哺乳動(dòng)物性別決定及相關(guān)基因研究進(jìn)展

謝曉剛，賈燕青，仇薪鑫，羅 艷，張振倉，李 丹，馬乃祥*，權(quán)富生*

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物工程分院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

動(dòng)物的性別是指伴隨著有性生殖的出現(xiàn)，在生物界同種個(gè)體之間普遍出現(xiàn)的一種形態(tài)和生理上的差異現(xiàn)象，它是由于減數(shù)分裂以及配子融合從而基因組發(fā)生重組的結(jié)果，對(duì)真核生物來說是非常普遍的，包含了一系列復(fù)雜的機(jī)制[1]。

哺乳動(dòng)物性別決定(sex determination)是指其在有性繁殖過程中，形成了性別分化，并在其種群內(nèi)形成了有差異的雌、雄個(gè)體。在精子和卵子受精之后，受精卵開始發(fā)育，存在于性染色體上性別決定基因開始起作用，使得受精之后胚胎逐漸形成了雄性和雌性的性別差異。從遺傳學(xué)角度來看，則是在有性生殖生物中決定雌、雄性別分化的機(jī)制[2]。哺乳動(dòng)物性別決定一直以來都是生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，但是到目前為止，其具體的的調(diào)控機(jī)制仍然不太清楚。

對(duì)于二倍體脊椎動(dòng)物來說，后代的性別是由父本貢獻(xiàn)的性染色體所決定的。在大多數(shù)情況下，尤其是對(duì)于哺乳動(dòng)物來說，個(gè)體的性別決定在受精時(shí)就會(huì)形成[3]。動(dòng)物的性別決定機(jī)制可以分為兩種，即遺傳性別決定和環(huán)境性別決定。遺傳性別決定一般都是由位于性染色體上的決定基因啟動(dòng)一系列性別相關(guān)基因參與的分子信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)原始性腺發(fā)育成雄性或者雌性生殖腺的過程[4]。

隨著近些年科學(xué)工作者對(duì)對(duì)哺乳動(dòng)物性別決定機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)了一系列與性別決定和性別分化相關(guān)的基因及信號(hào)通路，它們?cè)趧?dòng)物性別決定、性腺分化以及生殖和發(fā)育等生物學(xué)過程中起重要作用。本文介紹了幾種研究最廣的哺乳動(dòng)物性別決定相關(guān)因子。

1 Zfy和Zfx基因

除了極少數(shù)個(gè)體之外，絕大多數(shù)的動(dòng)物都是雌雄異體，參與動(dòng)物的性別決定、性腺發(fā)育及分化的相關(guān)基因及其具體調(diào)控機(jī)制復(fù)雜多樣。Y染色體在精子發(fā)生和性別決定中起重要的作用。位于哺乳動(dòng)物Y染色體短臂(Yp)上的Zfy(Y chromosome linked zinc-finger protein transcriptional factor，Y染色體相關(guān)鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子)基因，當(dāng)初一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，就被認(rèn)為是最重要的性別決定基因(sex determining gene)之一[5]。近些年來，隨著科學(xué)工作者對(duì)Zfy基因的深入研究，其在哺乳動(dòng)物性別決定及精子形成過程中的重要作用被逐漸闡明。

Zfy基因是位于Y染色體短臂(Yp)上一個(gè)相關(guān)的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，其基因家族還包括位于X染色體上的Zfx基因和位于常染色體上的Zfa基因。Zfy基因在哺乳動(dòng)物圓形精子細(xì)胞中高表達(dá)[6]。Zfx/Zfy這一對(duì)等位基因是一對(duì)具有高度保守性的旁系同源基因，同源性很高。在小鼠中，已經(jīng)鑒定得到了2個(gè)Zfy基因，即Zfy1基因和Zfy2基因，都位于Y染色體短臂上，在小鼠的性別決定及精子形成過程中具有重要的作用[7]。而在人類、牛、羊等動(dòng)物的Y染色體上，均只有一個(gè)Zfy基因。

