紅茶菌中細(xì)菌纖維素產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及其發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型構(gòu)建

余瞻，趙福權(quán)，徐成龍，王珍珍，張澤鑫，沙如意*，毛建衛(wèi),2*

1(浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同中心， 浙江 杭州，310023)2(浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 紹興，312000)

細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose，BC)是由微生物合成的天然生物納米高聚物，因其具有高結(jié)晶度、高聚合度，強(qiáng)親水持水能力，較高的生物相容性、適應(yīng)性和良好的生物可降解性[1-2]，黏稠性、凝膠性、穩(wěn)定性和完全不被人體消化[3]等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，如以椰子水為原料發(fā)酵而成的椰果[4],代替肥肉制備低熱量發(fā)酵肉腸[5],作為食品添加劑添加進(jìn)酸奶[6]及冰淇凌中[7]等。同時(shí)作為一種膳食纖維，BC是由美國食品藥品監(jiān)督管理局公認(rèn)的安全食品添加劑[8]。目前限制BC廣泛應(yīng)用的主要因素在其產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高等方面。要實(shí)現(xiàn)BC的工業(yè)化生產(chǎn)，尋找合適的產(chǎn)生菌和產(chǎn)量的提高顯得至關(guān)重要。

產(chǎn)BC的菌屬有醋酸桿菌屬、根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、固氮菌屬、氣桿菌屬和產(chǎn)堿菌屬等[9-10]，但其中真正能應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的菌種卻很少。趙航等[11]和尹園等[12]分別利用葡糖醋桿菌J2-1和居間駒形氏桿菌進(jìn)行發(fā)酵，通過對發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源、乙醇、有機(jī)酸及無機(jī)鹽的優(yōu)化，使得細(xì)菌纖維素產(chǎn)量得到有效提高，分別達(dá)到9.34和15.68 g/L。紅茶菌[13-14]是獲得高產(chǎn)BC菌種的良好來源。它是一種由糖茶水經(jīng)酵母、醋酸菌以及少量的乳酸菌的共生菌群發(fā)酵而成的茶飲料，在中國已有100多年的使用歷史。盡管目前已有一些利用紅茶菌選育優(yōu)良菌株的研究[15-16]，但BC的產(chǎn)量仍無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。因此本研究以紅茶菌發(fā)酵液中各菌種為研究對象，經(jīng)篩選、分離、鑒定，獲得BC產(chǎn)生菌株，并對該菌株發(fā)酵過程中的菌體生長、產(chǎn)物生成及底物消耗動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行構(gòu)建和研究，分析發(fā)酵過程中各指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化，為BC發(fā)酵工藝優(yōu)化及其工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

紅茶菌，由浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；蔗糖、瓊脂、蛋白胨、葡萄糖、NaOH、MgSO4、K2HPO4，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；冰醋酸、制霉菌素，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，酵母浸粉0.5 g，蛋白胨0.5 g，檸檬酸0.1 g，MgSO40.5 g，制霉菌素500單位/L，水100 mL，pH 6.0。

分離培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，酵母浸粉0.5 g，蛋白胨0.5 g，K2HPO40.1 g，醋酸0.15 mL，瓊脂2 g，水100 mL，pH 5.0。

發(fā)酵液體培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，酵母浸粉1 g，MgSO41 g，K2HPO40.1 g，無水乙醇3 mL，水100 mL。

發(fā)酵固體培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，酵母浸粉1 g，MgSO41 g，K2HPO40.1 g，無水乙醇3 mL，瓊脂2 g，水100 mL。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，酵母浸粉1 g，無水乙醇3 mL，水100 mL，pH 6.0。

以上培養(yǎng)基均121 ℃滅菌15 min;無水乙醇均在各培養(yǎng)基滅菌后，無菌條件下進(jìn)行添加。

1.2 儀器與設(shè)備

GZX-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱、YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；Allegra X-12R冷凍離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特有限公司；EM-1011電子顯微鏡，日本電子公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)細(xì)菌纖維素菌株的篩選

