結直腸腺癌中TKT的表達及臨床意義

張 偉，高婉婉，宋 紅，張偉璇，李佳嘉，張 帆

2018年全球癌癥報告顯示，結直腸癌約1 810萬新發(fā)病例和960萬死亡病例，位居癌癥發(fā)病率的第3位，病死率的第2位[1]。隨著經(jīng)濟增長和生活水平提高，結直腸癌已嚴重威脅人類生命健康。目前，手術切除和輔助化療是結直腸癌的主要治療方法，結直腸癌中相關分子靶向治療進展緩慢，腫瘤的復發(fā)和轉移仍是導致患者死亡的主要原因。因此，迫切需要深入探索結直腸癌的分子機制，尋找有效的診斷和治療靶點。近年，腫瘤能量代謝異常引起廣泛關注。轉酮醇酶(transketolase, TKT)是戊糖磷酸途徑(pentose phosphate pathway, PPP)非氧化階段的關鍵酶。TKT參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，如在肝細胞癌[2]、食管癌[3]、卵巢癌[4]、子宮頸癌[5]等腫瘤中均檢測出高表達?，F(xiàn)階段TKT在結直腸癌組織中的表達及與臨床病理特征的關系尚不清楚。本文通過Oncomine及GEO數(shù)據(jù)庫分析TKT基因在結直腸腺癌和癌旁組織中的表達，采用qRT-PCR和Western blot法檢測結直腸腺癌組織和細胞樣本中TKT的表達量，運用免疫組化檢測結直腸腺癌石蠟組織中TKT的表達，著重探討其與臨床病理特征的相關性及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年10月～2020年10月皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院/弋磯山醫(yī)院病理科行結直腸腺癌根治術的92例浸潤性腺癌及配對癌旁正常組織石蠟標本，其中男性51例，女性41例，患者年齡21～86歲，中位年齡52歲。所有病例均經(jīng)兩位高年資病理醫(yī)師閱片確診。

1.2 方法

1.2.1數(shù)據(jù)庫分析 利用Oncomine(https://www.oncomine.org/resource/)數(shù)據(jù)庫分析TKT在腫瘤(包括結直腸腺癌)中的表達；利用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)數(shù)據(jù)庫大樣本分析TKT在結直腸腺癌組織和癌旁組織中表達差異；應用GEO公共數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)分析17例結直腸腺癌組織及配對癌旁組織中TKT的表達。

1.2.2RNA提取和qRT-PCR 使用TRIzol試劑(日本Takara公司)提取總RNA，根據(jù)說明書利用Takara逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。使用SybrGreen qPCR Mix(德國DBI公司)試劑盒，在ABI 7500熒光定量儀完成27例新鮮結直腸腺癌組織及配對癌旁組織的qRT-PCR檢測。以Folds=2-△△Ct表示組間相對倍比關系，以GAPDH為內參。qRT-PCR引物序列：TKT正向引物：5′-GAAGATCAGCTCCGACTT GG-3′，反向引物：5′-GTCGAAGTATTTGCCGGTGT-3′；GAPDH正向引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.2.3Western blot檢測 收集8例新鮮結直腸腺癌組織及配對癌旁組織，7株常見人結直腸癌細胞株(SW480、LOVO、HCT116、RKO、Caco2、SW620、DLD1)及人正常結腸黏膜上皮細胞株(FHC)。用RIPA裂解緩沖液(江蘇凱基生物公司)提取蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒(江蘇凱基生物公司)測定蛋白濃度。利用10%SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白電轉致PVDF膜上。將PVDF膜置于含5%脫脂牛奶的PBST溶液中封閉1 h，加入一抗TKT(11039-1-AP)在4 ℃孵育過夜，再加入二抗室溫孵育1 h，用PBST洗滌30 min。使用ECL發(fā)光液(杭州弗德生物公司)進行化學發(fā)光。

1.2.4免疫組化 標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋后切片。免疫組化染色采用EliVision兩步法，兔抗人TKT(11039-1-AP)抗體購自武漢三鷹生物公司，工作濃度1 ∶200；四種錯配修復(mismatch repair deficent，MMR)蛋白(MSH2、MSH6、MLH1、PMS2)抗體及EliVision試劑盒均購自福州邁新公司；具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。用人肝臟組織中TKT染色為陽性對照，PBS代替一抗作空白對照，DAB顯色，蘇木精復染。免疫組化判讀由兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法閱片。