Zfy蛋白包含12個(gè)～13個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，其前面是大的酸性活化結(jié)構(gòu)域并且具有修飾的反式激活潛力，其產(chǎn)生一個(gè)保守的編碼鋅指蛋白的睪丸特異性轉(zhuǎn)錄物，其在各種生物學(xué)過程中起重要的作用，包括基因的表達(dá)、分化和胚胎發(fā)育等[8]。在減數(shù)分裂期間，Zfy1基因的的功能與Zfy2基因不同，在減數(shù)分裂性染色體失活(meiotic sex chromosome inactivation，MSCI)中，Zfy1基因缺少一個(gè)外顯子，其編碼的酸性區(qū)域(acidic domain)約為Zfy2之前占主導(dǎo)地位的酸性區(qū)域的一半[9]。Zfy1在睪丸中存在可變剪切，并產(chǎn)生兩種不同的轉(zhuǎn)錄本，分別是全長(zhǎng)型轉(zhuǎn)錄本和一個(gè)缺乏主要酸性結(jié)構(gòu)域外顯子的睪丸特異性短型轉(zhuǎn)錄本。短型轉(zhuǎn)錄本是減數(shù)分裂前精原細(xì)胞的主要變體，而長(zhǎng)型轉(zhuǎn)錄本是減數(shù)分裂后精子細(xì)胞的主要變體。在人類中，有且只有一個(gè)Zfy基因拷貝，其功能類似于小鼠的Zfy1基因，也就是說，人類Zfy產(chǎn)生兩種不同的轉(zhuǎn)錄變體，全長(zhǎng)形式和缺乏主要酸性域外顯子的睪丸特異性短型形式[9]。鑒于Zfy基因的這種睪丸特異性剪接在人和小鼠之間是保守的，Zfy基因在牛羊等動(dòng)物中很可能也存在長(zhǎng)型和短型兩種剪接變體。與其旁系同源基因Zfx基因不同，Zfy基因與性別鑒定密切相關(guān)。近些年的研究表明，Zfy2基因是小鼠次級(jí)精母細(xì)胞有效完成第二次減數(shù)分裂的必要條件[10]，使得小鼠次級(jí)精母細(xì)胞能夠產(chǎn)生單倍體圓形精子細(xì)胞，對(duì)于精子頭部重組，以及精子尾部發(fā)育具有重要的作用[11]。此外，Zfy基因在減數(shù)分裂性染色體失活、小鼠精子的發(fā)生、受精和殖繁過程中具有重要作用[7]。SRY、Eif2s3y和Zfy2作為3個(gè)關(guān)鍵基因，在人工受精中精子功能的獲得和產(chǎn)生小鼠后代上也具有重要作用[12]。

Zfx基因被認(rèn)為是受X染色體失活的保守旁系同源基因。Zfx基因在干細(xì)胞中廣泛表達(dá)并控制胚胎和造血干細(xì)胞的自我更新[13]。在第二次減數(shù)分裂階段，一個(gè)Y型二倍體精子細(xì)胞可以發(fā)育為兩個(gè)Y型圓形精子細(xì)胞(Ⅷ)，然后產(chǎn)生兩個(gè)Y精子。具有轉(zhuǎn)錄功能的鋅指基因在單倍體精子細(xì)胞和Y精子中具體稱為Zfy。Zfy基因的mRNA水平在精子發(fā)生周期的第Ⅷ階段達(dá)到一個(gè)峰值[14]，而Zfx基因其表達(dá)峰值在Ⅰ-Ⅻ階段。X精子和Y精子之間存在平衡，在此期間，受精后會(huì)誘導(dǎo)后代性別比例的平衡[3]。

近年來，有一系列研究表明，利用RNA干擾(RNA interference，RNAi)的方式降低Zfy基因或者Zfx基因mRNA的表達(dá)量，來破壞單倍體精子的發(fā)育，可以引起后代性別比率的偏移，作為一種控制后代性別比例的方法，其已經(jīng)在小鼠，以及牛、綿羊、馬鹿[15-16]等家畜動(dòng)物上實(shí)現(xiàn)。此外，基因編輯技術(shù)作為一種重要的基因功能研究方法，隨著近些年來其快速發(fā)展，也為研究牛羊Zfy基因的功能、探索一種新的研究方法來控制牛羊后代的性別比例提供了便利，將為牛羊等家畜動(dòng)物的種群繁殖和穩(wěn)定性奠定良好基礎(chǔ)。

2 SRY基因

SRY(sex determining region of Y chromosome，Y染色體性別決定區(qū))基因也是位于Y染色體短臂(Yp)上的特異性性別決定基因，是目前公認(rèn)的睪丸決定因子(testis determining factor，TDF)，在哺乳動(dòng)物的性別決定中具有重要的作用，是哺乳動(dòng)物性別決定的總開關(guān)。

