探針擴(kuò)增阻滯突變法與數(shù)字PCR法檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌BRAF基因突變

荀延萍，姜燕平，傅佳儀，張仕蓉

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是甲狀腺癌中最常見的類型，約占甲狀腺癌的90%[1]。雖然目前絕大多數(shù)PTC預(yù)后較好，但仍有30%的PTC患者術(shù)后出現(xiàn)反復(fù)復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。Kimura等[3]研究發(fā)現(xiàn)70%的PTC可能存在分子改變，包括編碼受體酪氨酸激酶RET、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)受體酪氨酸激酶-1(NTRK1)基因，以及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的兩個(gè)細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)基因RAS和BRAF。BRAF作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路，可以調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡[4]，在PTC中BRAF突變率最高，其中45%為V600E，其次為K601E和V599Ins[5-7]。BRAF V600E突變是PTC中最常見的一種遺傳改變，可能通過侵襲性行為影響腫瘤的發(fā)展，因此BRAF突變已成為一種潛在的PTC預(yù)后分子標(biāo)記[8]，是目前PTC中分析和檢測(cè)的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用探針擴(kuò)增阻滯突變(amplification refractory mutation system, ARMS)法和數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)法檢測(cè)BRAF V600E突變，分析比較哪種方法更適用于PTC組織中BRAF V600E突變檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源收集2018年8月～2019年8月浙江省杭州市第一人民醫(yī)院存檔的PTC手術(shù)標(biāo)本371例?；颊咧形荒挲g49歲，男性98例，女性273例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、組織切片后病理醫(yī)師復(fù)閱切片明確診斷，并評(píng)估腫瘤細(xì)胞含量后進(jìn)行檢測(cè)。本組所有患者均知情同意。

1.2 DNA提取使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒(Qiagen公司生產(chǎn)，貨號(hào)56404)提取石蠟包埋組織樣本基因組DNA，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。并用微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度及純度，以O(shè)D260/OD280處于1.8～2.0之間，濃度均﹥10 ng/μL為合格。提取后的DNA樣品在-20 ℃條件下保存待用。

1.3 ARMS法檢測(cè)基因突變使用人BRAF基因突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)(北京雅康博生物公司，TB004)檢測(cè)石蠟包埋組織樣本中BRAF基因V600E點(diǎn)突變，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用引物序列：正鏈5′-CCTA AACTCTTCATAATGCTTGCT-3′；反鏈5′-AGTAACTCAGCAG CATCTCAGG-3′。利用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)確定Ct值。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)，結(jié)束后采集熒光。樣品檢測(cè)結(jié)果分為陽性和陰性，其中無BRAF突變(突變位點(diǎn)檢測(cè)FAM通道)曲線或BRAF突變(突變位點(diǎn)檢測(cè)FAM通道)的Ct值>38判定為陰性；反之，有擴(kuò)增且Ct值≤35判定為陽性。

1.4 ddPCR法檢測(cè)基因突變使用人BRAF基因突變檢測(cè)試劑盒(數(shù)字PCR法)(上海源奇生物公司，CB340002)檢測(cè)，按照說明書操作。采用引物序列：正鏈5′-CTACT GTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGA-3′；反鏈5′-AGCCTC AATTCTTACCATCCA-3′。利用QX200 Droplet Digital PCR系統(tǒng)(美國(guó)BioRad公司)測(cè)定，PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，58 ℃ 60 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)；98 ℃ 10 min；4 ℃ 5 min。樣品檢測(cè)結(jié)果分為陽性和陰性，其中“ch1+”區(qū)的點(diǎn)<3個(gè)且落在“ch2+”區(qū)的點(diǎn)<5個(gè)被判定為陰性；反之，突變比例≥0.1%且落在“ch1+ch2-”區(qū)的點(diǎn)≥3個(gè)判定為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)評(píng)價(jià)BRAF基因突變與PTC臨床病理特征的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 ARMS法和ddPCR法檢測(cè)BRAF基因突變371例PTC標(biāo)本中，ARMS法檢測(cè)BRAF基因突變陽性275例，陰性96例，突變率為74.1%(圖1)；ddPCR法檢測(cè)BRAF基因突變陽性284例，陰性87例，突變率為76.5%(圖2)。ddPCR法檢測(cè)BRAF基因突變率較ARMS略高，但兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 ARMS法檢測(cè)BRAF基因突變：A.陽性；B.陰性

