套膜細胞的活力, 更有效地控制了雜菌的污染與生長。但是, 三角帆蚌外套膜組織或細胞在后繼的體外培養(yǎng)中因增殖遲緩, 至今仍停留在原代。利用新技術(shù)提高離體外套膜細胞活力并且使其持續(xù)保持較強增殖活性是珍珠產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)型的關(guān)鍵[9,10]。

近年來, 氦氣誘變作為新型育種技術(shù)即ARTP技術(shù), 在保持較低的處理溫度下, 其突變率高于紫外輻射或化學(xué)誘變[11,12], 故廣泛應(yīng)用于生物界, 特別是微生物[13]。然而目前, 尚未檢索到有關(guān)于使用ARTP誘變海洋無脊椎動物細胞的研究。本研究以我國特有的優(yōu)質(zhì)淡水珍珠貝——三角帆蚌為研究材料, 利用ARTP技術(shù)對三角帆蚌外套膜細胞進行誘變, 以期進一步提高離體外套膜細胞的活力和珍珠質(zhì)分泌的生物學(xué)活性, 克服后繼增殖滯緩的問題, 并加快育珠進程, 為珍珠養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)實踐提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

一齡三角帆蚌購于湖南省常德市養(yǎng)殖基, 平均體重36 g, 置于裝滿曝水的水族箱中飼養(yǎng)7d。待泥沙吐盡后, 挑選體質(zhì)健康的180只蚌進行實驗。

1.2 實驗方法

外套膜細胞獲取與氦氣誘變?nèi)欠鲈诮K濃度為2%的雙抗中暫養(yǎng)3d, 使用肥皂水清洗蚌殼后, 將三角帆蚌按照誘變組進行分組, 每組60只,并使用75%酒精對其局部進行殺菌處理。參考靳雨麗等[4]的方法直接獲取外套膜組織, 用滅過菌的濾紙去除其表面黏液進行梯度清洗, 在抑菌除菌后,加入0.25%胰酶過夜冷消化12h左右, 再加入0.5%透明質(zhì)酸酶, 37℃熱消化25min; 加入含10%血清的M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基(杭州吉諾)終止消化10min后過300目細胞篩網(wǎng)收集細胞沉淀(離心速度均為1500 r/min, 10min); 并在細胞沉淀中加入M199增殖培養(yǎng)基重懸細胞于26℃孵育4h, 離心收集細胞沉淀, 再分別向細胞沉淀中加入滲透壓穩(wěn)定劑與M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整其濃度為2×106至1×107/mL, 將2種細胞接種到用多聚賴氨酸(江蘇碧云天)包被的90 mm培養(yǎng)皿中, 參考Ottenheim等[13]的研究選用氦氣氣量為10、12和15 SLM對外套膜細胞分別處理36s、72s、126s、180s、360s、540s、720s和900s, 再分別使用等體積的滲透壓穩(wěn)定劑及M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細胞后, 直接加入等體積的M199增殖培養(yǎng)基, 吹打混勻于26℃培養(yǎng)箱進行外套膜細胞培養(yǎng)。本實驗將外套膜細胞分為未誘變組(NC)和10、12和15 SLM誘變組(簡稱10 SLM組、12 SLM組和15 SLM組; M199細胞組(M)及滲透壓穩(wěn)定劑細胞組(C))且每誘變組生物學(xué)重復(fù)3次。

細胞活性與顯微觀察將誘變后的細胞懸液放入26℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 根據(jù)cell counting kit-8(CCK-8)試劑盒說明書(大連美侖)進行三角帆蚌外套膜細胞活力檢測, 活力=(誘變組OD值-空白孔OD值)/(未誘變組OD值-空白孔OD值), 空白孔值使用M199培養(yǎng)基進行測定。細胞形態(tài)觀察采用臺盼藍(上海生工)對誘變后外套膜細胞進行染色于倒置顯微鏡下(Olympus, 日本)觀察并拍照記錄。

細胞總SOD酶活性檢測三角帆蚌外套膜細胞總SOD酶活性測定根據(jù)江蘇碧云天總SOD酶活性檢測試劑盒(WST-8法)說明書測得, 根據(jù)廠商指示計算不同誘變時間點外套膜細胞總SOD酶活力。

