不同貯藏條件下南美白對蝦中生物胺的變化

王靜玉，曲映紅,2*，劉志東，陳舜勝,2，施文正,2，周惠敏

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306) 3(中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海，200090)

生物胺是一類具有生物活性的低分子質量含氮有機化合物，在水產(chǎn)品中普遍存在[1]。水產(chǎn)品中常見有色胺(tryptamine，TRM)、苯乙胺(phenylethylamine，PHE)、腐胺(putrescine，PUT)、尸胺(cadaverine，CAD)、組胺(histamine，HIS)、章魚胺(octopamine, OCT)、酪胺(tyramine，TYM)和亞精胺(spermidine，SPD)、精胺(spermine，SPM)等[2-3]。人體內源性生物胺是活性細胞內不可或缺的化合物，可以調節(jié)血壓和血糖濃度，調節(jié)DNA、RNA和蛋白質合成，以及起抗氧化作用，但攝入過多生物胺會導致中毒以及嚴重的公共健康和安全問題[4]。生物胺可作為水產(chǎn)品新鮮度的重要指標，而生物胺的安全限量沒有統(tǒng)一的國際標準。美國食品藥物管理局限定人體攝入組胺和酪胺的含量不超過50 mg/kg，酪胺和苯乙胺安全閾值的參考上限分別為100～800 mg/kg和30 mg/kg[5], 歐洲食品安全局限定水產(chǎn)品中組胺的含量不超過100 mg/kg[6]。

南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)又稱凡納濱對蝦，營養(yǎng)豐富，含有大量的蛋白質、游離氨基酸和低含量的飽和脂肪酸。水產(chǎn)品中生物胺的形成受原料差異、微生物及貯藏條件的影響[7]，在貯藏過程中，其蛋白質會在內生或外源蛋白水解酶的作用下水解產(chǎn)生多種游離氨基酸，微生物釋放的氨基酸脫羧酶會作用于氨基酸而產(chǎn)生生物胺[8-9]。水產(chǎn)品中游離氨基酸的含量會隨著貯藏時間的延長而逐漸增多[10]，且不合適的貯藏溫度和貯藏時間會促進微生物的生長繁殖，從而使水產(chǎn)品中生物胺的含量越來越多，因此貯藏條件是影響水產(chǎn)品中生物胺含量的關鍵因素。生物胺通常在鮮魚和貝類貯藏過程中高度穩(wěn)定，而在蝦類中較易受外部條件影響而變化[11]，且其與蝦的品質變化具有相關性[12]。包玉龍等[13]研究表明，海產(chǎn)品在貯藏過程中生物胺含量的變化與一些感官和理化指標密切相關，如硫代巴比妥酸 (thiobarbituric acid，TBA)值、總揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen, TVB-N)值、pH值和菌落總數(shù)(total viable counts, TVC)等。

實驗通過研究南美白對蝦在4 ℃ 和 25 ℃ 下貯藏過程中生物胺的變化情況，了解貯藏溫度和貯藏時間對水產(chǎn)品中生物胺含量的影響，并進一步考察南美白對蝦在 4 ℃ 和 25 ℃ 下貯藏過程中pH值, TBA值, TVB-N 和菌落總數(shù)的變化及其與生物胺含量的關系，從而為生物胺的監(jiān)測及控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3 kg南美白對蝦，購于中國上海市浦東新區(qū)養(yǎng)殖場，并充氧運回實驗室。

生物胺標準品∶組胺鹽酸鹽(純度98%)、β-苯乙胺鹽酸鹽(純度98.6%)、酪胺鹽酸鹽(純度99.1%)、腐胺鹽酸鹽(純度99.8%)、尸胺鹽酸鹽(純度99.7%)、色胺鹽酸鹽(純度98%)、精胺鹽酸鹽(純度98.8%)和亞精胺鹽酸鹽(純度99.9%),美國Sigma公司;衍生試劑丹磺酰氯(dansyl chloride, DNS-Cl)、乙腈(色譜純)、乙醚(分析純)、三氯甲烷(分析純)，Sigma-Aldrich公司；丙酮(分析純)、正丁醇(分析純)、正己烷(分析純)、氨水(分析純) (25%)、乙酸銨(色譜純)，上海泰坦科技股份公司；三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA),NaOH, 鹽酸、TBA、營養(yǎng)瓊脂、飽和碳酸氫鈉、NaCl，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