1990年，Sinclair A H等人在人體內(nèi)克隆到Y(jié)染色體上一個(gè)特異性性別決定基因，即SRY基因[17]。隨后幾年，在很多動(dòng)物體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了SRY基因，其長(zhǎng)度為35kb左右，編碼79個(gè)氨基酸，SRY蛋白含有一個(gè)典型的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即高泳動(dòng)類非組蛋白(high mobility group，HMG)盒基序，類似于已知的轉(zhuǎn)錄因子，所以推測(cè)SRY編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子[18]。HMG也是SRY基因主要的功能區(qū)，研究發(fā)現(xiàn)，人與哺乳動(dòng)物的HMG區(qū)域的同源性高達(dá)70%。有研究發(fā)現(xiàn)，在人體內(nèi)SRY基因僅在生殖嵴中的一小部分細(xì)胞中表達(dá)并啟動(dòng)雄性發(fā)育[19]。在小鼠體內(nèi)，SRY基因僅在生殖嵴的中心區(qū)域低表達(dá)，SRY基因隨著小鼠性腺的發(fā)育表達(dá)量遞增，性腺開始分化后SRY基因?qū)⑼Ｖ贡磉_(dá)[20]。

SRY基因的發(fā)現(xiàn)是哺乳動(dòng)物性別決定研究過程中的一個(gè)里程碑，為家畜動(dòng)物動(dòng)物早期性別鑒定奠定了理論基礎(chǔ)。作為傳統(tǒng)的性別決定因子，SRY基因在性別控制(sex control)上的研究一直受到人們的追捧。1991年，Koopman P等將一段含有SRY基因的序列導(dǎo)入到小鼠胚胎內(nèi)，在出生的小鼠中，部分染色體為XX型的雌性小鼠會(huì)出現(xiàn)性別反轉(zhuǎn)，成為雄性，其大小和體重與正常小鼠相比沒有明顯不同，與野生型雌性小鼠相比，其交配方式也無明顯不同，然而小鼠失去了生殖能力，不能產(chǎn)生后代[21]。2012年，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所的吳寧等人利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建了靶向小鼠性別決定基因——SRY基因的干擾載體，通過在對(duì)懷孕母鼠和受精卵的注射之后發(fā)現(xiàn)，SRY基因的沉默顯著影響了小鼠性腺和睪丸的發(fā)育，且位于常染色體上與性別有關(guān)的基因WT1基因顯著升高[22]。2013年，Kato T等利用TALEN技術(shù)結(jié)合原核注射技術(shù)生產(chǎn)出了敲除SRY基因后代小鼠，發(fā)現(xiàn)SRY基因敲除的雄性小鼠出現(xiàn)了性別的轉(zhuǎn)化，既基因型為XY型的小鼠出現(xiàn)了完全的雌性表型，具有像雌鼠一樣的內(nèi)生殖器等，但是這些小鼠是不育的，與正常小鼠交配不能產(chǎn)生后代，且SRY基因的敲除影響了性腺的發(fā)育[23]。2017年，Song Y等人的研究發(fā)現(xiàn)Sp1基因可以作為SRY基因轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)控因子，Sp1基因的突變會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)兔子性別發(fā)生反轉(zhuǎn)[24]。

可以發(fā)現(xiàn)，SRY在性別決定過程中具有重要作用，SRY基因的導(dǎo)入也可以實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性別的轉(zhuǎn)化，然而其個(gè)體的生殖能力會(huì)受到影響，不能產(chǎn)生后代，使得很難將SRY基因應(yīng)用于家畜性別控制中。

3 Sox9基因

Sox9基因，即SRY-盒包含蛋白9(sex determining region Y-box 9)基因，是SRY-盒包含蛋白(SRY-type HMG box，sox)基因家族的重要一員，是繼SRY基因之后發(fā)現(xiàn)的又一個(gè)重要的性別決定基因，近些年來，逐漸引起了人們的關(guān)注。研究表明，Sox9基因在哺乳動(dòng)物的生殖調(diào)控中起著重要的作用，參與胚胎性別分化、精子發(fā)生等一系列的的生殖活動(dòng)。

哺乳動(dòng)物性別決定是一個(gè)復(fù)雜而又連續(xù)的生理過程，多種基因和轉(zhuǎn)錄因子參與其中。Sox9基因是Sox基因家族E亞族的一個(gè)重要成員，不僅存在于高等哺乳動(dòng)物，甚至于在低等無脊椎動(dòng)物如水母中也廣泛存在[25]。近些年來，隨著基因研究水平的不斷提高，科學(xué)工作者相繼發(fā)現(xiàn)Sox9基因作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在哺乳動(dòng)物各個(gè)組織中廣泛存在，除性別決定外，還調(diào)控著很多關(guān)鍵的生理、病理過程，如胰腺發(fā)育、軟骨形成、軟骨細(xì)胞分化、神經(jīng)角質(zhì)細(xì)胞發(fā)育、腫瘤等疾病發(fā)生等。

