牛巴貝斯蟲病診斷技術(shù)研究進(jìn)展

張 峰，王正榮，蔣建軍，薄新文，張艷艷

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000；2.省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆石河子 832000)

牛巴貝斯蟲病是一種由巴貝斯蟲屬(Babesia)原蟲所引起的血液寄生蟲病，主要通過硬蜱在人與動(dòng)物之間傳播[1]。自1888年首次在牛的紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)雙芽巴貝斯蟲(Babesiabigemina)以來，迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有100余種巴貝斯蟲，其中對(duì)牛危害最大的主要是牛巴貝斯蟲(B.bovis)、雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)、分歧巴貝斯蟲(B.divergens)[2-3]。牛巴貝斯蟲病作為一種世界性動(dòng)物寄生蟲病，在熱帶及亞熱帶地區(qū)發(fā)生較為嚴(yán)重，常成地方季節(jié)性流行。其流行范圍之所以如此廣泛，與其傳播媒介硬蜱密切相關(guān)[4]。硬蜱是巴貝斯蟲的主要傳播媒介，硬蜱科中微小牛蜱(Boophilusmicroplus)、環(huán)形牛蜱 (B.annulatus)、篦子硬蜱(Ixodesricinus)、全溝硬蜱(I.persulcatus)、鐮形扇頭蜱(Rhipicephalushaemaphysaloides)、外翻扇頭蜱(R.evertsi)等均可傳播巴貝斯蟲[5]。牛巴貝斯蟲病的臨床特征主要以高熱稽留、貧血、精神沉郁、厭食、脫水以及血紅蛋白尿，嚴(yán)重時(shí)可引起動(dòng)物體的死亡[6]。神經(jīng)癥狀是由于牛巴貝斯蟲(B.bovis)感染的紅細(xì)胞存留于大腦毛細(xì)血管中而產(chǎn)生的，且牛巴貝斯蟲的持續(xù)性感染可能會(huì)持續(xù)終生[7]。此外，分歧巴貝斯蟲(B.divergens)作為一種人畜共患病，具有重要的意義。

目前已經(jīng)有不同的技術(shù)來診斷牛巴貝斯蟲病，通常首選姬姆薩染色法，顯微鏡下顯示寄生蟲的存在作為臨床癥狀的病因。血清學(xué)試驗(yàn)包括了間接熒光抗體試驗(yàn)(indirect fluorescent antibody test，IFAT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和免疫層析試驗(yàn)(immunochromatography est，ICT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complement fixation test，CFT)等，這些試驗(yàn)提供了體液免疫應(yīng)答的信息，可通過抗原或抗體來診斷牛巴貝斯蟲病。近些年來，由于PCR技術(shù)已經(jīng)逐漸成熟，用以檢測(cè)血液中巴貝斯蟲DNA的分子方法具有很高的靈敏度和特異性，已被證明是進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的有力工具。

1 血涂片檢測(cè)

血涂片是檢測(cè)血液中寄生蟲最簡(jiǎn)單直接的方法。寄生蟲的檢測(cè)可以通過姬姆薩染色的血涂片來完成，但染色涂片的敏感度較低，因此經(jīng)常觀察到假陰性[8]。更重要的是，血涂片檢測(cè)只能觀察到急性期感染的紅細(xì)胞。在感染初期或者慢性感染時(shí)，血液染蟲率較低，不利于蟲體的檢測(cè)。通過顯微鏡對(duì)于急性感染期的牛巴貝斯蟲病進(jìn)行鏡檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛巴貝斯蟲(B.bovis)的紅細(xì)胞染蟲率低于0.5%，雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)的紅細(xì)胞感染率在3%左右[9]，分歧巴貝斯蟲(B.divergens)的紅細(xì)胞感染率可達(dá)35%～40%[6]。牛巴貝斯蟲的持續(xù)性感染可能會(huì)持續(xù)終生，而雙芽巴貝斯蟲感染動(dòng)物后可持續(xù)長(zhǎng)達(dá)22個(gè)月。

