云南邊貿(mào)進(jìn)口即食食品中金黃色葡萄球菌的分離與鑒定

晏明興，陳蕓，呂廷保，關(guān)鼎儒，李杜慧，何俊蓉，梁微，楊玲春*，胡永金*，朱仁俊*

1(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明，650000)2(昆明海關(guān)技術(shù)中心，云南 昆明，650000) 3(昆明海關(guān)，云南 昆明，650000)

邊貿(mào)食品是指相連兩國(guó)在一定的邊界范圍和一定金額范圍內(nèi)免稅銷售的食品，云南邊貿(mào)進(jìn)口食品是云南邊境貿(mào)易經(jīng)濟(jì)中的重要組成部分，它具有食品來(lái)源廣，銷售和從業(yè)人員復(fù)雜等特點(diǎn)[1-3]。根據(jù)昆明海關(guān)調(diào)查表明，目前云南進(jìn)口的邊貿(mào)食品涵蓋20余類300多個(gè)品種，以糖果和巧克力、糕點(diǎn)、果蔬干、飲料、果脯5大類加工食品和大米、玉米、冷凍動(dòng)物產(chǎn)品等動(dòng)植物源性食品為主[4]。同時(shí)云南擁有4 061公里邊界線，100多個(gè)邊民互市點(diǎn)，是我國(guó)與東南亞4國(guó)的重要交通要道。利用云南邊境地區(qū)特殊的地理位置，大力發(fā)展云南邊境特色經(jīng)濟(jì)“邊貿(mào)食品”貿(mào)易，對(duì)促進(jìn)我國(guó)云南邊境地區(qū)城鎮(zhèn)化發(fā)展、穩(wěn)邊、固邊和富邊有著重要的作用[5-6]。隨著近年來(lái)云南邊境貿(mào)易經(jīng)濟(jì)和邊境游的快速發(fā)展，邊貿(mào)進(jìn)口食品安全的防控變得越來(lái)越重要，其中食源性致病菌尤為重要。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)，是一種廣泛存在于自然界中的常見食源性致病菌[7-8]。金黃色葡萄球菌引起食物中毒的原因是其會(huì)產(chǎn)生多種毒素和侵襲性酶，其中金黃色葡萄球菌分泌的毒力因子主要為溶血毒素、殺白細(xì)胞素、毒性休克綜合癥毒素-1、腸毒素、表皮剝脫毒素、耐熱核酸酶、血漿凝固酶等[9-10]。由于金黃色葡萄球菌毒性強(qiáng)、分布廣和耐高溫等特性，近年來(lái)世界各國(guó)都加強(qiáng)了對(duì)金黃色葡萄球菌的研究，從它的檢測(cè)方法、耐藥性、產(chǎn)毒性、分布狀況以及基因?qū)用娴冗M(jìn)行了全面研究[11-13]。

本研究從云南邊貿(mào)進(jìn)口即食食品出發(fā)，通過(guò)對(duì)樣品中金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)和鑒定，了解云南邊貿(mào)進(jìn)口食品中金黃色葡萄球菌的污染狀況。并通過(guò)16S rDNA分析其遺傳進(jìn)化，了解9株金黃色葡萄球菌之間的同源性和遺傳進(jìn)化差異。為全面了解云南邊貿(mào)進(jìn)口食品食源性致病菌污染狀況和制定云南邊貿(mào)食品安全防控措施提供理論技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品來(lái)源于云南河口、瑞麗、金水河、畹町以及天保5個(gè)邊境口岸城市的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、街邊小販和進(jìn)口食品特色店的云南邊貿(mào)進(jìn)口即食食品。

金黃色葡萄球菌來(lái)源于云南邊貿(mào)進(jìn)口即食食品的篩選和分離。

Baird-Parker瓊脂、BHI肉湯、血瓊脂平板、凍干血漿、TSA瓊脂，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；GP鑒定卡、無(wú)菌鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.45%～0.50%NaCl,pH 4.5～7.0),梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AC2-5S1生物安全柜,ESCO Airstream公司；LTI-700W恒溫培養(yǎng)箱,東京理化器械株式會(huì)社；Vortex 2渦旋混勻儀,艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；濁度計(jì)、全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)VITEK2-compact、PREVI Color Gram全自動(dòng)革蘭氏染片儀,生物梅里埃；Bagmixer 400cc均質(zhì)器,法國(guó)INTERSCIENCE公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)樣品的采集