將紅茶菌接于富集培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min，搖床培養(yǎng)24 h。隨后準(zhǔn)確移取100 μL梯度稀釋后的菌液至分離培養(yǎng)基中涂布分離[17]。挑選分離培養(yǎng)基平板上生長較好的單菌落，于發(fā)酵液體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)，觀察并挑選出具有菌膜的菌株即為BC生產(chǎn)菌株。將篩選所得菌株按1%的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，每組3個(gè)平行，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，取出BC膜，經(jīng)過0.1 mol/L的NaOH溶液處理后，烘干稱量挑選產(chǎn)量高且遺傳性狀穩(wěn)定的菌株，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 菌種鑒定

1.3.2.1 形態(tài)及生理生化特征鑒定

將挑選出的菌株分別同時(shí)接種于發(fā)酵固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，記錄菌落大小、形狀、顏色、液面是否有菌醭或菌島，底層是否有沉淀等。對菌種進(jìn)行革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)，記錄菌體大小、形狀、繁殖方式等。

根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[18]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[19]進(jìn)行生理生化特征檢測，主要包括：色素實(shí)驗(yàn)、生酮實(shí)驗(yàn)、唯一氮源實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)5-酮基葡萄糖酸鹽、運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)、高糖實(shí)驗(yàn)、乙醇生長實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)醋酸定性試驗(yàn)、氧化乙酸實(shí)驗(yàn)以及產(chǎn)BC試驗(yàn)等。

1.3.2.2 分子生物學(xué)鑒定

對挑選出的菌株進(jìn)行16S rDNA序列檢測(委托生工生物工程(上海)股份有限公司)，將菌株測序的序列提交至美國國立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information, NCBI)Genbank數(shù)據(jù)庫，采用基本檢索工具進(jìn)行同源性序列比對相似性分析，并利用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA 8.0構(gòu)建16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，采用鄰接(neighbor-joining, NJ)法進(jìn)行菌株16S rDNA基因分析，以確定菌株種屬。

1.3.3 細(xì)菌纖維素的發(fā)酵制備

將篩選所得菌株接種至種子培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min恒溫活化培養(yǎng)24 h。隨后將活化后的種子液以6%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)14 d獲得BC膜，每隔24 h取樣測量菌體濃度、還原糖含量以及BC產(chǎn)量并記錄。每個(gè)菌株做3個(gè)平行。

1.3.4 菌體濃度的測定

在培養(yǎng)基(培養(yǎng)14 d)中加入2 mL在0.1 mol/L的醋酸鉀-醋酸緩沖液中活化完全的纖維素酶溶液(100 IU/g)，于50 ℃，pH 5.0的條件下充分水解 2 h。取適量稀釋后水解液在610 nm波長下測量菌體濃度OD610。

1.3.5 還原糖含量的測定

使用DNS法[20]測定發(fā)酵液中還原糖含量。

1.3.6 細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的測定[21]

將BC膜取出水洗后，置于0.1 mol/L的NaOH溶液溶液中，100 ℃水浴30 min以除去殘余的培養(yǎng)基和細(xì)菌殘骸，用純水反復(fù)洗滌或浸泡直至中性，得到白色透明狀的BC膜。將膜置于烘箱中105 ℃烘干至恒重，稱量記錄。

1.3.7 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立

利用Origin 8.0 軟件對BC發(fā)酵過程中菌體生長、產(chǎn)物生成以及底物消耗的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，分別建立菌體生長模型、產(chǎn)物生成模型以及底物消耗動(dòng)力學(xué)模型。

1.3.7.1 菌體生長動(dòng)力學(xué)模型

選用Logistic方程模擬菌體生長趨勢，建立菌體生長模型。菌體生長模型的微分表達(dá)式如公式(1)所示：

(1)

公式(1)積分可得公式(2)：

(2)