H2050R高速冷凍離心機，長沙湘儀有限公司;HAC-36C氮吹儀，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；實驗室 pH 計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋，天津歐諾儀器儀表有限公司；Milli-Q超純水器，美國Millipore公司；QUINTIX224-1CN電子分析天平，德國賽多利斯公司；KO5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;W2695 高效液相色譜儀(配備紫外檢測器、熒光檢測器和色譜工作站)、Symmetry C18(柱長250 mm, 柱內徑4.6 mm, 柱填料粒徑5 μm), 美國Waters公司;濾膜針頭濾器 (13 mm, 0.22 μm), 上海安譜實驗科技股份有限公司；A25實驗室小型均質機，上海?？嗽O備有限公司；垂直流 SW-CJ-2F 超凈工作臺，蘇州尚田潔凈技術有限公司;UV-245紫外分光光度計, 日本津島公司;Kjeltec2300全自動凱氏定氮儀, 丹麥FOSS公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 pH值、TBA值、TVB-N值和菌落總數(shù)的測定

參考并改進 GB 5009.237—2016《食品安全國家標準食品pH值的測定》[14]和FAN等[15]的方法對南美白對蝦進行pH值測定。稱取2.00 g樣品，加入20 mL 蒸餾水進行均質后，在10 000 r/min的條件下離心10 min，過濾取上清液測定pH。

TVB-N值參考ANTONACOPOULOS等[16]和GB 5009.228—2016《食品安全國家標準食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[17]測定。

TBA值參考FAUSTMAN等[18]的方法進行測定。準確稱取 2.00 g 樣品，加入 4 mL 蒸餾水和 5 mL三氯乙酸溶液(200 g/L)，均質1 min后靜置1 h，4 ℃條件下冷凍離心10 min(8 000 r/min)。過濾后取其上清液，并用三氯乙酸溶液定容至10 mL，振蕩混勻后取5 mL并加入5 mL TBA溶液(0.02 mol/L)，超聲1 min 后置于沸水中加熱 20 min，流水冷卻 5 min，532 nm 處測其吸光度A。

菌落總數(shù)(total viable counts, TVC)的測定即為需氧菌平板計數(shù)[19], 參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)的測定》[20]進行計算。稱取5 g樣品，加入45 mL無菌生理鹽水(8.5 g/L)均質 2 min 后，用生理鹽水進行10 倍稀釋，取 1 mL 連續(xù)稀釋液涂于平板計數(shù)瓊脂上，37 ℃下培養(yǎng)48 h后進行菌落總數(shù)計算，以lg CFU/g表示。

1.3.2 生物胺的測定

參考張殿偉等[21]和HAO等[22]的方法并做修改，建立超聲輔助固相分散萃取結合反相高效液相色譜測定南美白對蝦中的生物胺。精確稱量5 g[(0.100 0±0.000 1)g]的等分樣品于離心管中，加入20 mL 三氯乙酸溶液(50 g/L)，均質2 min，超聲30 min，離心10 min(5 000 r/min)。將上清液轉移至50 mL容量瓶中，并用三氯乙酸溶液定容。移取10 mL上述提取試樣溶液至離心管中，加入10 mL正己烷以除去脂肪，超聲10 min后待靜置分層，棄去上層有機相。移取5 mL上述除脂肪后的試樣溶液轉移到含有100 mg C18和100 mg PSA的50 mL離心管中，振蕩混勻 5 min后超聲10 min，離心5 min(8 000 r/min)。收集上清液，用NaOH(2 mol/L)將凈化后的溶液pH提高到12，用乙腈定容至5 mL，超聲處理5 min，待衍生。

分別移取上述提取液和混標溶液1.0 mL，放入10 mL具塞試管中，依次加入1 mL飽和碳酸氫鈉溶液和100 μL 1mol/L NaOH溶液，調節(jié)pH至 10.5，再加入1 mL丹磺酰氯溶液(10 mg/mL，溶于丙酮)，振蕩混勻，超聲2 min后60 ℃水浴反應20 min。衍生完畢后，加入200 μL氨水(25%)，振蕩超聲1 min，避光靜置 30 min以終止衍生。向試管中分別加入0.5 g NaCl，振蕩超聲至NaCl溶解，加入5 mL乙醚，振蕩混勻，超聲2 min，靜置分層，吸出上層有機相(乙醚層)，在40 ℃水浴氮氣吹干，加入1 mL乙腈振蕩并超聲至殘留物溶解，0.22 μm濾膜針頭濾器過濾至進樣瓶，待高效液相色譜進行測定。高效液相色譜條件為色譜柱：Waters Symmetry C18色譜柱(柱長250 mm,柱內徑4.6 mm,柱填料粒徑5 μm)；254 nm處通過PDA檢測進行定量，柱溫 35 ℃；進樣量 10 μL；流速1.0 mL/min，梯度洗脫程序如表1所示。