圖2 ddPCR法檢測(cè)BRAF基因突變：A.陽性；B.陰性

2.2 BRAF基因突變與PTC臨床病理特征的關(guān)系A(chǔ)RMS法檢測(cè)男性患者的BRAF基因突變率為71.4%(70/98)，女性患者的BRAF基因突變率為75.1%(205/273)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；年齡≥49歲組患者的BRAF基因突變率為73.5%(139/189)，<49歲組患者BRAF基因突變率為74.7%(136/182)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ddPCR法檢測(cè)男性患者的BRAF基因突變率為72.4%(71/98)，女性患者的BRAF基因突變率為78.0%(213/273)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；年齡≥49歲組患者的BRAF基因突變率為77.2%(146/189)，<49歲組患者BRAF基因突變率為75.8%(138/182)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 甲狀腺乳頭狀癌中BRAF基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 ARMS及ddPCR法檢測(cè)BRAF基因突變的一致性BRAF基因突變的一致性本組以ARMS法為標(biāo)準(zhǔn)，ARMS法和ddPCR法檢測(cè)結(jié)果陽性符合率為96.7%(266/275)，陰性符合率為79.2%(76/96)，總符合率為92.5%(342/371)(表2)。對(duì)于不一致的29例樣本，采用測(cè)序的方法進(jìn)行重測(cè)，結(jié)果顯示其中23例為陽性樣本(ARMS法準(zhǔn)確6例，ddPCR法準(zhǔn)確17例)，6例為陰性樣本(ddPCR法準(zhǔn)確6例)。因此經(jīng)過校驗(yàn)后ddPCR法檢測(cè)陽性準(zhǔn)確率為97.9%(283/289)，ARMS法檢測(cè)陽性準(zhǔn)確率為94.1%(272/289)。

表2 ARMS法及ddPCR法檢測(cè)BRAF基因突變的一致性分析

3 討論

BRAF V600E基因突變是促使PTC形成及進(jìn)展的重要分子改變，與PTC的高侵襲性、復(fù)發(fā)、預(yù)后不良均密切相關(guān)。因此準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)甲狀腺結(jié)節(jié)中BRAF V600E基因突變情況，對(duì)于臨床醫(yī)師確定PTC復(fù)發(fā)危險(xiǎn)程度的分級(jí)、采取合適的手術(shù)方式及制定合理的隨訪計(jì)劃均具有重要的指導(dǎo)價(jià)值[1]。有研究報(bào)道，應(yīng)用免疫組化和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法來評(píng)價(jià)BRAF V600E基因突變蛋白表達(dá)的靈敏性[9]，以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與Sanger測(cè)序法也被用來比較檢測(cè)BRAF V600E基因突變結(jié)果的靈敏性[10]。本實(shí)驗(yàn)采用ARMS和ddPCR兩種方法檢測(cè)371例PTC患者中BRAF V600E基因突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ARMS法檢測(cè)BRAF基因突變率為74.1%(275/371)，ddPCR法檢測(cè)BRAF基因突變率為76.5%(284/371)，且兩種檢測(cè)方法均顯示PTC患者BRAF基因突變與患者性別、年齡無關(guān)；兩種檢測(cè)方法檢測(cè)BRAF V600E突變狀態(tài)的總符合率為92.5%，ddPCR法檢測(cè)突變陽性準(zhǔn)確率為97.9%，ARMS法檢測(cè)陽性準(zhǔn)確率為94.1%?？傊?，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ARMS和ddPCR兩種方法檢測(cè)到的陽性突變具有相似的準(zhǔn)確性。

一般來說，腫瘤組織再活檢是病理診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，其中檢測(cè)組織中BRAF V600E基因狀態(tài)是一種可行的方法，需要一種高靈敏度、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，如ARMS、ddPCR等。有文獻(xiàn)報(bào)道基于熒光定量PCR的ARMS技術(shù)通過特異性探針識(shí)別EGFR突變序列，該方法具有很高的選擇性和靈敏度，可以檢測(cè)到組織樣本中DNA突變量低至1%的情況[11]。與ARMS法相比，ddPCR法是一種新技術(shù)，可直接檢測(cè)目標(biāo)DNA的絕對(duì)拷貝數(shù)和相對(duì)拷貝數(shù)，并且通過對(duì)每個(gè)樣品中上萬滴微流體的快速分析，使得ddPCR在臨床檢測(cè)應(yīng)用中具有可行性[12]。另外，ARMS為相對(duì)定量分析，ddPCR為絕對(duì)定量分析。在其他研究中表明，ddPCR的敏感性為0.01%[13]，ARMS的敏感性為0.1%[14]。基于上述研究，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，與ARMS法相比，ddPCR法在檢測(cè)PTC中BRAF V600E基因突變具有優(yōu)勢(shì)，具有較高的精密度、靈敏度和準(zhǔn)確性。因此，進(jìn)一步證實(shí)ddPCR法更適用于檢測(cè)BRAF V600E基因突變，為PTC的診斷及判斷預(yù)后提供依據(jù)，在BRAF V600E突變患者中具有良好的應(yīng)用前景，并發(fā)揮越來越大的作用。