穩(wěn)定碳同位素判別濃香型白酒的品牌

張倩，謝正敏*，安明哲，魏金萍，葉華夏，黃箭

1(宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓，644000)2(中國輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點實驗室，四川 宜賓，644000)

白酒在我國擁有相當(dāng)悠久的歷史，與我國文化早已密不可分，而濃香型白酒(strong-flavor Baijiu, SFB)更是在白酒中占有非常重要的地位。白酒中98%以上的成分為水和乙醇，而剩下不到2%的微量成分(風(fēng)味物質(zhì))決定著白酒的風(fēng)味和品質(zhì)。受到謀求非法暴利的驅(qū)使，近年來“假酒”事件屢禁不止，這嚴(yán)重損害了消費者的消費信心及正規(guī)企業(yè)的品牌信譽。研究者們通過GC-MS、電子鼻、超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(ultra high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry, UPLC-Q-Exacive-MS)、電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(inductively coupled plasma-optical emission spectroscopy, ICP-OES)、電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma-mass spectrometry, ICP-MS)、GC等多種技術(shù)對白酒中各種特征物質(zhì)進行檢測，再通過主成分分析、偏最小二乘判別分析、聚類分析、因子分析、線性判別分析等方法對數(shù)據(jù)進行處理，最后對白酒進行酒質(zhì)、香型、分類、產(chǎn)地、真假等領(lǐng)域[1-7]的研究。這些研究多基于特征物質(zhì)的成分與含量，隨著檢測技術(shù)的蓬勃發(fā)展，白酒中特征物質(zhì)的成分與含量將逐一破解，使制假者可以勾兌出與品牌白酒特征相近的白酒，造成上述方法的局限性逐漸增大，因此，迫切需要開發(fā)新的方法去進行品牌白酒鑒別。

國際上，穩(wěn)定同位素技術(shù)由于揭示了產(chǎn)品特征化合物分子內(nèi)部原子水平的信息，而該信息與原料、工藝息息相關(guān)，因此被廣泛應(yīng)用于蜂蜜、食用油、葡萄酒、果汁飲料等食品的鑒別[8-16]；國內(nèi)，鐘其頂?shù)萚17]、李賀賀等[18]發(fā)現(xiàn)將穩(wěn)定同位素質(zhì)譜技術(shù)(stable isotope ratio mass spectrometry, IRMS)用于鑒別固態(tài)法白酒具有一定技術(shù)可行性?；诖?，本文利用該技術(shù)研究不同品牌濃香型白酒中乙醇δ13C、4種典型風(fēng)味物質(zhì)(異戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、己酸)δ13C的差異，再結(jié)合線性判別分析研究該技術(shù)在濃香型白酒品牌判別應(yīng)用上的可行性，脫離了對特征物質(zhì)含量的檢測，為“白酒鑒別”事業(yè)添磚加瓦。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

市售各品牌不同批次濃香型成品酒，酒精度皆>40°。

丙酮(色譜純)；已標(biāo)定δ13C值的乙醇、異戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、己酸(均為色譜純)；已檢測各成分δ13C值的實驗室穩(wěn)定酒樣；氦氣，純度(體積分?jǐn)?shù))>99.999%。

AI 1310自動進樣器、Trace GC Ultra氣相色譜儀、GC Isolink燃燒轉(zhuǎn)化裝置、Delta V Advantage穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀，Thermo Fisher公司。

1.2 實驗方法

采用氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)(GC-C-IRMS)檢測待測濃香型白酒中乙醇δ13C、異戊醇δ13C、己酸乙酯δ13C、乳酸乙酯δ13C和己酸δ13C，燃燒轉(zhuǎn)化裝置配備陶瓷氧化鈣，工作溫度1 000 ℃；IRMS條件：離子源真空為1.3×10-6mBar，電壓為3.06 kV。

1.2.1 乙醇δ13C的測定

用色譜純丙酮將濃香型白酒稀釋, 乙醇含量約為4 mL/L，將稀釋液放入進樣瓶待測。

以標(biāo)定δ13C后的乙醇為標(biāo)準(zhǔn)品、實驗室穩(wěn)定酒樣為質(zhì)控樣，采用GC-C-IRMS檢測待測濃香型白酒乙醇δ13C。所述氣相色譜條件為：TR-WAXMS毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣，恒流模式，流速為1.0 mL/min；進樣體積為1 μL，進樣口溫度為220 ℃；分流比為20∶1；升溫程序為起始溫度40 ℃，保持2 min，以1 ℃/min升溫至50 ℃后保持1 min，再以20 ℃/min升溫至200 ℃并保持4 min。