用姬姆薩染色的血涂片，可以通過高倍鏡檢測(cè)寄生蟲。對(duì)于感染病牛耳廓或尾部的毛細(xì)血管進(jìn)行采血時(shí)，通過血涂片可以檢測(cè)到牛巴貝斯蟲(B.bovis)；而通過靜脈采血可以檢測(cè)到雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)和分歧巴貝斯蟲(B.divergens)[10]。對(duì)于分歧巴貝斯蟲(B.divergens)，薄涂片是觀察該寄生蟲的首選方法。在形態(tài)學(xué)上，分歧巴貝斯蟲(B.divergens)的大小為1.5 μm～1.9 μm，屬于小型蟲體，蟲體典型形狀為成對(duì)的梨籽形；分歧巴貝斯蟲病通常發(fā)展迅速，寄生蟲血癥在5%～80%不等，所以該寄生蟲很容易用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)出來[11]。雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)大小為2.3 μm～5 μm，蟲體長(zhǎng)度大于紅細(xì)胞，屬于大型蟲體，呈成對(duì)梨籽狀，兩蟲體尖端成銳角并位于紅細(xì)胞中央，每個(gè)紅細(xì)胞蟲體數(shù)目在1個(gè)～2個(gè)。牛巴貝斯蟲(B.bovis)大小為1.5 μm～2 μm，蟲體長(zhǎng)度小于紅細(xì)胞半徑，屬于小型蟲體；蟲體典型形狀為成對(duì)的梨籽形，尖端相連呈鈍角且位于紅細(xì)胞中央，蟲體常為空泡狀。

尸檢時(shí)宜采集腦、腎、心肌、肝、肺組織標(biāo)本。在感染牛巴貝斯蟲的動(dòng)物中，外周血液中的紅細(xì)胞染蟲率較低，一般不超過1%；然而，在腦組織的涂片中紅細(xì)胞染蟲率高達(dá)90%[12]。這是由于感染的紅細(xì)胞明顯隔離在腦、腎和腎上腺的微血管床上，特別是在脾切除的動(dòng)物身上。通過枕孔獲得的小腦樣本已被用于對(duì)長(zhǎng)期感染牛巴貝斯蟲(B.bovis)的顯微鏡檢測(cè)[13]。

2 血清學(xué)檢測(cè)

在巴貝斯蟲病流行區(qū)飼養(yǎng)的牛中，血液中的寄生蟲數(shù)量非常低，低于鏡檢技術(shù)的閾值。因此，血清學(xué)方法如間接熒光抗體試驗(yàn)(IFAT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)常被使用。但是這些技術(shù)的主要缺點(diǎn)在于高抗體滴度并不一定能證明寄生蟲感染的存在，也不一定能證明保護(hù)性免疫的存在。當(dāng)使用血清學(xué)分析時(shí)，不能夠有效地區(qū)分感染的時(shí)間(以前還是現(xiàn)在)。因?yàn)榭贵w可能持續(xù)的時(shí)間很長(zhǎng)，即使是在巴貝斯蟲被清除的動(dòng)物體內(nèi)[14]。

2.1 間接熒光抗體試驗(yàn)