式中：X0為菌體初始生物量，OD值；Xm為菌體最大生物量，OD值；X為t時(shí)刻的菌體生物量，OD值；μm為最大比生長速率，h-1；t為發(fā)酵時(shí)間，d。

將公式(2)積分變形得到公式(3):

(3)

1.3.7.2 產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型

選取Luedeking-Piret方程[30]來描述BC產(chǎn)物的生成模型，如公式(4)所示：

(4)

式中：P為產(chǎn)物濃度，g/L；X為菌體生物量，OD值；t為發(fā)酵時(shí)間，d；α為與菌體生長有關(guān)的合成常數(shù)；β為與菌體量有關(guān)的合成常數(shù)。

將公式(1)、(2)代入公式(4)式并積分得公式(5)：

(5)

(6)

1.3.7.3 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型

底物消耗的模型表達(dá)式如公式(7)所示：

(7)

式中：S為底物濃度，g/100mL；YX/S為菌體對底物的得率系數(shù)；YP/S為產(chǎn)物對底物的得率系數(shù)；m為細(xì)胞維持系數(shù)；t為時(shí)間，d。

將公式(4)代入公式(7)可得公式(8)：

(8)

(9)

(10)

分別將公式(1)、(2)代入公式(9)并積分可得

S=S0-k1C(t)-k2D(t)，即如公式(11)所示：

(11)

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)特征觀察

采用涂布分離法分離得到5株BC生產(chǎn)菌株，將它們分別命名為C1、C2、C3、C4、C5，并在相同的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，形態(tài)特征和產(chǎn)BC的能力如表1所示。5株菌均為白色圓形菌落，菌落光滑不透明且邊緣整齊，微凸黏稠，無沉淀和菌醭，在培養(yǎng)特征以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征上并無明顯差別，初步判定為同一菌屬。5株菌發(fā)酵4 d后都具有比較良好的BC的產(chǎn)量，其中C1菌株產(chǎn)量最高。進(jìn)一步對C1菌株進(jìn)行電鏡觀察，如圖1所示，C1菌體表面光滑，呈近似棒狀，菌體之間有絲狀物連接，符合產(chǎn)纖維類桿菌菌細(xì)胞及形態(tài)的特征。

表1 分離菌株細(xì)菌纖維素產(chǎn)量及形態(tài)特征觀察Table 1 Morphological characteristics and the production of bacteria cellulose of the isolated strains

圖1 C1電鏡觀察圖Fig.1 Electron microscope picture of C1

2.2 菌株生理生化特征

從5株菌中挑選BC產(chǎn)量最高的C1進(jìn)一步進(jìn)行鑒定實(shí)驗(yàn)。對C1進(jìn)行生理生化鑒定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。該菌株產(chǎn)生5-酮基葡萄糖酸鹽；沒有生酮作用；不能氧化利用乙酸；不產(chǎn)生褐色素；能在乙醇中生長；不利用硫酸銨作為唯一氮源，即不屬于氮源自養(yǎng)型微生物；不具有鞭毛，不具有運(yùn)動(dòng)性；能產(chǎn)生醋酸；在高糖環(huán)境下不能生存；革蘭氏染色呈陰性。將實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對比，得出該菌株為醋酸菌屬。

表2 菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical test results of strains

2.3 分子生物學(xué)鑒定

利用ITS1和ITS4、NS1和NS6兩對引物擴(kuò)增供試菌16S rDNA近5′端的區(qū)域，得到約600、1 300 bp片段，供試菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1和2、16S rDNA電泳結(jié)果見圖2。將該菌序列結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，同源菌株基因用MEGA 8軟件處理，得到系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖3所示，C1與木糖駒形氏桿菌(Komagataeibacterxylinus)在同一分支且具有極高同源相似性。結(jié)合菌株C1形態(tài)學(xué)特征分析，將菌株C1鑒定為木糖駒形氏桿菌。