微核實驗氦氣對外套膜細胞處理后, 離心(1500 r/min, 5min)收集細胞沉淀, 通過改進梁棟[14]的實驗方法, 進行微核實驗, 其中在將樣品處理過程中, 離心速度調(diào)整為1800 r/min, 5min; 細胞固定改為冰上固定3次, 每次30min; 制片時改用27℃恒溫箱蒸干水分30min左右; 另在染色前將樣品依次進行70%、90%和100%酒精梯度脫水, 每個梯度3min, 來固定細胞內(nèi)染色體形態(tài), 并待染色體玻片完全干燥, 依據(jù)珠海貝索生物瑞氏吉姆薩染色液操作指南進行染色, 其中每處理組細胞至少3個平行樣, 隨機選取1000個細胞, 利用普通光學(xué)顯微鏡(Olympus, 日本)觀察并記錄微核形成情況。

細胞周期檢測收集不同處理組的三角帆蚌外套膜細胞(細胞數(shù)量≥1×106/mL), 用PBS清洗2次(1500 r/min, 5min), 最后留少量PBS重懸細胞,逐滴加入到500 μL預(yù)冷的70%酒精中, -20℃過夜固定20h, 依據(jù)PI/RNase Staining Buffer(BD, 美國)使用說明進行細胞染色, 37℃避光孵育20min后, 按照流式細胞儀BD FACSVerseTM操作規(guī)范, 慢速收集1×105個細胞, 利用激發(fā)光488 nm接收通道進行細胞周期分選, 實驗重復(fù)3次。周期數(shù)據(jù)使用Novo Express軟件進行分析, 用Excel整理數(shù)據(jù), 計算每個樣品細胞增殖指數(shù)(Proliferation index;PI)即PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。

Fluo-4/AM 鈣離子熒光強度測定收集上文處理的外套膜細胞, 參考周子睿等[15]的方法進行樣品孵育與處理, 使用BD FACSVerseTM慢速收集1×105個細胞進行檢測, 檢測標(biāo)準(zhǔn)與周子睿等[15]一致。

ALP和CA活性測定堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase; ALP)、碳酸酐酶(Carbonic anhydrase;CA)和BCA蛋白測定試劑盒分別購自南京建成、上海晶抗和江蘇碧云天, 按其說明書進行操作并計算相對應(yīng)的酶活。

cDNA制備與qRT-PCR檢測根據(jù)李文娟等[16]的方法進行總RNA的提取, 純度和完整性檢測。使用HiScript III RT-PCR SuperMix(Vazyme,Nanjing)按照供應(yīng)商的建議擴增cDNA, 并保存在-20℃冰箱中。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的三角帆蚌EF1α(GW694601), 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選到的ALP基因設(shè)計定量引物(表1); 同時使用周子睿等[15]、李文娟等[16]和祁曉翔等[17]的HcCA、CAM和EFCB1定量引物序列(Genewiz, Suzhou)在PCR儀(CFX96 TouchTMRT- PCR Detection System, Bio-Rad, US)上測定以上基因在三角帆蚌不同外套膜細胞樣品中的表達情況。反應(yīng)體系、程序及數(shù)據(jù)處理與周子睿等[15]一致。生物學(xué)重復(fù)3次, 技術(shù)重復(fù)2次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件中的One-Way方差分析(ANOVA), 數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD), 不同組間使用Dunnett’s multiple comparisons進行差異表達分析, 顯著水平為P＜0.05, 極顯著水平為P＜0.01。實驗結(jié)果用Sigmaplot 12.5進行作圖分析。

2 結(jié)果

2.1 氦氣誘變對三角帆蚌外套膜細胞活力的影響

不同作用時間對三角帆蚌外套膜細胞活力的影響通過CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn), 與NC組相比, 在10、12和15 SLM組, 外套膜原代細胞的活力均有不同的變化趨勢(表2), 其中, 10、12和15 SLM組在氦氣處理時間達到360s、540s、720s和900s時, 細胞活力顯著增大(P＜0.05)且呈上升趨勢, 除10 SLMC組外, 細胞活力在720s與900s均顯著性升高(P＜0.05)且與其他各組差異顯著, 但二者未達到顯著性水平(P＞0.05); 10 SLM-C組細胞活力在720s時上升至最大值, 但在900s時細胞活力顯著下降, 以上分析表明360—900s時間段能夠?qū)ν馓啄ぜ毎鲋衬芰吧L活性產(chǎn)生顯著的誘變影響(P＜0.05)。

