PXMP4促進結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲

賀國洋，李 巍，周 琳，趙文麗，王永強，朱會芳，李 娜，崔 靜，王永霞，千新來

目前，結直腸癌的發(fā)病率呈逐年上升且年輕化趨勢，嚴重威脅人類健康[1]，其中20%～40%的結直腸癌患者確診時已經(jīng)合并遠處轉移。轉移是導致結直腸癌患者死亡的主要原因[2-4]。過氧化物酶體膜蛋白4(peroxisomal membrane protein 4, PXMP4)基因定位于20q11.12，編碼含212個氨基酸的多通道跨膜蛋白，是PXMP2/4家族的重要成員[5-6]。現(xiàn)階段PXMP4在結直腸癌中作用及其機制尚未見報道。本實驗旨在探討PXMP4對結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響，為結直腸癌的早期診斷和靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑收集2013～2017年新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院結直腸癌標本和距腫瘤邊緣≥5 cm正常腸黏膜組織各112例。納入標準：患者術前均未行放、化療和免疫治療，具有手術治療適應癥，符合結直腸癌手術病理學診斷標準。人結直腸癌細胞株購自中科院上海細胞庫，構建PXMP4-HA過表達質粒，干擾片段購自廣州銳博公司。E.Coli DH5α大腸桿菌為本實驗室自存。Lipofectamine 2000、RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自大連Takara公司；引物購自美國Invitrogen公司；抗PXMP4抗體購自美國Abcam公司；抗HA抗體和Tublin抗體均購自賽默斯生物公司。PBS緩沖液、檸檬酸鈉抗原修復液、胰蛋白酶、Western blot一抗稀釋液、凝膠配制試劑盒、PMSF、RIPA裂解液BCA蛋白濃度測定，均購自上海碧云天公司；Transwell小室購自美國康寧公司；CCK-8購自日本同仁科技公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息學數(shù)據(jù)處理 登錄Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/resource/login.html)，在搜索框中輸入基因名“PXMP4”，選擇Cancer type：Colorectal cancer，點擊Gaedcke Colorectal數(shù)據(jù)進入數(shù)據(jù)獲取頁面并下載數(shù)據(jù)，分析PXMP4在結直腸癌及正常腸黏膜組織中的表達。

1.2.2免疫組化 采用免疫組化SP法染色，標本均經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，脫蠟，水化，PBS清洗。高壓修復、室溫冷卻，PBS清洗，加入3%H2O2阻斷內源性過氧化氫酶，PBS沖洗3次。山羊血清封閉1 h，甩干血清后，直接加入PXMP4特異性抗體，于4 ℃冰箱孵育過夜。次日，室溫下放置1 h。滴加山羊抗兔二抗，37 ℃孵育30 min，PBS清洗，DAB顯色，蘇木精復染、流水藍化、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封固。應用半定量積分法進行染色細胞判讀，隨機選取10個高倍視野。(1)根據(jù)陽性細胞百分數(shù)計分：陽性細胞數(shù)≤25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；(2)根據(jù)陽性細胞染色強度計分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分[7]。將兩項得分結果相乘：0～3分為陰性，4～6分為陽性。

1.2.3細胞培養(yǎng)與轉染 人結直腸癌細胞株均用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于5%CO2的37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。過表達組：空細胞組、空載組、PXMP4-HA組。干擾組：空細胞組、陰性對照組、干擾片段1組/2組/3組。轉染前對結直腸癌細胞株進行傳代，計數(shù)8.0×105個細胞均勻接種于6孔板中，使用無雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞生長密度約70%時，再行細胞轉染。按照Lipofectamine 2000使用說明書制備A液與B液混勻，室溫靜置20 min后加入6孔板中，總體積為2 μL。置于5%CO2的37 ℃恒溫箱中孵育6 h，更換為正常培養(yǎng)基24 h，收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.4Western blot法 本實驗提取細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。取已變性蛋白質30 μg和5 μL蛋白預染Marker，行SDS-PAGE凝膠電泳后移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1～2 h。加入一抗(1 ∶500)，4 ℃搖床孵育過夜，TBST清洗3次；加入二抗(1 ∶2 000)搖床室溫孵育2 h，TBST清洗3次，ECL發(fā)光成像。

