介紹一種改良的Von Kossa鈣鹽染色法

李 麗，陳 菲，包春娟，周琪琪，包 驥

在牙齒及骨骼外出現(xiàn)的鈣沉積均為病理性鈣鹽沉積。草酸鈣結(jié)晶性腎損傷的發(fā)病機(jī)制及其治療靶點(diǎn)的基礎(chǔ)研究中，實(shí)驗(yàn)大鼠腎組織內(nèi)沉積的草酸鈣結(jié)晶在HE染色中不易觀察，借助Von Kossa鈣鹽染色法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行鈣鹽特殊染色，以便半定量統(tǒng)計(jì)各腎臟組織內(nèi)草酸鈣結(jié)晶的量。Von Kossa鈣鹽染色法是一種金屬置換法，硝酸銀溶液作用于含有不溶性鈣鹽的切片時(shí)，鈣被銀置換，銀鹽在光的作用下被還原為黑色金屬銀，鈣鹽沉積處染色為黑色。Von Kossa鈣鹽染色法中最關(guān)鍵的硝酸銀溶液染色步驟需要陽(yáng)光照射，傳統(tǒng)方法是將其置于陽(yáng)光下或60 W燈泡前，放置1 h或更長(zhǎng)時(shí)間，整個(gè)染色步驟耗時(shí)長(zhǎng)且不容易控制。36 W四燈管紫外光固化燈具有光照能量大、強(qiáng)度穩(wěn)定、180°照射、不留死角等優(yōu)點(diǎn)，主要用于手機(jī)主板焊盤綠油快速固化。本文現(xiàn)介紹一種改良的36 W紫外光固化燈加速Von Kossa鈣鹽染色法，與傳統(tǒng)方法相比，其操作簡(jiǎn)單、染色快且背景干凈，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料(1)樣本制片：草酸鈣結(jié)晶實(shí)驗(yàn)大鼠50只，腎臟組織離體后立即置于10%中性福爾馬林固定48 h，常規(guī)石蠟包埋后行4 μm厚連續(xù)切片3張，65 ℃烤片1 h，常規(guī)脫蠟至流水沖洗后放入雙蒸水中待染，1張切片常規(guī)行HE染色，剩下2張切片分別用傳統(tǒng)方法和改良方法行Von Kossa鈣鹽染色法。(2)試劑：Von Kossa鈣鹽染色法試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司(G3282)，蘇木精染液購(gòu)自Thermo公司(7211)。(3)耗材：Super PAP Pen超級(jí)免疫組化油筆購(gòu)自福州邁新公司(PEN-0002)。(4)小型設(shè)備：國(guó)產(chǎn)36 W快速紫外光固化燈(SS-818)。(5)大型設(shè)備：全自動(dòng)封片儀(Thermo，ClearVue)；WSI全數(shù)字切片掃描儀(3DHISTECH, Pannoramic SCAN)。

1.2 方法

1.2.1傳統(tǒng)Von Kossa鈣鹽染色法 (1)切片放入盛裝有硝酸銀液的立式玻璃染缸后，置于60 W燈泡前，把箔紙放在染色缸的后面用于反射光線，放置60 min；(2)蒸餾水洗1 min；(3)硫代硫酸鈉溶液處理5 min；(4)流水沖洗后常規(guī)復(fù)染蘇木精；(5)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，全自動(dòng)封片儀封片后行全數(shù)字切片掃描。

1.2.2改良Von Kossa鈣鹽染色法 (1)切片先用免疫組化油筆畫(huà)圈，再滴加500 μL硝酸銀溶液，放入36 W紫外線光固化燈內(nèi)(圖1A、B)，放置15 min；(2)蒸餾水洗1 min；(3)硫代硫酸鈉溶液處理2 min；(4)流水沖洗，常規(guī)復(fù)染蘇木精；(5)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，全自動(dòng)封片儀封片后行全數(shù)字切片掃描。

2 結(jié)果

改良Von Kossa鈣鹽染色法采用滴染法，硝酸銀液染色過(guò)程方便觀察，鈣鹽沉積含量高的腎組織切片肉眼可見(jiàn)黑色草酸鈣結(jié)晶沉積(圖1C)。傳統(tǒng)Von Kossa鈣鹽染色法采用浸染法，硝酸銀染色過(guò)程較長(zhǎng)，染色過(guò)程不便取出切片，肉眼或鏡下觀察染色情況。草酸鈣結(jié)晶模型腎組織HE染色，低倍鏡下腎皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)均可見(jiàn)擴(kuò)張的腎小管，其內(nèi)無(wú)色透明的草酸鈣結(jié)晶體不易直接觀察；高倍鏡下部分?jǐn)U張的腎小管內(nèi)可見(jiàn)無(wú)色透明的晶體結(jié)構(gòu)(圖2A、B)。改良Von Kossa鈣鹽染色法：低倍鏡下可見(jiàn)腎皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)黑色鈣鹽沉積且背景干凈，細(xì)胞核為藍(lán)色(圖2C)；傳統(tǒng)Von Kossa鈣鹽染色法：低倍鏡下可見(jiàn)皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)黑色鈣鹽沉積，但腎組織內(nèi)可見(jiàn)少許淺棕色背景，細(xì)胞核為藍(lán)色(圖2D)。