1.2.2 異戊醇δ13C、己酸乙酯δ13C、乳酸乙酯δ13C和己酸δ13C的測定

將濃香型白酒用丙酮稀釋5倍后，搖勻，移入進樣瓶，待測。

標(biāo)樣：按照濃香型白酒中各風(fēng)味物質(zhì)的大概比例將已標(biāo)定δ13C值的5.0 μL異戊醇、10.0 μL己酸乙酯、6.5 μL乳酸乙酯、10.0 μL己酸加入到5 mL丙酮中，搖勻，再取100 μL混合溶液到裝有900 μL丙酮的進樣瓶中，搖勻，待用。質(zhì)控樣為實驗室穩(wěn)定酒樣。

GC條件：TR-WAXMS毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣，恒流模式，流速為1.2 mL/min；進樣體積為1 μL，進樣口溫度為220 ℃；升溫程序為：起始溫度55 ℃，保持5 min，以4 ℃/min 升溫至80 ℃后保持4 min，再以6 ℃/min升溫至100 ℃ 并保持7 min，接著以15 ℃/min升溫至 120 ℃后保持0 min，最后以10 ℃/min升溫至 220 ℃后保持3 min。

1.3 試驗計算

在自然界中，13C/12C變化微小，難以測得其真實值，故采用相對測量法表示樣品中13C/12C，結(jié)果以δ(千分差，‰)表示，如公式(1)所示：

(1)

式中：Rsample C表示樣品中13C/12C比值；RV-PDB表示國際基準(zhǔn)物質(zhì)V-PDB的13C/12C比值，13C/12C=(11 237.2±90)×10-6。本項目中所有數(shù)據(jù)均基于V-PDB計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用IRMS自帶軟件Isodat 3.0計算各物質(zhì)δ13C測定值，再通過兩點標(biāo)準(zhǔn)漂移校正模式校正得到各物質(zhì)真實值。使用SPSS軟件對所得數(shù)據(jù)進行作圖分析、并利用線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)對判別率進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇δ13C

對不同品牌濃香型白酒各成分δ13進行了測定，如表1所示，各品牌濃香型白酒乙醇δ13C分布在-24.10‰～-13.59‰，樣品δ13C的變化幅度比較明顯，其中乙醇δ13C以品牌13最高、品牌12最低。白酒中的乙醇最終來源于發(fā)酵原料，故白酒乙醇δ13C必然同源于發(fā)酵原料δ13C[19-20]。本文收集的濃香型白酒品牌多采用小麥、高粱等常見C3、C4植物為原料，而C3植物δ13C多分布在-20‰～-34‰、C4植物δ13C多分布在-8‰～-17‰[18]，根據(jù)各品牌原料種類、配比的不同，其乙醇δ13C在-24.10‰～-13.59‰變化是符合C3、C4植物發(fā)酵后穩(wěn)定碳同位素特征的。

表1 不同品牌濃香型白酒各成分δ13C測定結(jié)果Table 1 Determination of different components stable carbon isotope ratios in different brands of SFB

圖1為各濃香型白酒品牌乙醇δ13C的箱圖?；谝掖鸡?3C，品牌7、12、13的樣品與其他品牌的樣品重疊部分非常少，差異顯著，易于區(qū)分；品牌9和品牌1、2、3、4、5的樣品重疊部分多，前者基本覆蓋后者，無顯著性差異，難區(qū)分；品牌6、11的樣品重疊部分多，無顯著性差異，難區(qū)分，但均與其他品牌的樣品差異顯著；品牌8、10的樣品重疊部分多，無顯著性差異，難區(qū)分，但均與其他品牌的樣品差異顯著?？傊?，單獨的乙醇δ13C只能較好的區(qū)分濃香型白酒品牌7、12、13，對于其他品牌區(qū)分度較差，故需要引入其他δ13C指標(biāo)來更好的進行濃香型白酒品牌判別。

圖1 各品牌濃香型白酒乙醇δ13C箱圖Fig.1 Different brands of SFB′s ethanol stable carbon isotope ratios box map

2.2 異戊醇δ13C

表1顯示，各品牌濃香型白酒異戊醇δ13C分布在-32.25‰～-22.54‰，樣品δ13C的變化幅度比較明顯，其中異戊醇δ13C以品牌10最高、品牌2最低。圖2為各濃香型白酒品牌異戊醇δ13C的箱圖?；诋愇齑鸡?3C，品牌8、10、13的樣品與其他品牌的樣品重疊部分非常少，差異顯著，易于區(qū)分；品牌7和品牌12的樣品重疊部分多，無顯著性差異，難區(qū)分，但均與其他品牌的樣品差異顯著；品牌1、2、3、4、5、6、9、11相互重疊，無顯著性差異，難以區(qū)分?？傊?，單獨的異戊醇δ13C只能較好的區(qū)分濃香型白酒品牌8、10、13，對于其他品牌區(qū)分度較差。