1.2.5RT-PCR實驗 提取細胞總RNA，Nanodrop 2000核酸蛋白測定儀檢測RNA濃度和純度，使用Takara反轉錄試劑盒將RNA轉錄成為cDNA。反應條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。按Takara熒光定量試劑盒說明書操作步驟進行PCR擴增。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。用 2-ΔΔCt法計算PXMP4 的相對表達量，實驗重復3次。引物序列：GAPDH上游引物：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′；PXMP4上游引物：5′-TGTCGCCACAGGACCGGAA-3′，下游引物：5′-CAACTCATTGGAGTTGTTGC-3′。PXMP4三個干擾片段序列分別為：si-1(CGCTGGT CATGACCTTTCT)、si-2 (GTTGTCACGCGTCCTGTTT)、si-3 (CTGCGTTGGCCGTGCTTAA)。

1.2.6CCK-8檢測細胞增殖 將轉染24 h后的各組細胞以1×103個/孔接種于96孔板中，每孔100 μL，每組設3個重復孔。分別在1～6天向每孔加入10 μL的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標儀測量每孔在波長450 nm處吸光度(A450)，以時間為橫坐標，A450值為縱坐標，繪制細胞生長曲線，實驗重復3次。

1.2.7劃痕愈合實驗和Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲 細胞常規(guī)消化和鋪板，待細胞長至80%，用10 μL槍頭在6孔板中的背后平行劃3條線，然后孔內沿著與孔板背面線垂直的方向劃3條線，用PBS清洗細胞2次，加入2 mL的無血清培養(yǎng)基，分別于0、24、48 h在同一劃線相交處進行拍照記錄。

收集上述轉染過的細胞，計數(shù)4×104個細胞，用200 μL無血清培養(yǎng)基重懸，加入Transwell細胞培養(yǎng)板的小室上室(加基質膠)，下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。每組設3個復孔。在37 ℃、含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)48 h后，用棉簽輕輕拭去微孔膜上層的細胞，用4%多聚甲醛溶液固定下層細胞20 min，PBS沖洗3次；再用0.1%結晶紫染色液室溫染色10 min，PBS沖洗3次，隨機選取5個視野，光鏡下計數(shù)穿膜并黏附在膜下表面的細胞拍照記錄。

2 結果

2.1 結直腸癌中PXMP4的表達生物信息學結果表明：65例結直腸癌組織中有64例PXMP4 mRNA的相對表達量顯著高于正常腸黏膜組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，圖1)。免疫組化結果表明：PXMP4主要定位于細胞器膜上，染色呈強陽性，為棕褐色顆粒。本實驗結直腸癌組織中PXMP4的陽性率為71.429%(80/112)，高于正常腸黏膜組織(5.4%，6/112)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。

2.2 結直腸癌中PXMP4表達與臨床病理特征的關系本組結果表明：低分化組與高中分化組結直腸癌相比，低分化組中PXMP4蛋白表達升高(P<0.05)；有淋巴結轉移組與無淋巴結轉移組相比，有淋巴結轉移組中PXMP4蛋白表達升高(P<0.05)。PXMP4蛋白表達與患者性別、年齡和腫瘤大小均無相關性(P>0.05，表1)。

圖1 A.PXMP4 mRNA在結直腸癌和正常腸黏膜組織中表達；B.PXMP4 mRNA在結直腸癌和正常腸黏膜組織中表達分析

圖2 A.正常腸黏膜組織中PXMP4表達，SP法；B.結直腸癌組織中PXMP4表達，SP法

表1 結直腸癌中PXMP4表達與臨床病理特征的關系

2.3 過表達/干擾PXMP4結直腸癌的細胞株效率本組經(jīng)Western blot和RT-PCR檢測6株結直腸癌細胞中PXMP4內源性表達：高表達PXMP4的HCT116和SW620用于構建干擾細胞株，低表達PXMP4的RKO和SW480用于構建過表達細胞株(圖3A)。Western blot和RT-PCR結果顯示：與空細胞組和空載組相比，PXMP4-HA組PXMP4的表達顯著升高(P<0.05，圖3B)；與空細胞組和陰性對照組相比，干擾片段3組PXMP4的表達顯著降低(P<0.05，圖3C)，后續(xù)使用干擾片段3組進行功能實驗。