圖2 供試菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1和2、16S rDNA凝膠電泳圖Fig.2 The internal transcribed spacers 1 and 2 and 16S rDNA gel electrophoresis of the tested bacteria

圖3 C1菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of C1

2.4 細(xì)菌纖維素發(fā)酵過程中各參數(shù)的變化

糖駒形氏桿菌發(fā)酵過程中pH、菌體濃度、BC產(chǎn)量以及還原糖消耗量變化如圖4所示。

圖4 細(xì)菌纖維素發(fā)酵過程中各參數(shù)變化Fig.4 Changes of various parameters during bacteria cellulose fermentation

由圖4可知，木糖駒形氏桿菌的菌體生長總體呈現(xiàn)S型曲線，在1～7 d處于對數(shù)生長期，7 d之后趨于平緩進(jìn)入平穩(wěn)期。同時(shí)隨著菌體濃度上升，BC的產(chǎn)量同樣呈現(xiàn)上升趨勢，還原糖含量和pH值呈下降趨勢；當(dāng)菌體進(jìn)入穩(wěn)定期后，BC生成速率大幅提高，還原糖的消耗速率以及pH值的變化逐漸趨勢平緩。發(fā)酵初期菌種生長代謝旺盛，大量產(chǎn)酸，導(dǎo)致pH快速下降；而隨著發(fā)酵過程的繼續(xù)推進(jìn)，菌體生長逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期，菌種少量產(chǎn)酸甚至不產(chǎn)酸，pH也相應(yīng)的緩慢下降至穩(wěn)定。發(fā)酵第14天產(chǎn)BC達(dá)到最高產(chǎn)量4.26 g/L。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出在BC的發(fā)酵過程中還原糖的消耗主要被用于菌體的生長，而BC在發(fā)酵初期隨著菌體的生長而緩慢合成，其合成速率主要取決于菌體濃度的多少。木糖駒形氏桿菌產(chǎn)BC的發(fā)酵過程屬于部分生長偶聯(lián)型，這與察可文等[22]認(rèn)為的BC生成與菌體細(xì)胞的生長以及細(xì)胞的濃度均有相關(guān)性相一致。而邵偉等[23]，齊香君等[24]通過對木醋桿菌發(fā)酵產(chǎn)BC過程中各參數(shù)進(jìn)行監(jiān)測，根據(jù)相同時(shí)間內(nèi)BC干重的變化趨勢與菌體生長趨勢相似，推測BC的生成與細(xì)胞的生長呈相關(guān)關(guān)系，BC是細(xì)胞代謝的產(chǎn)物，BC的發(fā)酵過程屬于生長偶聯(lián)型。這主要是由利用的菌種和培養(yǎng)條件差異所致。

2.5 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型構(gòu)建

2.5.1 菌體生長動(dòng)力學(xué)模型

Monod模型是最早應(yīng)用于菌體生長的模型，但是該模型把限制性底物的濃度作為影響菌體生長過程中比生長速率的唯一因素，具有較大的局限性。Logistic模型則是一個(gè)典型的S型曲線，在符合菌體生長趨勢的同時(shí)[25-26]，也能夠較好地反映菌體自身生長而表現(xiàn)出對自己的抑制作用[27]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，木糖駒形氏桿菌的生長同樣呈現(xiàn)S型，因而選用Logistic模型來描述菌體的生長。

將X0=0.109，Xm=1.618，μm=0.791代入公式(2)得到菌體的生長動(dòng)力學(xué)模型：

菌體的生長動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線如圖5所示，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，說明該方程的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值擬合良好，可以以此描述BC生長控制的模型。

圖5 菌體生長動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線Fig.5 The fitting curve of kinetic model of bacterial growth