間接熒光抗體試驗(yàn)(indirect fluorescence antibody test，IFAT)結(jié)合了熒光顯微鏡的高靈敏度和免疫學(xué)方法的特異性，得到了十分廣泛的應(yīng)用。早在1964年的時(shí)候，曾被報(bào)道用于駑巴貝斯的檢測(cè)。IFAT提供了足夠的靈敏度，而且易于操作。但是結(jié)果易受操作者主觀判斷的影響，只能定性檢測(cè)。最重要的一點(diǎn)是，在牛巴貝斯蟲(B.bovis)和雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)抗體之間存在交叉反應(yīng)，大大降低了IFAT的特異性[15]。Nayel M等[16]曾利用血涂片、IFAT和PCR三種方法對(duì)于隨機(jī)抽取的158頭不同年齡、性別和品種的牛進(jìn)行巴貝斯蟲病和泰勒蟲病的調(diào)查和診斷，結(jié)果顯示，血涂片的巴貝斯蟲陽(yáng)性率為10.76%(17頭)，泰勒蟲陽(yáng)性率為20.9%(33頭)；IFAT對(duì)于巴貝斯蟲和泰勒蟲的陽(yáng)性率分別是15.82%(25頭)和20.89%(30頭)；PCR對(duì)巴貝斯蟲和泰勒蟲的檢測(cè)陽(yáng)性率分別為12.66%(20頭)和24.05%(38頭)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理，IFAT和PCR無(wú)顯著差異，且血涂片可用于急性感染，IFAT和PCR也可應(yīng)用于慢性感染。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

在所有血清學(xué)的診斷方法中，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)是最有前途的診斷工具。它不僅在于能批量檢測(cè)樣品，不存在主觀判斷的差異，而且特異性也比IFAT有了很大的提高。最初從感染紅細(xì)胞的裂殖子裂解物中提取粗制抗原，但是常常造成不同蟲種的交叉反應(yīng)，造成大量的假陽(yáng)性[17-18]。

目前建立了基于血清抗體抑制單克隆抗體(mAb)結(jié)合能力的競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(cELISA)。以純化的重組牛巴貝斯蟲(B.bovis)RAP-1C端構(gòu)建物作為抗原，檢測(cè)血清抗體對(duì)單克隆抗體與RAP-1特異性表位結(jié)合的抑制作用，用以檢測(cè)陽(yáng)性牛[17]，這避免了與雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)的牛血清發(fā)生交叉反應(yīng)。同樣的，也可以用雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)的RAP-1C端構(gòu)建物作為抗原來檢測(cè)陽(yáng)性牛。使用該方法在患病率為75%的地區(qū)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為100%和95.9%。這不僅能用于早期感染的檢測(cè)，也適用于長(zhǎng)期攜帶階段的檢測(cè)。

此外，還有一種嵌合多抗原的間接ELISA方法，該多抗原由牛巴貝斯蟲(B.bovis)抗原MSA-2c、RAP-1和熱休克蛋白20的B表位和T表位基因片段組成，且敏感度和特異度分別為95.9%和94.3%[19]?？傊?，正是因?yàn)镋LISA的簡(jiǎn)便性和客觀性，且能同時(shí)檢測(cè)大量樣本，已取代IFAT成為診斷實(shí)驗(yàn)室首選的血清學(xué)檢測(cè)方法。

2.3 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)

補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complement fixation test，CFT)是將抗原抗體結(jié)合物與補(bǔ)體結(jié)合，通過補(bǔ)體的消耗現(xiàn)象來檢測(cè)出抗體或抗原的試驗(yàn)。CFT反應(yīng)依賴于補(bǔ)體固定抗體的存在，其中大多數(shù)重要的同型抗體是IgM免疫球蛋白。因此，可以檢測(cè)到早期感染，但不適合檢測(cè)慢性感染的動(dòng)物[20]。通過野外采集的牛血樣本，在不同的研究中對(duì)于ELISA和CFT進(jìn)行了比較。雖然兩種檢測(cè)方法都能檢測(cè)和鑒定牛巴貝斯蟲(B.bovis)和雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)，但是與CFT相比，IFAT具有抗體檢測(cè)早、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)[21]。此外，Alvarez J A等[22]還將CFT與與ELISA和IFAT進(jìn)行了比較，結(jié)果具有很高的一致性，其CFT的敏感性和特異性分別為90.9%和97.6%。因此CFT檢測(cè)被認(rèn)為是一種敏感、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，適用于流行病學(xué)調(diào)查。