表1 三角帆蚌定量引物序列Tab.1 Primers used in the study

不同氦氣氣量對三角帆蚌外套膜細胞活力的影響氦氣作用時間在36—360s時, 以NC組細胞為參照, 各處理組細胞活力略有降低且滲透壓穩(wěn)定劑組(C)與M199組(M)細胞活力顯著性差異較小(表2), 說明滲透壓穩(wěn)定劑的存在對細胞幾乎沒有毒副作用, 但在有效作用時間段內(nèi)(360—900s), 隨著氦氣氣量增大, 12 SLM組和15 SLM組的C組細胞活力顯著高于M組(P＜0.05), 且照射時長720s和900s均能使細胞活力提高3倍左右(P＜0.01)且趨于飽和; 而在10 SLM組, 輻照時間長達720s和900s時,細胞活力對滲透壓穩(wěn)定劑的刺激更為敏感。由細胞顯微觀測可以看出(圖1), 與NC組相比(圖1A),氦氣誘變720s的細胞狀態(tài)發(fā)生顯著性變化, 首先細胞形態(tài)以橢圓形為主, 部分細胞膜破壞, 因誘變作用強度較大(12 SLM和15 SLM), 培養(yǎng)基酸堿度不穩(wěn)定, 出現(xiàn)了細胞團塊和碎片(圖1C和圖1D)?；谝陨峡芍? 氦氣誘變的條件為12 SLM和15 SLM,處理時間為720s, 處理組為滲透壓穩(wěn)定劑。

氦氣誘變后三角帆蚌外套膜細胞培養(yǎng)進程中的活力分析外套膜細胞的損傷程度主要受氦氣氣量及照射時長的影響。本研究進一步將360—900s的滲透壓穩(wěn)定劑組的細胞短暫培養(yǎng)至24h, 利用CCK-8法檢測了不同培養(yǎng)進程中細胞的活力, 以期探究氦氣誘變后外套膜細胞的損傷程度。研究結(jié)果顯示(圖2), 在不同氣量處理下, 細胞的活力均在0達到最大值(P＜0.05)且同一氣量下與NC組對比,0的細胞活力均有顯著增高的趨勢(P＜0.05), 然而與0相比, 各處理組細胞活力隨著培養(yǎng)時間的延長(6—12h)而下降。在短暫培養(yǎng)24h后, 結(jié)果顯示與NC組相比, 輻照720s的各處理組細胞活力顯著增高(P＜0.05), 其中10 SLM組720s的細胞活力在培養(yǎng)6h后, 細胞活力恢復(fù)至原有細胞活力水平(即NC組細胞活力水平, 下同)并在整個培養(yǎng)進程中趨于穩(wěn)定(圖2A), 12 SLM組720s細胞在培養(yǎng)24h時恢復(fù)至原有細胞活力水平(圖2B), 15 SLM組720s細胞有可能在較長的培養(yǎng)進程中完成自我修復(fù)(圖2C)。以上結(jié)果表明, 氦氣處理后外套膜細胞活力受到不同程度的損傷, 在細胞短暫培養(yǎng)24h后, 根據(jù)細胞培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同氣量處理下細胞恢復(fù)程度也不盡相同, 且處理時間較短時(＜720s), 細胞活力恢復(fù)至正常水平速度整體較快, 以處理900s的各組外套膜細胞恢復(fù)能力最弱, 故進一步確定氦氣誘變氣量為12 SLM, 適宜誘變時長為720s。

表2 氦氣處理對外套膜細胞活力的影響Tab.2 The effect of helium on cells viability in mantle cells

氦氣誘變對三角帆蚌外套膜細胞周期及增殖指數(shù)PI的影響為了進一步探究不同處理組對細胞周期的影響, 本研究分別用10、12和15 SLM的氦氣對外套膜細胞輻照720s。結(jié)果顯示(表3和圖3), 與NC組相比, 隨著氦氣濃度增大, G1期占比呈先減小后增大的趨勢(圖3A), 而PI呈先上升后下降趨勢(圖3B), 當(dāng)氦氣濃度為12 SLM時, S和G2/M期細胞占比最多(表3;P＜0.05), 其細胞增殖指數(shù)PI最大(0.77±0.04; 圖3B;P＜0.05), 而氦氣濃度達到15 SLM時, G1/S比值最高(圖3A;P＜0.05), 其細胞增殖指數(shù)PI最低(表3;P＜0.05)?；谝陨戏治隹芍? 高氣量(15 SLM)處理外套膜細胞會引起G1期延長。