圖1為生物胺標準品的高效液相色譜圖，9種生物胺在20 min內得到了良好的分離。9種生物胺的峰形尖銳，無前延或拖尾現(xiàn)象，生物胺之間達到基線分離，9種生物胺的保留時間分別在3.9、4.9、5.4、6.2、6.6、7.7、12.3、13.4和17.9 min左右，且線性良好，相關系數(shù)R都>0.999。

表1 生物胺分析的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for biogenic amine analysis

1-色胺；2-β-苯乙胺；3-腐胺；4-尸胺；5-組胺；6-章魚胺；7-酪胺；8-亞精胺；9-精胺圖1 九種生物胺標準品色譜圖(50 μg/mL)Fig.1 HPLC chromatogram of 8 biogenic amine standards (50 μg/mL)

1.3.3 研究方法

根據(jù)測定不同水產(chǎn)品中的生物胺含量結果，選擇南美白對蝦作為樣品進行貯藏實驗。分別在4 ℃和25 ℃貯藏條件下研究南美白對蝦中生物胺含量的變化，并測定相應的新鮮度指標 (pH、TVB-N值、TBA值和菌落總數(shù))。根據(jù)不同貯藏溫度下生物胺及相關新鮮度指標的產(chǎn)生過程，在25 ℃的貯藏條件下每0、0.5、1、1.5、2、2.5和3 d測定南美白對蝦中生物胺的含量及相關新鮮度指標，在4 ℃的貯藏條件下每0、2、4、6、8、10和12 d測定南美白對蝦中生物胺的含量及相關新鮮度指標。每個樣品平行測定3次。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

利用Origin lab 2018軟件繪制曲線，用Excel 2010和SPSS 26.0軟件分析單因素，ANOVA檢驗來進行顯著性和方差分析，P<0.05為差異顯著，P>0.05 為差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 貯藏過程中生物胺的變化

生物胺在微生物的作用下大量產(chǎn)生，與蝦肉品質變化、安全性及貨架期有關。南美白對蝦購入后即取蝦肉在優(yōu)化的條件下測定生物胺含量，結果檢出苯乙胺和酪胺的含量分別為0.78和3.27 μg/g，其他均未檢出，在貯藏過程中繼續(xù)測定生物胺。由圖2可知，南美白對蝦中的生物胺在25 ℃和4 ℃下的變化不同，但總量隨著溫度的升高而呈總體增加的趨勢。

由圖2-a可知，當在25 ℃貯藏72 h時，南美白對蝦中的生物胺總量在24 h就達到了 54.98 mg/kg，72 h達到211.14 mg/kg。其中，腐胺、尸胺和酪胺的積累量顯著增加(P<0.05)，72 h的最終含量分別達到88.41、73.31和42.42 mg/kg，而相比之下，苯乙胺的積累量較少且基本無變化，最終含量為 6.99 mg/kg。由圖2-b可知，當在4 ℃貯藏12 d時，南美白對蝦中的生物胺總量總體增加，變化較緩慢，由4.05 mg/kg增長到45.54 mg/kg。其中，腐胺和尸胺的積累量相對較大(P<0.05)，12 d的最終含量分別達到15.68和17.10 mg/kg，而苯乙胺和酪胺的積累量都緩慢增加，苯乙胺在6 d達到5.11 mg/kg后無顯著增加(P>0.05)，酪胺最終含量為7.23 mg/kg。隨著貯藏時間的增長，內源性和外源性氨基酸脫羧酶作用于游離氨基酸上形成生物胺[10]。但是，水產(chǎn)品中形成的BA水平可能受貯存條件的強烈影響[7]。由以上分析可知，溫度較高時，生物胺積累速度較快，這可能是由于隨著貯藏溫度的升高微生物的生長繁殖加速，進入對數(shù)生長期的時間變短，產(chǎn)生大量的氨基酸脫羧酶和蛋白質降解酶，從而產(chǎn)生大量的生物胺和游離氨基酸，游離氨基酸的增加又導致生物胺產(chǎn)生速度變快，因此，溫度較高情況下，生物胺產(chǎn)生速度和含量都大大增加。胡禮淵等[23]研究表明對蝦在4 ℃下貯藏，腐胺和尸胺變化最顯著，25 ℃下貯藏產(chǎn)生的主要生物胺是酪胺，其次是腐胺和尸胺，而本實驗中不同溫度下蝦肉中主要產(chǎn)生腐胺和尸胺，且其變化顯著，其次是酪胺。這可能與蝦肉原料、貯藏環(huán)境和微生物的差異有關。