2.4 免疫層析法

血清學(xué)檢測(cè)通常存在著資源設(shè)備、訓(xùn)練有素的試驗(yàn)人員、工作量大以及耗時(shí)等問題。而免疫層析法(immunochromatography，ICT)的出現(xiàn)和發(fā)展在一定程度上解決了這些問題。ICT是一種基于硝酸纖維素膜的免疫分析方法，不需要任何儀器，快速、靈敏。此外，它可直接在牧場(chǎng)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，且在15 min內(nèi)就可以出結(jié)果[23]。

以牛巴貝斯蟲(B.bovis)重組裂殖子表面抗原(RMSA-2c)和雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)相關(guān)蛋白-1(rRAP1/CT)的C端部分為基礎(chǔ)，建立了檢測(cè)感染牛巴貝斯蟲(B.bovis)和雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)抗體的ICT方法。與ELISA和IFAT比較，ICT檢測(cè)牛巴貝斯蟲(B.bovis)抗體的一致性分別為92.3%和90.3%；而檢測(cè)雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)抗體的一致性分別為96.8%和92.5%，且未見交叉反應(yīng)[24]。

在另一項(xiàng)研究中顯示，使用ICT分別檢測(cè)牛巴貝斯蟲(B.bovis)和雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)的抗體，并將野外采集的牛血樣本進(jìn)行雙重ICT檢測(cè)時(shí)，與ELISA相比，Kappa系數(shù)>0.7[25]。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)

血清學(xué)檢測(cè)的方法只適用于特定寄生蟲抗體的存在，然而抗體的產(chǎn)生需要一個(gè)過程，且又會(huì)消失，無(wú)法檢測(cè)感染初期以及免疫耐過的動(dòng)物。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于PCR技術(shù)檢測(cè)血液中巴貝斯蟲DNA的分子方法具有很高的靈敏度和特異性，近些年來，針對(duì)牛巴貝斯蟲棒狀體相關(guān)蛋白-1 (BbovRAP-1)、牛巴貝斯蟲球體蛋白-2 (BboSBP-2)、牛巴貝斯蟲球體蛋白-4(BboSBP-4)、雙芽巴貝斯蟲頂膜抗原-1 (BbiAMA-1)和雙芽巴貝斯蟲棒狀體相關(guān)蛋白-1a(BbiRAP-1a)的巢式PCR分析已被證明是進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的有力工具[26-29]。分子生物學(xué)診斷技術(shù)由于具有高度的敏感性、特異性和快速等特點(diǎn)，給巴貝斯蟲的診斷和鑒別提供了快速有效的工具。

3.1 聚合酶鏈反應(yīng)

由于外周血液中寄生蟲數(shù)量很少，很難檢測(cè)到巴貝斯蟲感染。因此，以DNA為基礎(chǔ)的分子方法便發(fā)展起來，它具有分析靈敏度高、特異性高等優(yōu)點(diǎn)。其中之一便是聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，它是利用DNA雙鏈在高溫時(shí)解旋變成單鏈，溫度低時(shí)引物與單鏈堿基互補(bǔ)配對(duì)，隨后溫度升至72℃，DNA聚合酶沿5′至3′形成互補(bǔ)鏈，循環(huán)多次，使得目的基因擴(kuò)增。PCR檢測(cè)與體外培養(yǎng)寄生蟲相比，它更快速，具有較高的靈敏度和特異性，通過對(duì)擴(kuò)增片段測(cè)序來確認(rèn)該檢測(cè)的特異性。而PCR檢測(cè)的缺點(diǎn)在于PCR的設(shè)置和運(yùn)行需要技術(shù)技能，可能存在污染風(fēng)險(xiǎn)，并且設(shè)備、耗材和試劑的成本較高等。

雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)第一個(gè)被用于PCR分析，目前已存在不同形式的PCR。PCR-DNA分析與非放射性DNA探針相結(jié)合，能夠靈敏地檢測(cè)出雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)。靈敏度分析顯示，檢測(cè)到低至100 fg的寄生蟲基因組DNA，可用于無(wú)癥狀攜帶者動(dòng)物的檢測(cè)。在牛巴貝斯蟲(B.bovis)中，可通過以細(xì)胞色素B為目的基因進(jìn)行PCR，靈敏度約為每0.5 mL血液中就有一個(gè)被感染的紅細(xì)胞，且對(duì)牛巴貝斯蟲(B.bovis)具有很高的特異性[30]。此外，PCR的特異性基因檢測(cè)可用于鑒定不同地理區(qū)域梨形蟲的種類。當(dāng)使用多重PCR來檢測(cè)同一血液樣品中的雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)和牛巴貝斯蟲(B.bovis)時(shí)，其分析靈敏度均為0.000 01%。

3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。與常規(guī)PCR法相比，它無(wú)需凝膠電泳的可視化，具有快速、自動(dòng)擴(kuò)增、低交叉污染等優(yōu)點(diǎn)。為了檢測(cè)和測(cè)量目標(biāo)DNA的數(shù)量，必須產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)，該信號(hào)與實(shí)時(shí)放大產(chǎn)物的數(shù)量成正比。在RT-qPCR中，與傳統(tǒng)PCR相比，整個(gè)檢測(cè)需要更少的模板材料。但其缺點(diǎn)在于設(shè)備過于昂貴，開發(fā)化驗(yàn)需要更高的專業(yè)知識(shí)和技術(shù)技能。

此外，RT-qPCR具有較高的靈敏度、特異性和重復(fù)性，這些特點(diǎn)有利于將其用于持續(xù)感染動(dòng)物的診斷和量化。通過使用RT-qPCR檢測(cè)，在血液樣本中檢測(cè)到的巴貝斯蟲感染濃度比標(biāo)準(zhǔn)PCR檢測(cè)低1 000倍[31]。Okino C H等人[32]證實(shí)，RT-qPCR比直接鏡檢更能從犢牛體中檢測(cè)到牛巴貝斯蟲(B.bovis) (準(zhǔn)確率分別為100%和10%)。目前，RT-qPCR的研究已經(jīng)顯示出更高的敏感性和特異性，且變異更小，為患病牛巴貝斯蟲的檢測(cè)提供了極好的有效性和可靠性。

3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediated isothermal Amplification，LAMP)是在2000年一位日本學(xué)者Notomi公開的一種新的基因診斷技術(shù)。它是對(duì)其靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63℃左右) 保溫30 min～60 min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，是一種快速、廉價(jià)、高度靈敏和特異的檢測(cè)方法，且檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。該技術(shù)在2004年成功用于吉布森巴貝斯蟲的檢測(cè)，隨后成功應(yīng)用于犬巴貝斯蟲的檢測(cè)。LAMP亦可用于檢測(cè)雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)和牛巴貝斯蟲(B.bovis)，且對(duì)于兩種巴貝斯蟲的分析敏感度均為0.1pg DNA[33]。Iseki H等[34]建立了多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(multiplex loop-mediated isothermal amplification，mLAMP)方法，設(shè)計(jì)了牛巴貝斯蟲(B.bovis)和雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)相關(guān)蛋白-1基因的引物，并在引物中插入一個(gè)限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)，將8個(gè)總引物組合起來，建立了同時(shí)檢測(cè)雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)和牛巴貝斯蟲(B.bovis)的mLAMP方法。

通過對(duì)LAMP技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，去除了凝膠電泳，用色譜橫向流動(dòng)試紙(LAMP-LFP)的方法，能夠更簡(jiǎn)單、快速的觀察到結(jié)果。LAMP-LFP包括一組的4個(gè)引物和在等溫條件下擴(kuò)增巴貝斯蟲細(xì)胞色素b基因的6個(gè)不同區(qū)域。該方法可分別檢測(cè)到0.85fg和0.14fg的雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)和牛巴貝斯蟲(B.bovis)，其分析靈敏度是常規(guī)PCR方法的100倍。LAMP-LFP可用于檢測(cè)寄生蟲感染量非常低的動(dòng)物[35]。LAMP被認(rèn)為是一種簡(jiǎn)單的診斷方法，不需要特殊設(shè)備，速度快，不易污染。該方法可用于現(xiàn)場(chǎng)大量樣品的篩選。因此，它作為牛巴貝斯蟲病分子診斷工具具有廣闊的應(yīng)用前景。