2.5.2 產(chǎn)物生成模型

在分批發(fā)酵過程中，產(chǎn)物的生成與菌體生長的關(guān)系分為3種：生長偶聯(lián)型、非生長偶聯(lián)型和部分生長偶聯(lián)型[28-29]。根據(jù)前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，BC的產(chǎn)量在菌體對數(shù)生長期和穩(wěn)定期均持續(xù)上升，說明BC的合成與細(xì)菌的生長及其菌體濃度均具有相關(guān)性，屬于部分生長偶聯(lián)型。因而選取Luedeking-Piret方程[30]來描述BC的產(chǎn)物生成。

將X0=0.109，Xm=1.618，μm=0.791及β，α代入公式(5)得到BC產(chǎn)物生成的數(shù)學(xué)模型：

BC生產(chǎn)量的擬合曲線如圖6所示，相關(guān)系數(shù)R2=0.958 9，結(jié)果表明理論值與實(shí)驗(yàn)值擬合良好，該方程能夠較好地描述發(fā)酵過程中BC產(chǎn)物的生成情況。

圖6 產(chǎn)物生成模型擬合曲線Fig.6 The fitting curve of product generation model

2.5.3 底物消耗模型

一般認(rèn)為在發(fā)酵過程中，限制性底物的消耗主要分為3個(gè)部分：菌體生長、產(chǎn)物合成以及細(xì)胞維持正常生命活動(dòng)的消耗[31]。因而底物消耗模型由產(chǎn)物生成及菌體生長模型結(jié)合得出。

隨后以S-S0-k2D(t)～C(t)作圖，擬合后得到：S-S0-k2D(t)=-0.328 2C(t)-0.041 9，由此可得k1=0.328 2。將X0=0.109，Xm=1.618，μm=0.791及k1，k2代入公式(11)，得到葡萄糖底物消耗的數(shù)學(xué)模型：

-0.222 12×ln(0.932 63+0.067 37e0.791t)

葡萄糖底物消耗的擬合曲線如圖7所示，相關(guān)系數(shù)R2=0.962 3，說明該方程與實(shí)驗(yàn)測量值擬合較好，能夠以此方程為參考描述發(fā)酵過程中葡萄糖底物的消耗情況。

圖7 底物消耗模型擬合曲線Fig.7 The fitting curve of kinetic model of substrate consumption

3 結(jié)論

通過對紅茶菌中菌種進(jìn)行篩選，獲得5株產(chǎn)BC菌株C1、C2、C3、C4、C5，隨后對這5株菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，初步判定為同一菌屬，符合產(chǎn)纖維類醋酸菌細(xì)胞及形態(tài)特征。隨后通過生理生化實(shí)驗(yàn)以及16S rDNA序列分析將BC產(chǎn)量較高的菌株C1鑒定為木糖駒形氏桿菌。

以篩選所得木糖駒形氏桿菌為出發(fā)菌株發(fā)酵制備BC，監(jiān)測發(fā)酵過程中各指標(biāo)的變化，分別構(gòu)建發(fā)酵產(chǎn)BC的菌體生長、產(chǎn)物生成以及底物消耗動(dòng)力學(xué)模型。結(jié)果表明木糖駒形氏桿菌發(fā)酵14 d產(chǎn)BC最高產(chǎn)量為4.26 g/L，產(chǎn)量良好，具有進(jìn)一步的應(yīng)用價(jià)值，BC的發(fā)酵合成屬于部分生長偶聯(lián)型。構(gòu)建的3個(gè)模型相關(guān)系數(shù)R2分別為0.998、0.958 9和0.962 3，說明實(shí)驗(yàn)值與模型擬合良好，能可靠地描述發(fā)酵制備BC過程中各參數(shù)變化，為BC產(chǎn)量的提升以及進(jìn)一步工業(yè)生產(chǎn)提供技術(shù)支持與理論指導(dǎo)。后續(xù)研究中可根據(jù)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型對BC發(fā)酵過程進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控如，建立流加發(fā)酵工藝等，以進(jìn)一步提高細(xì)菌菌纖維素的產(chǎn)量。