作為一個(gè)潛在的性別決定因子，Sox9基因在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育時(shí)期的性別分化過程中起著重要的作用，如睪丸的發(fā)生、抑制向雌性分化、雄性支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的分化等過程[26]。在哺乳動(dòng)物中，Sox9基因是SRY基因主要的的靶向目標(biāo)，它對(duì)睪丸支持細(xì)胞的分化至關(guān)重要，通常有其他轉(zhuǎn)錄因子一起參與，尤其是Sox8和Dmrt1基因。2006年，Barrionuevo F等研究發(fā)現(xiàn)，在上游基因SRY基因缺失的狀況下，Sox9基因可以誘導(dǎo)雄性小鼠睪丸的發(fā)育[27]。2018年，Nitzan Gonen等人的研究表明，通過對(duì)Sox9基因的一個(gè)末端增強(qiáng)子13做靶向敲除，可以使擁有XY型染色體的雄性小鼠轉(zhuǎn)變?yōu)榇菩?，產(chǎn)生卵巢，同時(shí)沒有睪丸和體腔血管發(fā)育的跡象[28]。除了這些作用之外，Sox9基因在出生后哺乳動(dòng)物睪丸支持細(xì)胞增殖、精子發(fā)生、睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖等哺乳動(dòng)物生殖活動(dòng)中也起著重要的調(diào)控作用。

位于哺乳動(dòng)物Y染色體上SRY基因在性腺的未分化階段開始表達(dá)，在初級(jí)性別決定中可誘導(dǎo)未分化的性腺向睪丸方向分化[29]，但是其表達(dá)非常短暫。而Sox9基因作為SRY基因主要的下游靶基因，被SRY基因激活后可以持續(xù)表達(dá)，通過進(jìn)一步激活相關(guān)信號(hào)通路來調(diào)控雄性性腺的發(fā)育[30]。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，Sox9基因具有很高的保守性。然而，其在染色體上的位置及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)因物種的不同而異。如人類的Sox9基因位于17號(hào)染色體的17q24.3-25.1區(qū)域內(nèi)，長(zhǎng)度為3 934 bp[31]；豬的Sox9基因位于染色體12p13-p11區(qū)域內(nèi)，編碼509個(gè)氨基酸，具有一個(gè)高遷移率族蛋白(high mobilty group，HMG)結(jié)構(gòu)域，可以編碼71個(gè)氨基酸殘基(104-174位)[32]；牛的Sox9基因位于19號(hào)染色體上，含有一個(gè)1 575 bp的開放閱讀框(ORF)，可以編碼524個(gè)氨基酸殘基，編碼蛋白不含跨膜區(qū)和信號(hào)肽[33]。

4 Dmrt1基因

Dmrt1(double-sex and map-3 related transcription factor l)基因是哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物、鳥類、魚類和果蠅體內(nèi)廣泛存在的一類基因，是已知最保守的一個(gè)哺乳動(dòng)物早期性別決定以及性腺分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，是近些年發(fā)現(xiàn)的又一個(gè)雄性胚胎專一性表達(dá)基因。其是SRY基因和Sox9基因之后被發(fā)現(xiàn)的又一個(gè)重要的性別決定相關(guān)基因，是控制睪丸分化的必須基因之一。有研究表明，Dmrt1基因在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中，在雌雄個(gè)體均有表達(dá)，但是隨著胚胎的不斷發(fā)育，其在在雄性性腺中的表達(dá)量逐漸升高，而在卵巢中表達(dá)量卻逐漸降低[34]。Dmrt1基因位于小鼠常染色體的9p末端區(qū)，在小鼠體內(nèi)敲除Dmrt1基因之后，會(huì)導(dǎo)致小鼠性分化的異常。Dmrt1基因與MAB3和DSX具有同源性，有研究發(fā)現(xiàn)Dmrt1、MAB3、DSX基因只在胚胎的生殖嵴上表達(dá)[35-36]。在各種物種體內(nèi)，Dmrt1基因都具有一個(gè)保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Dmrt1基因?qū)τ诓溉閯?dòng)物雄性性腺的形成及其功能的維持具有重要的作用。此外，Zhang等人的研究發(fā)現(xiàn)，Dmrt1基因在哺乳動(dòng)物精原干細(xì)胞的維持過程中也具有重要作用[37]。