4 其他檢測(cè)方法

通過異種診斷也可以檢測(cè)到感染動(dòng)物中寄生蟲的存在。將感染巴貝斯蟲的血液分別接種至脾切除的犢牛來分離雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)和牛巴貝斯蟲(B.bovis)，或接種至沙鼠身上以分離分歧巴貝斯蟲(B.divergens)。蒙古沙鼠(Merionesunguiculatus)是感染分歧巴貝斯蟲(B.divergens)的優(yōu)良實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，在感染分歧巴貝斯蟲(B.divergens)后，表現(xiàn)出急性癥狀且能引起宿主死亡[15]。但是動(dòng)物接種不適合用于診斷的目的，因?yàn)樗ㄙM(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)。但是通過異種診斷，在接種后的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分子檢測(cè)，可能是一個(gè)更準(zhǔn)確可靠的方法，因?yàn)榧词乖诩纳x血癥非常低的情況下，也可以檢測(cè)出活的寄生蟲和DNA。

Claudia K等[36]曾報(bào)道了一種基于牛巴貝斯蟲(B.bovis)感染紅細(xì)胞阻抗譜的高分辨率、高特異性細(xì)胞檢測(cè)和分離的微流控裝置。因?yàn)榘准?xì)胞或血小板的介電特性與感染紅細(xì)胞的介電特性不同，所以不需要提前對(duì)全血樣進(jìn)行任何處理。雖然該生物傳感器在檢測(cè)1%以上的寄生蟲時(shí)也存在一定的局限性，該設(shè)備已被提出用于制備正常的和感染牛巴貝斯蟲(B.bovis)的紅細(xì)胞群體。

流式細(xì)胞術(shù)是另一種技術(shù)，它可以分析宿主紅細(xì)胞中分歧巴貝斯蟲(B.divergens)的不同發(fā)育階段，并對(duì)寄生蟲血癥的變化進(jìn)行量化。此外，利用熒光活化細(xì)胞分選儀也可分離并克隆牛巴貝斯蟲(B.bovis)，以便研究這些寄生蟲種群的毒力表型。

5 小結(jié)

畜牧業(yè)作為我國(guó)傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)和基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè)，是我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的一大支柱產(chǎn)業(yè)。牛巴貝斯蟲病對(duì)畜牧業(yè)的危害極大，嚴(yán)重?fù)p害了我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，因此可靠、便利的診斷方法是有效防控該病的關(guān)鍵。目前對(duì)于牛巴貝斯蟲病的診斷已取得了一定的進(jìn)展，論文重點(diǎn)介紹了光學(xué)顯微鏡的直接檢測(cè)，對(duì)感染動(dòng)物進(jìn)行特異性抗體檢測(cè)的血清學(xué)技術(shù)，基于常規(guī)PCR原理所產(chǎn)生的一系列高靈敏度、高特異性分子檢測(cè)技術(shù)，以及雖然繁瑣耗時(shí)，但可用于合適實(shí)驗(yàn)室條件的牛巴貝斯蟲體外培養(yǎng)技術(shù)。這些診斷技術(shù)各有特點(diǎn)，雖然因?yàn)閮x器與技術(shù)的原因，大部分診斷方法可能僅限于實(shí)驗(yàn)室，具有一定的局限性，但是仍具有著廣闊的發(fā)展前景。隨著診斷技術(shù)的不斷完善，更加簡(jiǎn)便有效的診斷方法將會(huì)產(chǎn)生，牛巴貝斯蟲病會(huì)得到更為有效的控制，甚至消滅。