圖2 各品牌濃香型白酒異戊醇δ13C箱圖Fig.2 Different brands of SFB′s isoamyl alcohol stable carbon isotope ratios box map

同乙醇一樣，白酒中的異戊醇最終來源于發(fā)酵原料，不同的是乙醇來源于發(fā)酵原料中的糖，異戊醇來源于發(fā)酵原料中的糖和亮氨酸[21]。盡管各品牌濃香型白酒釀酒原料種類、配比不同，不同原料中糖和亮氨酸含量不同，且不同原料中糖δ13C和亮氨酸δ13C差值也可能不同，但在無外源添加、純釀造情況下，來源于同一發(fā)酵原料的乙醇δ13C和異戊醇δ13C在理論上是具有同源性的，王道兵[21]對這種同源性進行了研究，發(fā)現(xiàn)乙醇δ13C和異戊醇δ13C是具有較好線性相關(guān)性的，故可將異戊醇作為乙醇的穩(wěn)定碳同位素內(nèi)源標(biāo)志物來判別白酒中是否有乙醇的外源添加。基于此，現(xiàn)以各品牌濃香型白酒乙醇δ13C為橫坐標(biāo)、異戊醇δ13C為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果示于圖3。濃香型白酒品牌1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、13的乙醇δ13C和異戊醇δ13C確實顯示了一定線性相關(guān)性，在一定程度上證明了這些品牌無外源乙醇添加；而品牌10和品牌12，可以看出它們的點明顯偏離了線性范圍，基于酒廠生產(chǎn)白酒時一般不會對異戊醇進行外源添加，說明品牌10和品牌12可能有乙醇的外源添加。

圖3 各品牌濃香型白酒異戊醇δ13C-乙醇δ13C圖Fig.3 Different brands of SFB′s isoamyl alcohol and ethanol stable carbon isotope ratios diagram

2.3 己酸乙酯δ13C

表1顯示，各品牌濃香型白酒己酸乙酯δ13C分布在-26.73‰～-20.95‰，樣品δ13C的變化幅度相比于異戊醇δ13C、乙醇δ13C較小，其中己酸乙酯δ13C以品牌9最高、品牌3最低。圖4為各品牌濃香型白酒己酸乙酯δ13C的箱圖。基于己酸乙酯δ13C，品牌3的樣品與其他品牌的樣品無重疊，差異顯著，易于區(qū)分；品牌8只與品牌11的樣品重疊部分多，無顯著性差異，難區(qū)分，但品牌8與其他品牌的樣品差異顯著；品牌6、9、10、13樣品己酸乙酯δ13C波動范圍均較大，相互之間都有較大重疊，無顯著性差異，難以區(qū)分；品牌12樣品己酸乙酯δ13C波動范圍也較大，在與品牌7、11、13有較大重疊的同時，幾乎包含了品牌1、2、4、5，難以區(qū)分?？傊瑔为毜募核嵋阴ウ?3C只能較好的區(qū)分濃香型白酒品牌3，對于其他品牌區(qū)分度較差。

2.4 乳酸乙酯δ13C

各品牌濃香型白酒乳酸乙酯δ13C分布在-21.28‰～-12.46‰，樣品δ13C的變化幅度相對較大，其中乳酸乙酯δ13C以品牌13最高、品牌6最低。圖5為各品牌濃香型白酒乳酸乙酯δ13C的箱圖。圖5、表1顯示，基于乳酸乙酯δ13C，品牌13的樣品波動范圍較大，但只與品牌7有較大重疊，無顯著性差異，與其他品牌的樣品差異顯著；品牌6的樣品只與品牌2有較大重疊，無顯著性差異，難區(qū)分，但品牌6與其他品牌的樣品差異顯著；品牌12的樣品只與品牌8有較大重疊，無顯著性差異，但品牌12與其他品牌的樣品差異顯著；品牌1、2、3、4、5、9、10、11的樣品相互之間都有較大重疊，無顯著性差異，難以區(qū)分?？傊瑔为毜娜樗嵋阴ウ?3C并不能很好的區(qū)分各濃香型白酒品牌。