5 WT1基因

WT1基因，即威爾氏瘤抑制基因1(Wilms tumor gene 1)。人類的WT1基因位于11p13，小鼠的WT1基因位于17號(hào)染色體上。人類的WT1基因通過可變剪切以及不同的起始翻譯位點(diǎn)，產(chǎn)生24種不同的蛋白異構(gòu)體。WT1基因在人類未分化的生殖嵴以及睪丸分化的性索內(nèi)表達(dá)，在哺乳動(dòng)物早期性腺及睪丸的發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。WT1基因可以產(chǎn)生8種不同的DNA鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，WT1蛋白常常通過識(shí)別目標(biāo)基因上游特異性的DNA序列來調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，WT1蛋白的序列分析表明，羧基端有3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄因子Egr1和Sp1具有高度的同源性，而SRY的GC盒中含有2個(gè)在不同物種間高度保守的Sp1結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)WT1可能通過這2個(gè)位點(diǎn)活化SRY啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄[38]。

有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠WT1蛋白可直接與Dax1啟動(dòng)子TATA盒附近富含GC序列相結(jié)合，從而使之激活。WT1可以抑制細(xì)胞的分裂和分化，在間質(zhì)細(xì)胞形成精巢的過程中有一定作用。在哺乳動(dòng)物的睪丸內(nèi)，WTl基因在足細(xì)胞中表達(dá)；而在卵巢中，WTl基因在顆粒細(xì)胞中表達(dá)，而足細(xì)胞和顆粒細(xì)胞均可以促進(jìn)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞發(fā)育成熟。有研究發(fā)現(xiàn)，WT1基因的突變會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)Denys-Drash綜合征，在46個(gè)XY型染色體個(gè)體中引起了部分和完全的性別反轉(zhuǎn)，表明WT1基因可能參與性別分化早期SRY基因的激活[39]。Parker等人的研究發(fā)現(xiàn)，從泌尿生殖嵴到雙向分化潛能性腺發(fā)育過程中，WT1基因的突變會(huì)影響精巢和卵巢的發(fā)育。2007年，Caignec C等人的研究表明，WT1基因的突變會(huì)導(dǎo)致新生胎兒后腎胚芽的異常增生，從而導(dǎo)致腎臟腫瘤的發(fā)生，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該基因與WAGR綜合癥的發(fā)生密切相關(guān)[40]。2010年，Gao Q等人的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)敲除WT1基因之后，會(huì)導(dǎo)致小鼠性腺的缺乏，從而使得XY型雄性小鼠的生殖器逐漸發(fā)育為雌性特征，同時(shí)腎上腺和脾臟發(fā)育受損，這表明WT1基因在調(diào)節(jié)性腺形成過程中的關(guān)鍵作用[41]。

6 展望

綜上所述，哺乳動(dòng)物的性別決定是由多個(gè)基因、信號(hào)通路所共同參與的一個(gè)復(fù)雜而又精密的時(shí)序性調(diào)控過程。性別決定在動(dòng)物的生命歷程占有很重要的地位，科學(xué)工作者一直在試圖探索其具體的調(diào)控機(jī)制，所取得的成果也不斷的豐富著我們對(duì)新的性別決定系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。

近些年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對(duì)基因功能的研究取得了很大的突破。通過對(duì)一些基因的研究，逐漸發(fā)現(xiàn)了很多與哺乳動(dòng)物性別決定相關(guān)的基因，除了上述提到的性別決定基因之外，還有諸如SF1、Gata4、DAX1、AMH、FGF9、Sox8基因[42]等。性別決定是由多個(gè)基因相互協(xié)作的過程，其中任何一個(gè)性別決定基因的缺失或突變，都將對(duì)動(dòng)物個(gè)體的性別決定產(chǎn)生很大的影響，最終導(dǎo)致性別決定出現(xiàn)障礙。如今，雖然已對(duì)哺乳動(dòng)物的性別決定機(jī)制研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但是目前得到的這些仍然是不系統(tǒng)的、不完整的，這就要求我們要不斷去探索，去發(fā)掘一些潛在的性別決定基因及相關(guān)的信號(hào)通路。相信隨著科學(xué)研究的不斷深入，借助各種新的分子生物學(xué)技術(shù)，在不久的將來，哺乳動(dòng)物的性別決定機(jī)制這個(gè)謎底必將被揭開，從而促進(jìn)哺乳動(dòng)物配子發(fā)生、胚胎發(fā)育、器官形成等研究領(lǐng)域的快速發(fā)展，為畜牧業(yè)生產(chǎn)以及人類疾病的研究帶來新的希望。