樣品的采集方案參考GB 4789.1—2016設(shè)計(jì)[14]，隨機(jī)采樣于云南邊境口岸城市河口、瑞麗、金水河、天保和畹町，采樣地點(diǎn)為當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、街邊小販和邊貿(mào)食品專賣店。采好的樣品經(jīng)無(wú)菌自封袋密封后，由昆明海關(guān)技術(shù)中心微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢驗(yàn)和鑒定。

1.3.2 金黃色葡萄球菌檢測(cè)與分離

參照GB 4789.10—2016[15]對(duì)樣品進(jìn)行金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)和分離鑒定。通過(guò)金黃色葡萄球菌的選擇性和鑒別培養(yǎng)基，挑選出符合金黃色葡萄球菌典型菌落特征和顯微形態(tài)的可疑菌株。

1.3.3 金黃色葡萄球菌鑒定

對(duì)篩選出的可疑菌株進(jìn)行溶血試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)、全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)和革蘭氏染色試驗(yàn)。

1.3.4 金黃色葡萄球菌VITEK2鑒定

將可疑金黃色葡萄球菌接種于TSA瓊脂培養(yǎng)24 h 后，通過(guò)GP鑒定卡進(jìn)行全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)VITEK2-compact的鑒定。

1.3.5 金黃色葡萄球菌16S rDNA測(cè)序鑒定

將確證過(guò)的菌株送到北京擎科生物科技有限公司昆明分公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。16S rDNA擴(kuò)增引物為1492R和27F，引物序列分別為27F：(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)；1492R：(5′-GGC TACCTTGTTACGACTT-3′)[16]。根據(jù)劉康軍等[17]、李英軍等[18]、郝悅等[19]的PCR實(shí)驗(yàn)參數(shù)，本次研究PCR反應(yīng)體系25 μL：MIX 12.5 μL，dd H2O 9.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性5 min，(95 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min 40 s)×34，72 ℃，5 min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBL數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)一步確證菌株。

1.3.6 構(gòu)建金黃色葡萄球菌系統(tǒng)發(fā)育樹

由1492R和27F引物擴(kuò)增出的16S rDNA測(cè)序，用ContigExpress拼接測(cè)序結(jié)果。將整理好的序列用BioEdit進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，用Clustalx的Alignment對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，并利用MEGA的Neighbor Joining模式構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.7 金黃色葡萄球菌16S rDNA序列同源性分析

分別將9株金黃色葡萄球菌的16S rDNA測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，并從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選同源性高和出現(xiàn)頻率相同的10株金黃色葡萄球菌16S rDNA和本次實(shí)驗(yàn)的序列進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果用MEGA的Distnce模式構(gòu)建細(xì)菌之間的遺傳差異性和同源性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)ContigExpress、Excel、MEGA、NCBI等軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南邊貿(mào)進(jìn)口食品樣品采集

本次實(shí)驗(yàn)采集的樣品主要來(lái)源于東南亞的越南、緬甸、老撾和泰國(guó)4國(guó)，共采集進(jìn)口邊貿(mào)食品樣品459份。其中越南食品257份，緬甸食品84份，老撾食品44份，泰國(guó)食品64份，其他來(lái)源食品10份。并根據(jù)采集樣品所具有的共同特性，將采集好的459份邊貿(mào)進(jìn)口即食食品樣品分為糕點(diǎn)及餅干、調(diào)味品、糖果與巧克力、果蔬干制品、糧食制品、堅(jiān)果、飲料、水產(chǎn)品制品、膨化食品以及罐頭制品，采樣結(jié)果見表1。