a-南美白對蝦在25 ℃貯藏過程中生物胺的變化；b-南美白對蝦在4 ℃貯藏過程中生物胺的變化圖2 南美白對蝦在25 ℃和 4 ℃貯藏過程中生物胺的變化Fig.2 Changes of biogenic amines of white shrimp (Litopenaeus vannamei) during storage at 25 ℃ and 4 ℃

2.2 貯藏過程中pH、TVB-N、TBA、TVC的變化

pH可反映魚肉品質變化導致的酸堿程度的變化和蛋白質降解的變化[24]。南美白對蝦在25 ℃和4 ℃貯藏過程中pH、TVB-N、TBA和TVC的變化見圖3-a。25 ℃和 4 ℃貯藏過程中南美白對蝦pH 變化趨勢相同,先升高后降低，最后顯著升高(P<0.05), pH值的降低可能因為蝦肉內糖原、ATP和磷酸肌酸的分解和二氧化碳的溶解[25-26]，pH值的升高是由于魚類腐敗細菌產(chǎn)生揮發(fā)性基本成分或蛋白質分解產(chǎn)生含氮堿性物質，比如生物胺[27]，這與SONG等[19]的研究結果類似。

TVB-N 值反映蛋白質分解而產(chǎn)生的氨以及胺類等堿性含氮物質，從而反映水產(chǎn)品品質的變化[28]。GB 2733—2015《食品安全國家標準鮮、凍動物性水產(chǎn)品》中規(guī)定TVB-N值在 20 mg/100g為新鮮魚蝦水平，超過35 mg/100g被認為是不適合消費者食用的[29]。由圖3-b可知，貯藏初期南美白對蝦TVB-N值為10.83 mg/100g，25 ℃貯藏溫度下增長顯著(P<0.05)，到24 h時TVB-N值已達到43.86 mg/100g，遠超出了蝦肉二級鮮度(25 mg/100g)范圍，最終在貯藏終點3 d時達到了122.97 mg/100g。4 ℃冷藏期間，南美白對蝦TVB-N值增長相對緩慢，于4 d達到20.71 mg/100g，超過新鮮魚蝦水平，于8 d達到27.54 mg/100g，超出了蝦肉二級鮮度范圍，最終在貯藏終點12 d時達到了45.93 mg/100g。2個貯藏溫度下TVB-N值均隨貯藏時間增長呈上升趨勢，且25 ℃增長迅速且顯著，這與以往有關其他蝦類的相關研究相一致[29-30]，貯藏溫度和時間是影響TVB-N和水產(chǎn)品腐敗的重要因素。

南美白對蝦含有大量的多不飽和脂肪酸，故其在貯藏過程中易發(fā)生脂肪氧化。丙二醛為蝦肉脂質氧化的終產(chǎn)物之一，其含量可由TBA值來表示，表明南美白對蝦的脂肪氧化程度[28]。一般而言，TBA值越大，說明脂肪氧化程度越高。此外，脂肪氧化過程中伴隨產(chǎn)生一些酚類和酮類物質，引起不愉快的氣味，也是引起蝦品質劣變的重要原因[30-31]。研究表明，溫度的升高會加速脂質的氧化分解[32]。圖3-c表明,25 ℃貯藏溫度下蝦肉TBA值呈總體上升趨勢，從0.47 mg/100g上升到3.92 mg/100g,而在第1.5～2天的貯藏過程中有略微下降，可能因為丙二醛的含量會因其與胺、核苷、核酸、含氨基磷脂、蛋白質或其他脂質氧化副產(chǎn)物醛類之間的相互作用而降低[28]。4 ℃貯藏過程中，蝦肉TBA值呈持續(xù)上升趨勢，從0.47 mg/100g上升到3.93 mg/100g,貯藏0～8 d期間，蝦肉TBA上升較為緩慢，一定程度表明蝦肉在8 d 前脂質氧化程度較小;8～12 d期間蝦肉TBA顯著增加(P<0.05)，說明這個階段脂肪氧化物迅速發(fā)生了進一步的氧化。