2.2 氦氣誘變對三角帆蚌外套膜細胞損傷程度的影響

氦氣誘變對三角帆蚌外套膜細胞SOD酶活力的影響為了研究氦氣對三角帆蚌外套膜細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平的影響, 本研究分別用10、12和15 SLM的氦氣對細胞暴露720s, 結(jié)果顯示(圖4), 當(dāng)氦氣輻照720s時, 與NC組相比, SOD酶活力隨著氣量的增大呈顯著下降趨勢(P＜0.05), 其中15 SLM處理組的SOD酶活力顯著降至最低水平(P＜0.05), 12 SLM次之。

氦氣誘變對三角帆蚌外套膜細胞DNA損傷的影響為了研究氦氣對三角帆蚌外套膜細胞DNA損傷的影響, 分別用10、12和15 SLM的氦氣對外套膜細胞處理720s, 并以NC組為對照, 用吉姆薩染色后觀察細胞內(nèi)染色體損傷情況。如圖5A、5B和5C所示, 當(dāng)氦氣為10 SLM時可見微核形成(如黑色箭頭所示)。氦氣處理組與NC組相比, 其微核數(shù)量隨著氦氣氣量的升高呈上升趨勢, 當(dāng)氦氣濃度達到15 SLM時, 微核率為23.68%, 出現(xiàn)了顯著性升高(圖5D,P＜0.05), 但與12 SLM組微核率的形成無顯著性差異。

圖1 不同處理組外套膜細胞形態(tài)觀察Fig.1 The comparison diagram between the cells with helium and without helium

圖2 培養(yǎng)進程中不同處理組外套膜細胞的活力分析Fig.2 The viability of mantle cells in different culture proceeding after helium

表3 不同處理組外套膜細胞時相分布和增殖指數(shù)分析Tab.3 The phase distribution and proliferation index in mantle cells from different treatments

圖3 不同處理組外套膜細胞周期及PI分析Fig.3 The analysis of Helium on cell cycle and PI in mantle cells from different treatments

2.3 氦氣誘變對三角帆蚌外套膜細胞生物礦化相關(guān)因子的影響

圖4 不同處理組外套膜細胞SOD酶活力分析Fig.4 The SOD activity of mantle cells under different helium treatments

氦氣誘變對三角帆蚌外套膜細胞胞內(nèi)Ca2+攝取的影響經(jīng)流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn), 與NC組相比, 外套膜細胞Ca2+熒光強度隨著氦氣濃度增大呈顯著上升趨勢(P＜0.05), 在12 SLM和15 SLM組, 外套膜細胞Ca2+的熒光值分別提升了1.17倍和1.13倍,但二者未達到顯著性水平(P＞0.05, 圖6)。

氦氣誘變對三角帆蚌外套膜細胞CA與ALP的活力影響如圖7所示, 與NC組相比, CA活力在10 SLM到12 SLM均呈顯著上升趨勢(P＜0.05), 且外套膜細胞CA活力在12 SLM組達到最大值(22.46 U/g prot;P＜0.05), 在15 SLM組雖出現(xiàn)顯著下降(P＜0.05),其CA活力是NC組的1.94倍。

氣量為10、12和15 SLM的氦氣分別對外套膜細胞處理720s后, ALP活性呈先下降后上升再下降的趨勢, 其中10 SLM組ALP活性顯著下降至最低水平(P＜0.05), 12 SLM組的外套膜細胞ALP活性顯著高于其他處理組(P＜0.05), 且高達347.29金氏單位/g prot。但隨著氣量的增大, 15 SLM組細胞ALP活性顯著下降, 與NC組相比未達到顯著水平(P＞0.05)。

氦氣誘變對HcCA、ALP、CAM與EFCB1基因表達水平的影響使用氣量為10、12和15 SLM的氦氣分別對外套膜細胞處理720s后,HcCA表達量如圖8所示, 與NC組相比, 10 SLM組HcCA表達量顯著下降(P＜0.05), 12 SLM組的外套膜細胞HcCA表達量達到最大值(P＜0.05), 但15 SLM組細胞HcCA表達量與NC組比較無顯著性差異(P＞0.05)。