2.4 過表達/干擾PXMP4對結直腸癌細胞增殖的影響本組結果顯示：PXMP4-HA組與空細胞組和空載組相比，PXMP4-HA組細胞生長速度增快(P<0.05，圖4A、B)；與空細胞組和陰性對照組相比，干擾片段3組細胞生長速度降低(P<0.05，圖4C、D)。

2.5 過表達/干擾PXMP4對結直腸癌細胞遷移的影響本組結果顯示：PXMP4-HA組與空載組相比，其細胞遷移速度增快(P<0.05，圖5A)；干擾片段3組與陰性對照組相比，其細胞遷移速度降低(P<0.05，圖5B)。

2.6 過表達/干擾PXMP4對結直腸癌細胞侵襲的影響本組結果顯示：PXMP4-HA組與空載組相比，其細胞穿過小室基膜的細胞數(shù)顯著增加(P<0.05，圖6A)；干擾片段3組與陰性對照組相比，其細胞穿過小室基膜的細胞數(shù)顯著減少(P<0.05，圖6B)。

3 討論

結直腸癌是全球常見的癌癥之一，病死率僅次于肺癌、肝癌和胃癌。結直腸癌患者的治療以手術切除為主，但術后仍有復發(fā)和轉移[1-4]。目前，結直腸癌的發(fā)生機制尚未完全闡明，因此探討結直腸癌發(fā)病機制已成為研究熱點。

過氧化物酶體存在所有真核細胞的基本細胞器中，含有一系列生物化學反應所需的酶類，在多種細胞分解代謝和合成代謝途徑中起重要作用[8-9]。編碼過氧化物酶體蛋白的人類基因缺陷可能導致不同的過氧化物酶體功能紊亂。PXMP4是過氧化物酶體固有膜蛋白。據(jù)國外文獻報道PXMP4的5′-CPG區(qū)胞嘧啶甲基化后沉默PXMP4 mRNA的表達，即PXMP4在前列腺上皮細胞中和雄激素依賴的前列腺癌細胞中表達，而在雄激素非依賴的前列腺癌細胞中不表達。PXMP4啟動子區(qū)的甲基化可能是一種分子機制參與其過程[10-11]。DNA甲基化介導的PXMP4轉錄沉默在雄激素依賴的前列腺癌向雄激素非依賴的前列腺癌轉變中起重要作用[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)單個內含子CpG二核苷酸通過DNA甲基化在PXMP4基因調控中的關鍵作用，提示甲基化介導的PXMP4沉默是與前列腺癌發(fā)生相關的分子事件，表明PXMP4在前列腺癌中作為一種抑癌基因發(fā)揮其抗腫瘤作用[15-17]。目前，PXMP4在結直腸癌中的作用報道較少。本組通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)PXMP4是正常結直腸和癌組織的差異表達基因。免疫組化證實PXMP4蛋白的表達在結直腸癌組織中顯著增強，其與腫瘤分化及有無淋巴結轉移密切相關。構建過表達/干擾PXMP4的結直腸癌細胞株實驗表明：過表達PXMP4能促進結直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移，干擾PXMP4能抑制結直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移。

圖3 A.Western blot和RT-PCR檢測6株結直腸癌細胞中PXMP4表達；B. Western blot和RT-PCR檢測過表達PXMP4細胞株中PXMP4表達；C.Western blot 和RT-PCR檢測干擾PXMP4細胞株中PXMP4表達

圖4 CCK-8法檢測過表達PXMP4對RKO(A)和SW480(B)細胞增殖的影響；CCK-8法檢測干擾PXMP4對HCT116(C)和SW620(D)細胞增殖的影響

圖5 A.劃痕愈合實驗檢測過表達PXMP4對RKO和SW480細胞遷移的影響；B.劃痕愈合實驗檢測干擾PXMP4對HCT116和SW620細胞遷移的影響

圖6 A.Transwell實驗檢測過表達PXMP4對RKO和SW480細胞侵襲的影響，結晶紫染色；B.Transwell實驗檢測干擾PXMP4對HCT116和SW620細胞侵襲的影響，結晶紫染色

總之，PXMP4在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮促癌基因的功能，為臨床制定新的結直腸癌治療策略、評估患者預后提供新的靶點。