表1 樣品采集 單位：份

2.2 云南邊貿(mào)進(jìn)口即食食品中金黃色葡萄球菌的分離與鑒定結(jié)果

對(duì)459份云南邊貿(mào)進(jìn)口即食食品進(jìn)行金黃色葡萄球菌的檢測(cè)，其中2份樣品檢出金黃色葡萄球菌可疑菌株，并從2份陽(yáng)性樣品中分離出可疑黃色葡萄球菌9株，其中從泰國(guó)巧克力食品上挑選出4株并命名為SA-1、SA-2、SA-3、SA-4，從越南椰子糖上挑選出5株，并命名為SA-5、SA-6、SA-7、SA-8、SA-9。對(duì)9株可疑金黃色葡萄球菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9株可疑金黃色葡萄球菌都發(fā)生溶血性反應(yīng)、血漿凝固酶反應(yīng)為陽(yáng)性、全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)43種生化試劑生化分型鑒定結(jié)果符合金黃色葡萄球菌、VITEK2-compact鑒定陽(yáng)性，同時(shí)9株金黃色葡萄球菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的分子質(zhì)量在1 500 bp左右，16S rDNA鑒定為金黃色葡萄球菌，鑒定結(jié)果的置信度都在90%～100%，詳細(xì)信息見表2和圖1。

表2 云南邊貿(mào)進(jìn)口即食食品中金黃色葡萄球菌分離及鑒定Table 2 identification and isolation of Staphylococcus aureus in ready-to-eat food imported from Yunnan border trade

a-革蘭氏染色;b-溶血性;c-16S rDNA電泳圖圖1 鑒定結(jié)果Fig.1 Identification result注：M為marker；1～9為9株金黃色葡萄球菌SA-1～SA-9

2.3 云南邊貿(mào)進(jìn)口即食食品中金黃色葡萄球菌污染狀況

從459份云南邊貿(mào)進(jìn)口即食食品中的2份樣品中檢出金黃色葡萄球菌，總檢出率為0.43%(2/459)。2份陽(yáng)性樣品均為糖果和巧克力，均采集于云南天保口岸，在糖果和巧克力中的檢出率為3.8%。其中一份巧克力來(lái)源于泰國(guó)，其檢出率為本次實(shí)驗(yàn)泰國(guó)食品總數(shù)的1.5%，一份越南椰子糖來(lái)源于越南，其檢出率為本次實(shí)驗(yàn)越南食品總數(shù)的0.38%，詳細(xì)信息見表3。與楊菁等[20]對(duì)2016—2018年云南省食品中金黃色葡萄球菌污染狀況研究中金黃色葡萄球菌總檢出率為2.60%相比，本次云南邊貿(mào)進(jìn)口食品中金黃色葡萄球菌的總檢出率較低，但因越南和泰國(guó)進(jìn)口邊貿(mào)食品的樣品采集總數(shù)有差異，不能進(jìn)一步分析兩國(guó)進(jìn)口食品的污染狀況。從樣品種類來(lái)分析云南邊貿(mào)進(jìn)口食品中金黃色葡萄球菌的污染狀況，本次金黃色葡萄球菌都來(lái)源于邊貿(mào)進(jìn)口糖類食品。同時(shí)通過(guò)本次研究，說(shuō)明云南邊貿(mào)進(jìn)口食品中存在一定的金黃色葡萄球菌污染風(fēng)險(xiǎn)。

表3 云南邊貿(mào)進(jìn)口即食食品中金黃色葡萄球菌Table 3 Staphylococcus aureus in ready-to-eat food imported from Yunnan border trade

2.4 16S rDNA測(cè)序結(jié)果分析

2.4.1 系統(tǒng)發(fā)育樹

為了解云南邊貿(mào)進(jìn)口食品中金黃色葡萄球菌的污染來(lái)源，通過(guò)16S rDNA序列來(lái)分析菌株之間的遺傳進(jìn)化差異，來(lái)判斷菌株之間來(lái)源差異。用從云南邊貿(mào)進(jìn)口食品中分離的9株金黃色葡萄球菌的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9株從云南邊貿(mào)進(jìn)口食品中檢出的金黃色葡萄球菌可分為3簇，其中SA-2、SA-7為一簇，SA-5、SA-3、SA-4為一簇，SA-6、SA-9、SA-1、SA-8為一簇。并對(duì)其遺傳進(jìn)化關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)9株金黃色葡萄球菌與所檢出樣品來(lái)源國(guó)籍無(wú)明顯的遺傳進(jìn)化差異關(guān)系，說(shuō)明9株菌株可能來(lái)源于境內(nèi)食品在運(yùn)輸和銷售過(guò)程中的二次污染。