1.3 結果判斷TKT陽性判斷標準[6]：(1)按細胞陽性百分比進行評分：陽性細胞數(shù)<1%為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；(2)按細胞著色強度進行評分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；將兩項得分的乘積進行分組：>4分為高表達組，≤4分為低表達組。MMR蛋白判斷標準：有任何比例和強度的癌細胞核著色為陽性，癌細胞核均未著色為陰性；四種MMR蛋白均陽性為正常，任一種MMR蛋白陰性為缺失。

2 結果

2.1 數(shù)據(jù)庫分析結直腸癌中TKT的表達應用Oncomine數(shù)據(jù)庫在線分析TKT在結直腸腺癌中的表達，入選標準：TKT在腫瘤組織和正常組織間差異倍數(shù)>2、基因排位<10%、P<0.001。結果顯示：符合入選標準的數(shù)據(jù)庫有13個(圖1)，通過GEPIA工具在線分析TCGA芯片數(shù)據(jù)庫(367例結直腸癌樣本)顯示TKT表達上調(圖2A)。利用GEO公共數(shù)據(jù)庫(GDS4382/208699)分析17例新鮮配對結直腸腺癌組織中TKT表達，結果顯示：TKT在結直腸癌組織中的表達明顯高于正常組織(圖2B)。上述分析結果提示TKT在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起促癌作用。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中TKT在結直腸腺癌中的表達：藍色為表達下調；紅色為表達上調；顏色深淺為數(shù)據(jù)庫數(shù)量所占位次

2.2 結直腸腺癌中TKT mRNA表達及診斷價值應用qRT-PCR檢測27例新鮮結直腸腺癌及配對癌旁正常組織中TKT mRNA的相對表達量，結果顯示結直腸腺癌組織中TKT mRNA水平比癌旁組織明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，圖3A、B)。利用結直腸腺癌和癌旁正常組織中TKTmRNA相對表達量制作受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC)評價TKT診斷價值，結果顯示：ROC曲線下面積(area under curve,AUC)為0.877，敏感性為0.784，特異性為0.970(圖3C)。AUC越接近1越具有診斷價值，表明檢測TKT mRNA表達可以鑒別正常組織與結直腸腺癌組織，TKT具有作為結直腸腺癌診斷標志物的潛在價值。

圖2 A.GEPIA在線分析TKT在TCGA數(shù)據(jù)庫結直腸腺癌標本中表達：T.腫瘤組織；N.癌旁組織；B.GEO數(shù)據(jù)庫中TKT在結直腸腺癌與配對癌旁正常組織中的表達

2.3 Western blot法檢測結直腸腺癌中TKT蛋白的表達Western blot法檢測8例新鮮配對結直腸腺癌組織和常見結直腸癌細胞株，結果顯示：8例結直腸腺癌組織中TKT蛋白表達明顯高于癌旁組織(圖4A)；在7株人結直腸癌細胞株(SW480、LOVO、HCT116、RKO、Caco2、SW620、DLD1)中TKT蛋白表達顯著高于人正常結腸黏膜上皮細胞株FHC(圖4B)。

2.4 免疫組化檢測結直腸腺癌中TKT蛋白的表達92例配對結直腸腺癌及癌旁正常石蠟組織中TKT有60.9%(56/92)呈高表達，在癌旁組織中僅26.1%(24/92)呈高表達，兩組間高表達率差異有顯著性(P<0.001，圖5)。

圖3 A.qRT-PCR檢測27例新鮮結直腸腺癌組織與配對癌旁正常組織中TKT表達量的倍比關系：T.結直腸腺癌組織；N.配對癌旁正常組織；B.qRT-PCR檢測27例新鮮結直腸腺癌組織與配對癌旁正常組織中TKT相對表達量的比較；C.ROC曲線評估TKT的診斷價值

圖4 A.Western blot檢測結直腸腺癌中TKT蛋白的表達：N.配對癌旁正常組織；T.結直腸腺癌組織；B.Western blot檢測結直腸腺癌細胞株及正常結腸黏膜上皮細胞株中TKT的表達

圖5 結直腸腺癌中TKT的表達，EliVision兩步法：A.TKT在直腸腺癌組織中低表達；B.TKT在結腸腺癌組織中高表達；C.TKT在直腸配對癌旁正常組織中不表達；D.TKT在結腸配對癌旁正常組織中低表達

2.5 結直腸癌中TKT蛋白表達與臨床病理特征的關系92例結直腸腺癌中，TKT蛋白高表達與腫瘤大小、脈管侵犯、淋巴結轉移以及腫瘤T分期有相關性(P<0.05)，即腫瘤直徑大、有脈管侵犯、有淋巴結轉移及T分期較晚者，TKT表達率更高；TKT高表達與患者年齡、性別、分化程度、神經(jīng)侵犯、發(fā)生部位及MMR蛋白表達均無相關性(表1)。