ALP基因由qRT-PCR結(jié)果可知, 在不同處理組外套膜細胞中的表達水平存在顯著性差異(圖8,P＜0.05), 與NC組相比, 12 SLM組ALP表達量最高(P＜0.05), 15 SLM組次之, 而氦氣氣量為10 SLM時,外套膜細胞ALP表達量顯著降至最低(P＜0.05)。

圖5 氦氣誘變對外套膜細胞微核率的影響Fig.5 The effect of helium on micronucleus frequency in mantle cells

圖6 不同處理組外套膜細胞內(nèi)Ca2+熒光強度分析Fig.6 The intracellular Ca2+ fluorescence intensity in mantle cells of different helium treatments

圖7 不同處理組外套膜細胞CA和ALP的活力分析Fig.7 The activity of CA and ALP in mantle cells after helium treatment

CAM基因表達分析結(jié)果表明, 隨著氦氣氣量的增高, 其表達水平呈先升高后下降的趨勢(圖8), 其中, 與NC組相比, 10 SLM組與12 SLM的CAM基因表達量略有升高, 且在12 SLM其達到最大值, 但二者均未達到顯著性水平, 在15 SLM組,CAM基因表達量大幅度下降但無顯著性差異。

圖8 不同處理組外套膜細胞生物礦化相關(guān)基因的表達分析Fig.8 Biomineralization-related gene expressions of mantle cells from different helium treatments

EFCB1基因的表達結(jié)果顯示, 隨著氦氣氣量的增高, 呈先升高后下降的趨勢(圖8), 與NC組相比,10 SLM組EFCB1表達量最高(P＜0.05), 12 SLM組次之, 但二者與NC組比較顯著性差異較小, 而在15 SLM組, 外套膜細胞EFCB1表達量顯著下降(P＜0.05)。

3 討論

3.1 氦氣誘變方法可行性的探討

ARTP技術(shù)是一種基于射頻大氣壓輝光放電等離子體的新型全細胞誘變工具[18], 通過破壞細胞膜結(jié)構(gòu), ARTP內(nèi)產(chǎn)生的活性氧或活性氮粒子進入細胞或其與水分子及胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物分子進一步反應(yīng)生成的有機氧化物引發(fā)DNA易錯性修復(fù)機制[19]。資料顯示, 活細胞內(nèi)DNA損傷強度與誘變率具有一定的正相關(guān)性, 尤其在微生物方面, ARTP誘變對其有顯著的致死效應(yīng), 且具有較強的殺菌作用[20]。三角帆蚌外套膜細胞屬于開放式培養(yǎng)系統(tǒng),容易受到各種雜菌的污染, 故ARTP技術(shù)應(yīng)用于外套膜細胞培養(yǎng)可有效控制雜菌的生長與污染。

三角帆蚌離體外套膜細胞培養(yǎng)除易受雜菌污染外, 還存在增殖分裂緩慢的難題。研究表明,ARTP誘變不僅對細胞微環(huán)境有殺菌作用, 還可以促進上皮細胞增殖[19], 因此使用ARTP技術(shù)不僅可以刺激外套膜細胞增殖, 還會使其發(fā)生基因損傷,損傷后自我修復(fù)的外套膜細胞可能會產(chǎn)生穩(wěn)定遺傳的突變細胞, 該細胞可能具有無限增殖的能力及較高的生物礦化活性, 為三角帆蚌外套膜細胞建立細胞系提供資料。

此外ARTP誘變產(chǎn)生諸多的活性氧粒子會造成細胞DNA多樣性損傷, 其中活性氧粒子增多會造成細胞的氧化損傷, SOD酶在清除胞內(nèi)活性氧自由基起著重要作用。細胞DNA損傷水平可通過檢測胞內(nèi)DNA單、雙鏈的斷裂與染色體異常水平顯示, 微核試驗, 染色體畸變, 單細胞凝膠電泳等常見的DNA損傷檢測方法均可用于本研究。流式細胞儀與ARTP技術(shù)聯(lián)合使用在微生物上主要進行突變株的分選與培養(yǎng)[12,21], 本研究使用流式細胞儀分析了不同氦氣條件下存活的外套膜細胞的增殖指數(shù), 分選到目的細胞。由于ARTP誘變產(chǎn)生的活性粒子可以改變酶蛋白的結(jié)構(gòu), 從而促進目的細胞關(guān)鍵酶活升高并影響其相對應(yīng)基因表達水平[22], 這與本研究中關(guān)鍵的生物礦化酶活力(CA和ALP)及其相關(guān)基因的表達結(jié)果相似。