圖4 各品牌濃香型白酒己酸乙酯δ13C箱圖Fig.4 Different brands of SFB′s ethyl caproate stable carbon isotope ratios box map

圖5 各品牌濃香型白酒乳酸乙酯δ13C箱圖Fig.5 Different brands of SFB′s ethyl lactate stable carbon isotope ratios box map

2.5 己酸δ13C

各品牌濃香型白酒己酸δ13C分布在-28.18‰～-20.18‰，樣品δ13C的變化幅度相對較大，其中己酸δ13C以品牌6最高、品牌3最低。圖6為各品牌濃香型白酒己酸δ13C的箱圖。圖6、表1顯示，基于己酸δ13C，品牌3的樣品與其他品牌的樣品重疊部分非常少，差異顯著，易于區(qū)分；品牌6和品牌9的樣品波動范圍較大且相互有較大重疊，但與其他品牌的樣品差異顯著；品牌7的樣品只與品牌8有較大重疊，無顯著性差異，難區(qū)分，但品牌7與其他品牌的樣品差異顯著；品牌1、2、4、5、10、11、12、13的樣品相互之間都有較大重疊，無顯著性差異，難以區(qū)分?？傊?，單獨的己酸δ13C只能較好的區(qū)分濃香型白酒品牌3，對于其他品牌區(qū)分度較差。

圖6 各品牌濃香型白酒己酸δ13C箱圖Fig.6 Different brands of SFB′s hexanoic acid stable carbon isotope ratios box map

綜合濃香型白酒中5種成分δ13C箱圖和表1結(jié)果，發(fā)現(xiàn)5種指標(biāo)可以直接辨別品牌3、7、8、10、12、13,乙醇δ13C箱圖中，品牌11只與品牌6有較大重疊，而己酸乙酯δ13C結(jié)果顯示，品牌11、6差異顯著(P<0.05)，故聯(lián)合乙醇δ13C、己酸乙酯δ13C可辨別品牌11；乳酸乙酯δ13C箱圖中，品牌6只與品牌2有較大重疊，而乙醇δ13C結(jié)果顯示，品牌6、2差異顯著(P<0.05)，故聯(lián)合乳酸乙酯δ13C、乙醇δ13C可辨別品牌6；己酸乙酯δ13C箱圖中，品牌9只與品牌6、10、13有較大重疊，而乙醇δ13C結(jié)果顯示，品牌9與品牌10、13差異顯著(P<0.05)，乳酸乙酯δ13C結(jié)果顯示，品牌9與品牌6差異顯著(P<0.05)，故聯(lián)合乙醇δ13C、乳酸乙酯δ13C、己酸乙酯δ13C可辨別品牌9?？傊?種穩(wěn)定碳同位素指標(biāo)可直接或聯(lián)合辨別品牌3、6、7、8、9、10、11、12、13，并將品牌1、2和品牌4、5與其他品牌區(qū)分，但無法將品牌1、2各自區(qū)分，也不能將品牌4、5各自區(qū)分。以往的研究[20]顯示，同一酒廠原料、工藝一致情況下，用一級酒生產(chǎn)的多批次高檔酒乙醇δ13C均值和用二級酒生產(chǎn)的多批次中檔酒乙醇δ13C均值無顯著差異。上述結(jié)果中，來自酒廠A的不同濃香型白酒品牌1、2，及來自酒廠B的不同濃香型白酒品牌 4、5顯示了相同現(xiàn)象，即品牌1、2乙醇δ13C無顯著性差異，品牌4、5乙醇δ13C無顯著性差異，這種現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在異戊醇δ13C、己酸乙酯δ13C、乳酸乙酯δ13C、己酸δ13C結(jié)果中，說明5種穩(wěn)定碳同位素指標(biāo)可以區(qū)分不同酒廠的濃香型白酒品牌，但對于同一酒廠原料、工藝一致的不同濃香型白酒品牌，其區(qū)分度較差。

2.6 濃香型白酒品牌辨別

為驗證2.1～2.5結(jié)果，利用LDA方法分析5種指標(biāo)對濃香型白酒品牌判別率的影響,以乙醇δ13C指標(biāo)為原始變量，利用SPSS進行判別分析；以5種指標(biāo)為原始變量，利用SPSS進行判別分析，得到5個判別函數(shù)(表2)和組質(zhì)心處坐標(biāo)函數(shù)(表3)；將同一酒廠的品牌1、2組合為酒廠A，品牌4、5組合為酒廠B后，以5種指標(biāo)為原始變量，利用SPSS進行判別分析，得到5個判別函數(shù)(表4)和組質(zhì)心處坐標(biāo)函數(shù)(表5)。分別計算每個樣品在上述情況下其坐標(biāo)與質(zhì)心的距離，與哪個品牌的質(zhì)心最近，就判定該樣品來自哪個品牌。在上述情況下，分別利用函數(shù)l 和函數(shù)2對組質(zhì)心和樣品做散點圖，結(jié)果見圖7。最后分別計算基于乙醇δ13C指標(biāo)、5種指標(biāo)的濃香型白酒品牌正確判別率，結(jié)果見圖8。圖8中，總判別率1代表來自同一酒廠的不同品牌未組合前的總判別率，總判別率2代表來自同一酒廠的不同品牌組合后的總判別率。