微生物與水產(chǎn)品中大部分生物胺的產(chǎn)生與變化有很大的相關性[33]?？墒秤玫乃a(chǎn)品其菌落總數(shù)限量標準為6 lg CFU/g[34]。由圖3-d可知，在25 ℃貯藏過程中，蝦肉TVC呈一直呈顯著增加趨勢(P<0.05)，從3.70 lg CFU/g上升至8.81 lg CFU/g，當貯藏1 d時，蝦肉TVC為 6.36 lg CFU/g(>6 lg CFU/g)，此時蝦肉已不可再食用。而4 ℃冷藏期間，蝦肉TVC增長緩慢，到貯藏終點12 d時，TVC上升至8.85 lg CFU/g，8 d時達到7.29 lg CFU/g(>6 lg CFU/g)，不能食用。可從微生物指標看出4 ℃比25 ℃貨架期延長7 d。由以上分析可知，溫度越高，菌落總數(shù)增長越快，因為低溫可抑制許多種類微生物的生長繁殖。

2.3 貯藏過程中生物胺含量與pH、TVB-N、TBA、TVC的關系

本實驗對25 ℃和4 ℃貯藏條件下南美白對蝦中生物胺和其他新鮮度指標值(pH值、TVB-N值、TBA值和菌落總數(shù))進行了皮爾遜相關分析，以確定其在不同貯藏溫度下隨時間變化的相關性。由表2可知，在25 ℃條件下貯藏的南美白對蝦中苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺含量和生物胺總含量與pH值、TVB-N值、TBA值和菌落總數(shù)均表現(xiàn)出顯著相關性(P<0.05)，在4 ℃條件下貯藏的南美白對蝦中腐胺、尸胺、酪胺含量和生物胺總含量與pH值、TVB-N值、TBA值和菌落總數(shù)表現(xiàn)出顯著相關性(P<0.05)，其中尸胺和酪胺與pH值、TVB-N值、TBA值和菌落總數(shù)均表現(xiàn)出極顯著相關性(P<0.01)，而苯乙胺與pH值、TVB-N值、TBA值和菌落總數(shù)相關性不明顯。在常溫貯藏(25 ℃)和冷藏(4 ℃)條件下南美白對蝦中酪胺、尸胺、腐胺含量均與pH值、TVB-N值、TBA值和菌落總數(shù)表現(xiàn)出高度相關性，可能因為這3種生物胺與蛋白質的分解和微生物的作用有密切的相關性。因此，可將尸胺、腐胺和酪胺作為南美白對蝦的特征生物胺，用于評價其品質變化，可作為其貨架期的參考指標。

a-南美白對蝦在25 ℃和4 ℃貯藏過程中pH的變化;b-南美白對蝦在25 ℃和4 ℃貯藏過程中TVB-N的變化;c-南美白對蝦在25 ℃和4 ℃貯藏過程中TBA的變化;d-南美白對蝦在25 ℃和4 ℃貯藏過程中菌落總數(shù)的變化圖3 南美白對蝦在25 ℃和 4 ℃貯藏過程中pH、TVB-N、TBA和TVC的變化Fig.3 Changes of pH, TVB-N, TBA and total viable counts of white shrimp (Litopenaeus vannamei) during storage at 25 ℃ and 4 ℃

3 結論

在不同貯藏條件下，南美白對蝦中腐胺、尸胺和酪胺變化最顯著，常溫貯藏(25 ℃)下產(chǎn)生的主要生物胺是腐胺，其次是尸胺和酪胺，冷藏(4 ℃)條件下產(chǎn)生的主要生物胺是腐胺、尸胺、酪胺和苯乙胺。根據(jù)對南美白對蝦生物胺、理化指標和微生物的測定，表明在25和4 ℃貯藏條件下南美白對蝦可食用期為1 d和4 d。在2個貯藏溫度下腐胺、尸胺和酪胺含量均與pH值、TVB-N值、TBA值和菌落總數(shù)表現(xiàn)出高度相關性，可以作為南美白對蝦貯藏過程中新鮮度的指標。

表2 25 ℃和4 ℃貯藏條件下南美白對蝦中生物胺含量與pH值、TVB-N值、TBA值和TVC值的相關性Table 2 Correlations of the concentrations of biogenic amines with pH, TVB-N, TBA and TVC in white shrimp (Litopenaeus vannamei) during storage at 25 ℃ and 4 ℃