為泰國(guó)巧克力食品上分離出的菌株；為越南椰子糖上分離出的菌株圖2 九株金黃色葡萄球菌遺傳進(jìn)化關(guān)系Fig.2 Genetic evolution of 9 strains of Staphylococcus aureus

2.4.2 同源性分析

為了進(jìn)一步了解云南邊貿(mào)進(jìn)口食品中金黃色葡萄球菌的污染來(lái)源，將拼接好的9株金黃色葡萄球菌

16S rDNA序列分別與NCBI進(jìn)行比對(duì)，挑選出10株相似性最高且出現(xiàn)頻率相同的金黃色葡萄球菌菌株(NR115606.1、NR113956.1、NR036828.1、NR037007.1、NR043146.1、NR036904.1、NR027519.1、NR024665.1、NR113957.1、NR118450.1)進(jìn)行同源性和遺傳差異性的分析,如表5所示，結(jié)果表明，19株金黃色葡萄球菌的遺傳差異為0～0.79，同源性>93%，說(shuō)明9株從越南和泰國(guó)邊貿(mào)進(jìn)口食品中檢出的金黃色葡萄球菌之間遺傳差異小、同源性高，進(jìn)一步說(shuō)明9株菌株可能來(lái)源于境內(nèi)食品在運(yùn)輸和銷售過(guò)程中的二次污染。

表5 同源性分析Table 5 Homology analysis

3 討論與結(jié)論

隨著我國(guó)“一帶一路”、西部大開發(fā)和開放力度的加大，地處我國(guó)西南邊陲與東南亞3國(guó)相連的云南近年來(lái)邊境貿(mào)易經(jīng)濟(jì)發(fā)展快速，其中具有異國(guó)特色的進(jìn)口邊貿(mào)食品貿(mào)易就是重要的組成部分。隨著我國(guó)對(duì)進(jìn)口即食食品需求的增加，人們對(duì)進(jìn)口食品安全越來(lái)越關(guān)注[21]。例如，董國(guó)富等[22]在1993年就開始針對(duì)廣西提出中越邊境貿(mào)易中食品衛(wèi)生安全狀況的研究，劉本軍[23]提出了“堵疏結(jié)合, 疏導(dǎo)為主, 嚴(yán)格把關(guān), 重點(diǎn)幫扶”的邊境食品安全監(jiān)管新途徑等管理政策。同時(shí)近年科研工作者已開始進(jìn)行針對(duì)邊貿(mào)進(jìn)口食品中食源性致病菌污染狀況的研究，王夢(mèng)琦等[24]和何成偉等[25]均對(duì)進(jìn)口食品中細(xì)菌污染狀況進(jìn)行了研究。

本文對(duì)云南邊貿(mào)進(jìn)口食品中金黃色葡萄球菌的研究，從對(duì)樣品的采集、檢驗(yàn)、分離、鑒定，到進(jìn)化同源性分析的一系列研究，保證了云南邊貿(mào)進(jìn)口食品中金黃色葡萄球菌的具體來(lái)源和可溯源性。同時(shí)本次實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)GB 4789.10—2016、全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)、微生物全自動(dòng)鑒定儀VITEK 2-compact、16S rDNA測(cè)序多種鑒定方法同時(shí)鑒定，保障了檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

本文對(duì)云南4個(gè)邊境口岸的459份進(jìn)口邊貿(mào)食品進(jìn)行金黃色葡萄球菌檢測(cè)，其中陽(yáng)性食品2份，檢出率占本次總樣品數(shù)的0.43%、糖類食品的3.84%。經(jīng)過(guò)多元識(shí)別和遺傳進(jìn)化關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)菌株之間不存在明顯的樣品來(lái)源進(jìn)化差異，由此推測(cè)這些菌株的來(lái)源可能存在食品運(yùn)輸、貯存和銷售過(guò)程中境內(nèi)的二次污染。本研究為今后云南邊貿(mào)進(jìn)口食品多種食源性致病菌檢測(cè)研究、構(gòu)建云南邊貿(mào)進(jìn)口食品食源性致病菌溯源技術(shù)、云南邊貿(mào)進(jìn)口食品食源性致病菌安全預(yù)警平臺(tái)和制定邊貿(mào)食品食源性致病菌相關(guān)政策提供了一定的理論和技術(shù)支持。