表1 結直腸腺癌中TKT表達與臨床病理特征的相關性

3 討論

2011年Hanahan和Weinberg重新定義了惡性腫瘤的十大特征，腫瘤能量代謝異常是其中之一[7]。目前，研究顯示腫瘤細胞的能量代謝異常主要體現(xiàn)在Warburg效應和合成代謝增強等方面?？焖僭鲋车哪[瘤細胞需通過各種方式增加戊糖磷酸途徑活性來滿足自身能量供應。TKT是硫胺二磷酸依賴性酶，戊糖磷酸途徑非氧化階段的限速酶，該基因定位于3p14.3，蛋白全長623個氨基酸，相對分子質量為6.8×104，在生物進化過程中高度保守，真核生物各組織器官均有分布[8-9]。人類基因組研究還發(fā)現(xiàn)，TKT同家族基因轉酮醇酶樣基因1(transketolase-like1, TKTL1)和轉酮醇酶樣基因2(transketolase-like 2, TKTL2)在結構和功能上具有一定的相似性；TKTL1基因位于腫瘤和細胞周期激活基因Xq28區(qū)域，在腫瘤發(fā)生中起重要作用[8]。目前，有研究報道TKTL1在乳腺浸潤性導管癌中高表達，與腫瘤的浸潤、轉移有一定的相關性[10]。

TKT在多種惡性腫瘤中表達上調，其過表達與不良臨床預后特征密切相關。Corona等[11]對肝癌的代謝組學研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，TKT在肝癌中表達明顯上調。Xu等[2]研究顯示，與癌旁組織相比，肝癌組織中TKT mRNA和蛋白表達均顯著上升，且TKT過表達與靜脈侵犯、腫瘤衛(wèi)星結節(jié)形成、癌腫直徑大和腫瘤缺乏包膜的侵襲性特征密切相關。Ogusawska等[12]研究顯示TKT過表達與腎細胞癌分期晚和生存期短顯著相關。Zhao等[4]報道，與正常卵巢組織相比，卵巢癌組織中TKT過表達，且TKT轉錄本的過表達與漿液性病理類型及TP53突變型卵巢癌患者的無進展生存期差相關。目前，國外僅報道1篇，國內尚未見TKT在結直腸癌組織中的報道，本組在Oncomine和TCGA樣本庫的分析結果均顯示TKT在結直腸癌組織中表達上調；利用qRT-PCR和Western blot法檢測新鮮配對結直腸腺癌組織及癌旁組織和細胞中TKT mRNA和蛋白的表達，結果與數(shù)據(jù)庫一致。本組27例新鮮結直腸腺癌組織中TKT mRNA表達量顯著高于配對癌旁組織；8例新鮮結直腸腺癌組織中TKT蛋白表達顯著高于配對癌旁組織；常見結直腸癌細胞株中TKT蛋白表達顯著高于FHC細胞株。綜上所述，在結直腸腺癌組織和細胞中TKT mRNA和蛋白表達均上調。本組對92例結直腸腺癌標本進行檢測，結果顯示TKT高表達與腫瘤直徑大、脈管侵犯、淋巴結轉移及腫瘤T分期晚有相關性(P均<0.05)，TKT可能是結直腸癌預后不良因子。微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability， MSI)是結直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的重要分子事件，免疫組化檢測MMR蛋白是篩查MSI的重要方法[13]。謝仲鵬等[14]研究顯示MMR蛋白表達缺失與結直腸癌臨床病理特征相關。本組分析TKT與MMR蛋白表達的相關性，結果顯示61.5%(8/13)的MMR蛋白表達缺失結直腸腺癌組中TKT低表達，差異無統(tǒng)計學意義，但應擴大樣本進一步分析。

目前，TKT在結直腸癌中發(fā)揮促癌的作用已初見端倪，其具體分子機制尚需深入研究。Tseng等[15]報道敲低TKT可激活琥珀酸脫氫酶和富馬酸水合酶，下調HIF-1α使乳腺癌轉移受抑制。Xu等[2]研究顯示TKT經(jīng)由氧化應激途徑促進肝癌進展，TKT基因敲除或TKT抑制劑(Oxythiamin)能增加肝癌細胞對索拉非尼的療效。TKT抑制劑有可能會使腫瘤患者獲益。

綜上所述，本組結果表明結直腸腺癌中TKT mRNA和蛋白水平均顯著升高，并發(fā)現(xiàn)TKT高表達與侵襲轉移臨床病理特征密切相關，提示其可能參與結直腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展；TKT有望成為結直腸腺癌預后標志物或潛在的治療靶點。