圖1 36 W快速固化燈內(nèi)Von Kossa鈣鹽染色法操作：A.三臺(tái)36 W紫外光固化燈同時(shí)操作，Von Kossa鈣鹽染色法；B.15 min硝酸銀液染色結(jié)束時(shí)每張切片剩余染液量；C.鈣鹽沉積量高的腎組織切片肉眼可見(jiàn)黑色草酸鈣結(jié)晶沉積

圖2 大鼠草酸鈣結(jié)晶模型腎組織HE染色及Von Kossa鈣鹽染色：A. HE染色可見(jiàn)腎皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)散在擴(kuò)張的腎小管，擴(kuò)張的腎小管管腔大小不一；B. HE染色可見(jiàn)部分?jǐn)U張的腎小管腔內(nèi)無(wú)色透明的晶體結(jié)構(gòu)；C.改良Von Kossa鈣鹽染色法可見(jiàn)腎皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)散在黑色鈣鹽沉積，細(xì)胞核為藍(lán)色；D.傳統(tǒng)Von Kossa鈣鹽染色法可見(jiàn)腎皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)散在黑色鈣鹽沉積，部分區(qū)域可見(jiàn)淺棕色背景，細(xì)胞核為藍(lán)色

3 討論

腎結(jié)石是常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)疾病，研究發(fā)現(xiàn)患者的結(jié)石成分主要以草酸鈣為主[1]。在草酸鈣結(jié)晶性腎損傷發(fā)病機(jī)制及其治療靶點(diǎn)的基礎(chǔ)研究中，實(shí)驗(yàn)大鼠腎組織內(nèi)沉積的草酸鈣結(jié)晶HE染色時(shí)，不易觀察及統(tǒng)計(jì)鈣鹽含量，借助Von Kossa鈣鹽染色法低倍鏡下可見(jiàn)清晰的黑色草酸鈣結(jié)晶沉積。Von Kossa鈣鹽染色法制片質(zhì)量直接影響染色結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析的準(zhǔn)確性。本科室日常工作中已將36 W紫外光固化燈用于Von Kossa鈣鹽染色法實(shí)驗(yàn)，其操作方便易控制，染色快效果穩(wěn)定。改良Von Kossa鈣鹽染色法與傳統(tǒng)Von Kossa鈣鹽染色法比較有以下優(yōu)點(diǎn)。

3.1 提高工作效率丁偉等[2]發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)Von Kossa鈣鹽染色法的硝酸銀液需置于陽(yáng)光下或60 W燈泡下，并且還需用箔紙或鏡子放在染色缸的后面用于反射光線，耗時(shí)1 h或更長(zhǎng)。本組采用36 W四燈管紫外光固化燈具有光照能量大、強(qiáng)度穩(wěn)定、180°照射、不留死角等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)踐證明改良后的硝酸銀液染色步驟15 min即可肉眼觀察腎組織上的黑色鈣鹽沉積。改良Von Kossa鈣鹽染色法由傳統(tǒng)的耗時(shí)60 min降到15 min，縮短了45 min，顯著提高工作效率。

3.2 降低成本、提高染色質(zhì)量傳統(tǒng)Von Kossa鈣鹽染色法采用染色缸浸染，常選用立式玻璃染缸，每缸需染色試劑50 mL，每缸一次最多放置9張切片。假設(shè)需做50張腎組織Von Kossa鈣鹽染色，可選擇多個(gè)立式染缸同時(shí)浸染，試劑消耗多、成本高；也可選擇同一缸反復(fù)浸染，但耗時(shí)長(zhǎng)。改良Von Kossa鈣鹽染色法采用滴染法，每張大鼠腎組織切片滴500 μL染液量，本科室經(jīng)長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在36 W四燈管紫外光固化燈內(nèi)照射30 min會(huì)明顯減少切片上的染液，而照射15 min染液減少量較少。假設(shè)需做50張腎組織Von Kossa鈣鹽染色法，需50 mL試劑。36 W四燈管紫外光固化燈價(jià)格便宜、有效期長(zhǎng)。改良Von Kossa鈣鹽染色法比傳統(tǒng)Von Kossa鈣鹽染色法在試劑消耗上顯著降低。葉恩如等[3]報(bào)道滴染法具有染色均一、恒定，交叉污染率低的優(yōu)點(diǎn)。李金龍等[4]也報(bào)道滴染不僅解決了標(biāo)本與標(biāo)本間的相互污染問(wèn)題，同時(shí)保證了染色效果的均一性和穩(wěn)定性。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，改良Von Kossa鈣鹽染色法中使用的滴染法比傳統(tǒng)浸染法染色更穩(wěn)定，硝酸銀染色時(shí)間短、組織切片不易產(chǎn)生背景，有效提高染色質(zhì)量。

綜上所述，改良Von Kossa鈣鹽染色法具有耗時(shí)少、試劑成本低等優(yōu)點(diǎn)，且染色效果穩(wěn)定，該方法操作簡(jiǎn)單快捷、節(jié)約成本，值得臨床推廣。