表2 典型判別函數(shù)系數(shù)Table 2 Function coefficients of typical discriminant

表3 組質(zhì)心處的函數(shù)系數(shù)Table 3 Function coefficients of the centroid

表4 典型判別函數(shù)系數(shù)(組合后)Table 4 Function coefficients of typical discriminant(combined)

表5 組質(zhì)心處的函數(shù)系數(shù)(組合后)Table 5 Function coefficients of the centroid(combined)

由圖7-a可知，來自13個品牌的301個樣品可以根據(jù)判別函數(shù)得到相應(yīng)區(qū)分,品牌3、7、8、10、11、13的質(zhì)心各自遠離，且與其他品牌質(zhì)心均距離較遠，沒有重疊現(xiàn)象；品牌6、9、12的質(zhì)心距離較近，但都相互分離，沒有重疊；來自同一酒廠的品牌1、2質(zhì)心非常近，品牌4、5質(zhì)心也非常近，但它們與其他品牌質(zhì)心沒有重疊。即除了品牌1、2和品牌4、5外，其他品牌質(zhì)心均有較好分離。將來自同一酒廠的品牌1、2組合，品牌4、5組合后，圖7-b顯示，所有品牌質(zhì)心均得到較好分離。

a-組合前;b-組合后圖7 典型判別散點圖Fig.7 Scatter plot of typical discriminant

圖8顯示，單獨利用乙醇δ13C對濃香型白酒進行品牌判別時，只有品牌7、12、13的正確判別率比較高，均>75%，其他品牌正確判別率相對較低，<70%，集中于20%～60%，總正確判別率1只有44.5%；乙醇δ13C結(jié)合其他4種δ13C指標(biāo)對濃香型白酒進行品牌判別時，所有品牌正確判別率都有所提升，除來自酒廠A的不同品牌1、2和來自酒廠B的不同品牌4、5正確判別率不高外(45%～70%)，其余品牌正確判別率均提升到了80%以上，其中，品牌3、6、7、8、10、12、13更是提升到了90%以上，總正確判別率1提升到了82.7%。將同一酒廠的品牌1、2組合，品牌4、5組合后，酒廠A、酒廠B的正確判別率分別提升到87.2%、86.7%，總正確判別率2提升到91.0%。結(jié)合圖7、圖8結(jié)果說明單獨乙醇δ13C對濃香型白酒品牌的判別度不佳，結(jié)合其他4種δ13C指標(biāo)能提高對濃香型白酒品牌的判別效果；5種δ13C指標(biāo)可以判別不同酒廠的濃香型白酒品牌，但對于同一酒廠的不同品牌，其判別度較差。以上結(jié)果與2.1～2.5結(jié)果一致。

圖8 不同品牌濃香型白酒判別結(jié)果Fig.8 Identification results of different brands of SFB

3 結(jié)論

不同酒廠的濃香型白酒具有不同穩(wěn)定碳同位素特征，利用這種特征對濃香型白酒品牌進行判別發(fā)現(xiàn)：單獨乙醇δ13C對濃香型白酒品牌的正確判別度不高，結(jié)合4種風(fēng)味物質(zhì)(異戊醇，己酸乙酯，乳酸乙酯，己酸)δ13C后能顯著提高濃香型白酒品牌的正確判別率，說明白酒中多物質(zhì)δ13C相聯(lián)合的方法能有效的用于濃香型白酒品牌的辨別，并且通過乙醇δ13C和異戊醇δ13C的線性關(guān)系可初步判斷品牌濃香型白酒中是否有乙醇的外源添加，為“白酒鑒別”事業(yè)添磚加瓦。但由于同一酒廠不同品牌濃香型白酒的原料、工藝一致，導(dǎo)致二者擁有相同的穩(wěn)定碳同位素特征，使得本文判別方法在判別同一酒廠的濃香型白酒品牌時具有較大局限性，需進一步研究。