3.2 氦氣誘變對三角帆蚌外套膜細胞活力的影響

珍珠貝外套膜外表皮的上皮細胞對珍珠的形成起著決定性的“內(nèi)因”作用[23]。本文參考靳雨麗等[4]和李倩等[8]的細胞培養(yǎng)方法, 利用氦氣誘變?nèi)欠鐾馓啄ぜ毎? 結(jié)果顯示隨著氦氣作用強度(＞10 SLM,360—900s)增大, 外套膜細胞活力呈顯著上升趨勢,且在720s與900s 時細胞活力顯著大于其他處理組,但二者未達到顯著水平, 細胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn), 氦氣誘變后出現(xiàn)了細胞膜破裂, 細胞碎片等現(xiàn)象, 推測氦氣誘變通過破壞細胞膜結(jié)構(gòu), 其產(chǎn)生的活性粒子進入胞內(nèi)與DNA發(fā)生作用[24], 造成DNA單、雙斷裂[25], 故細胞表達顯著上升, 細胞活力均明顯高于誘導(dǎo)初期的細胞, 且在誘變時長360—900s, 出現(xiàn)了活力最大值, 整體也表現(xiàn)為細胞活力顯著升高, 該現(xiàn)象與李倩等[8]使用紫外線誘變細胞的研究結(jié)果相一致。在誘變后, 繼續(xù)將細胞穩(wěn)定培養(yǎng)至24h, 發(fā)現(xiàn)僅720s處理組(10 SLM和12 SLM)細胞較快恢復(fù)至原有細胞活力水平, 說明損傷后修復(fù)的細胞有被誘變的可能性, 暗示了氦氣誘變能夠作用于三角帆蚌的外套膜細胞。

在氦氣誘變時, 長時間輻照會揮發(fā)掉微環(huán)境部分水分以作用于外套膜細胞, 如何維持細胞培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定性顯得尤為重要。黃艷等[26]研發(fā)的滲透壓穩(wěn)定劑主要由滲透壓維持劑即氯化鈉, 保濕劑即海藻糖與甘油, pH維持劑即PBS緩沖液組成, 具有共同維持細胞培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定性, 提升氦氣誘變時細胞的敏感度的作用。在微生物中, 滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體具有保濕和保護作用, 能夠防止原生質(zhì)體失活, 提高突變率[26]。本研究同樣探討了滲透壓穩(wěn)定劑在三角帆蚌外套膜細胞誘導(dǎo)實驗中的應(yīng)用,研究表明滲透壓穩(wěn)定劑組的細胞活力隨著氦氣劑量的增大(＞10 SLM, 360—900s), 顯著高于M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基組, 暗示了滲透壓穩(wěn)定劑具有穩(wěn)定細胞培養(yǎng)環(huán)境, 刺激細胞活力增強的作用, 尤其在氦氣長時間輻照細胞下, 其起到了良好的緩沖作用, 這與黃艷等[26]的研究結(jié)果相似。

DNA周期檢測可用來反應(yīng)細胞的增殖狀況。細胞增殖的旺盛程度可由有絲分裂期相(M期)的多少來判斷[27], 而增殖指數(shù)PI可反映整個細胞群體的增殖狀態(tài)和該群體中增殖期的數(shù)量。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn), 在氦氣氣量為12 SLM, 處理時長為720s時, 細胞S期與G2/M占比最大(P＜0.05), 其PI值最高,這與江闊[28]的研究結(jié)果一致, 暗示了在一定范圍內(nèi)氦氣誘變通過促進外套膜細胞DNA合成與有絲分裂, 進而提高其增殖能力和細胞活性。

3.3 氦氣誘變對三角帆蚌外套膜細胞損傷程度的影響

大量研究表明, 以氦氣為激發(fā)源的常壓室溫等離子體中存在的大量活性氧化物(ROS)和活性氮化物會引起DNA 斷裂、蛋白質(zhì)變性、真核細胞DDR響應(yīng), 原核細胞SOS響應(yīng)[25,29]。如果細胞內(nèi)ROS過量生成, 則會引發(fā)諸多生物分子參與ROS的防御,其中SOD酶在該防御反應(yīng)中起著重要作用[30]。本研究對SOD酶分析結(jié)果顯示, 隨著氦氣量的增大,SOD酶活力顯著下降, 其中15 SLM組顯著降至最低值, 說明ROS過量生成且超出細胞自身抗氧化水平, 嚴(yán)重造成了蛋白質(zhì)的氧化損傷, 與梁棟[14]使用硫丹誘變K562細胞檢測結(jié)果一致。

細胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用產(chǎn)生核異常的微核現(xiàn)象, 往往由染色體或紡錘絲斷裂產(chǎn)生[31]。微核試驗是檢測外來化合物對染色體損傷作用的重要方法, 不同氦氣處理組的微核實驗表明氦氣誘變會引起較為輕度的染色體損傷, 說明氦氣誘變產(chǎn)生大量的活性粒子可與細胞、DNA和蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用, 造成DNA損傷。以上損傷結(jié)果表明, 15 SLM組720s細胞SOD活力最低, 微核率達到最高, 推測氦氣誘變對該組細胞DNA氧化損傷最為嚴(yán)重, 該結(jié)果與培養(yǎng)至24h的細胞活力結(jié)果一致, 由于在細胞培養(yǎng)24h時, 15 SLM組720s的細胞活力與10 SLM組、12 SLM組相比較低, 推測其仍需較長才能恢復(fù)至原有細胞活力水平, 故不適宜進行后續(xù)的細胞培養(yǎng), 因此氦氣誘變適宜氣量條件為12 SLM。

3.4 氦氣誘變對三角帆蚌外套膜細胞生物礦化相關(guān)因子的影響

貝殼和珍珠都是貝類進行鈣代謝后最終以碳酸鈣結(jié)晶形式沉積而成[32], 胞內(nèi)鈣離子的含量影響珍珠質(zhì)的沉積速度。本研究檢測發(fā)現(xiàn), 隨著氦氣氣量增高, 鈣離子熒光值整體呈上升趨勢且在氣量為12 SLM達到最大值, 表明經(jīng)氦氣處理后, 外套膜細胞攝取鈣離子的能力增強。

HcCA屬于α-CA家族[33], 是一類含Zn2+的金屬酶, 在貝類中廣泛存在[34]。Medakovic[35]研究發(fā)現(xiàn)α-CA家族加速了CO2和之間的相互轉(zhuǎn)化, 對軟體動物碳酸鈣(CaCO3)的形成起重要作用[36]。而ALP是一種分解單磷酸醋的水解酶, 主要參與貝類外套膜組織鈣化[37], 貝殼角蛋白分泌[38]等生物礦化過程。本文研究發(fā)現(xiàn), 在12 SLM處理組, 外套膜細胞CA、ALP活力及其基因表達水平顯著高于其他處理組(P＜0.05), 說明了氦氣誘變產(chǎn)生的活性粒子是造成這些生物礦化關(guān)鍵酶的酶活及其基因表達升高的關(guān)鍵因素。研究表明,ALP基因表達水平與外套膜細胞鈣化過程呈正相關(guān)[37], 說明了氦氣處理可有效加快外套膜細胞的鈣化過程。

具有EF-hand結(jié)構(gòu)域的CAM和EFCB1通過調(diào)控鈣代謝[39,40], 進而參與調(diào)節(jié)貝殼和珍珠質(zhì)的形成,是影響珍珠質(zhì)CaCO3晶體形成的有機成分之一[41]。本研究結(jié)果顯示CAM在氣量為12 SLM處理組表達水平最高, 這與胞內(nèi)鈣離子檢測結(jié)果相一致, 而EFCB1的表達水平在10 SLM時達到最大值, 12 SLM處理組表達水平與NC相比無顯著性差異(P＞0.05),研究資料表明,CAM基因表達水平與Ca2+濃度呈顯著正相關(guān)[16,42], 但三角帆蚌育珠過程中Ca2+代謝水平與EFCB1基因的表達水平均具有波動性[17], 這與本研究結(jié)果相似, 暗示了EFCB1基因的表達水平與胞內(nèi)Ca2+濃度可能關(guān)系不強, 其具體調(diào)控機制仍需進一步研究。

綜上所述, 氦氣誘變對三角帆蚌外套膜細胞活力及生物礦化功能影響顯著, 本研究篩選到氦氣氣量為12 SLM, 作用時長720s, 處理組為滲透壓穩(wěn)定劑的細胞具有較高的生物學(xué)活性, 為進一步研究海洋貝類離體細胞培養(yǎng)及生物礦化機制提供實驗資料, 為建立細胞系提供新思路。