MicroRNA在豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染過程中的作用

方滿新，劉 犇，胡 威，潘耀謙

(1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西宜春 336000；2.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)屬于尼多病毒目、動(dòng)脈炎病毒科中的一種單鏈RNA病毒，基因組全長15.4 kb，包含至少11個(gè)開放閱讀框(ORFs)，即ORF1a,ORF1b,ORF2a,ORF2b,ORFs3～7,ORF5a,ORF2TF，其中ORF1a和ORF1b編碼2個(gè)大多聚蛋白pp1a和pp1ab，其經(jīng)過水解為至少16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(Nsps)；ORF2a,ORF2b，ORF3～ORF7 編碼結(jié)構(gòu)蛋白[1]。豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由PRRSV引起的一種免疫抑制性疾病，自20世紀(jì)80年代首次暴發(fā)以來，一直是養(yǎng)豬業(yè)的主要威脅，每年給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

MicroRNA(miRNA)是一類非編碼小分子RNA，長度21 nt～24 nt，在基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程中通過與受其調(diào)控的靶 mRNA的3’非編碼區(qū)(3’UTR)互補(bǔ)結(jié)合，降解靶基因mRNA或抑制mRNA翻譯發(fā)揮作用[2]。關(guān)于miRNA在PRRSV感染及復(fù)制等過程中的功能已有很多研究，miRNA與PRRSV有很緊密的調(diào)控關(guān)系。對這些方面的研究進(jìn)展做一綜述，以期為深入研究miRNA在PRRSV防控中的應(yīng)用提供參考。

收稿日期：2020-06-19

基金項(xiàng)目：宜春學(xué)院博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目(210-3360119046)

作者簡介：方滿新(1982-)，男，河南信陽人，講師，主要從事動(dòng)物病毒感染與非編碼RNA互作研究。*通訊作者

1 miRNA參與PRRSV感染后的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)

miRNA在調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育過程和免疫應(yīng)答中起著重要作用。研究人員對于PRRSV感染后miRNA調(diào)控作用做了大量研究，以了解PRRSV與miRNA之間的相互作用。對PRRSV感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)中miRNA表達(dá)譜研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與調(diào)節(jié)免疫信號通路、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子信號、Toll樣受體信號和鈣代謝[3]。檢測高致病性PRRSV(WUH3)感染Marc-145細(xì)胞時(shí)miRNA和免疫相關(guān)基因的表達(dá)，表明miRNA和免疫相關(guān)基因在PRRSV感染的Marc-145細(xì)胞中的表達(dá)受到調(diào)控并在免疫反應(yīng)中有重要作用，提示miRNA是PRRSV復(fù)制和宿主免疫應(yīng)答重要調(diào)節(jié)因子[4]。說明miRNA的表達(dá)受到PRRSV感染的影響調(diào)控，為揭示miRNA在免疫應(yīng)答和發(fā)病機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。

通過小RNA測序研究PRRSV感染的通城豬和長白豬肺組織miRNA表達(dá)，以鑒定與宿主免疫反應(yīng)有關(guān)的miRNA，在長白豬肺組織中有6個(gè)miRNA在不同時(shí)間點(diǎn)顯著下調(diào)，在通城豬的miR-22-5p的顯著上調(diào)被認(rèn)為參與了PRRSV感染的特異性應(yīng)答。另一方面，為了闡明通城豬相對于大白豬具有更強(qiáng)的抗PRRSV機(jī)制[5]，分別對通城豬與大白豬體內(nèi)感染PRRSV的PAMs中miRNA表達(dá)譜和非編碼RNA(包括miRNA和lincRNA)差異表達(dá)進(jìn)行研究[6-7]，共有182個(gè)已知的miRNA被鑒定，其中23個(gè)上調(diào)差異表達(dá)的miRNA(DE miRNA)以及25個(gè)下調(diào)的DE miRNA，基因本體分析表明，DE miRNA靶基因富集在免疫應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞死亡。在對來自通城豬和大白豬PAM差異表達(dá)非編碼RNA(包括miRNA和lincRNA)鑒定分析中共檢測到250個(gè)已知的成熟miRNA，對于大白豬感染組有44個(gè)下調(diào)和67個(gè)上調(diào)miRNA，而通城豬感染組有12個(gè)下調(diào)和23個(gè)上調(diào)miRNA。在這2個(gè)品種豬的 DE miRNA靶基因在免疫相關(guān)過程中富集，包括凋亡過程、生殖反應(yīng)、T細(xì)胞受體信號通路等。miR-378和miR-10a-5p可以抑制PRRSV復(fù)制，在通城豬對照組中表達(dá)水平高于大白豬對照組，相反miR-145-5p和miR-328在大白豬中特異性下調(diào)并靶向抑制性免疫受體，可能參與了PRRSV引起的免疫抑制，表明這些DE miRNA參與了2個(gè)品種豬免疫抑制和免疫逃逸調(diào)節(jié)。通過這幾項(xiàng)研究PRRSV感染不同品種豬miRNA的差異表達(dá)，為進(jìn)一步揭示宿主與病毒的相互作用提供了重要資料，為深入了解miRNA在PRRSV體內(nèi)感染反應(yīng)中的作用提供了新的思路,有助于開發(fā)新的抗PRRSV方法。

研究表明，PRRSV在感染初期對宿主免疫系統(tǒng)有抑制作用。聚肌胞苷酸(poly I∶C)是一種合成型雙鏈RNA(dsRNA)類似物，在細(xì)胞中激活天然免疫反應(yīng)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。用測序技術(shù)對poly-I∶C刺激和PRRSV感染的PAM進(jìn)行miRNA表達(dá)分析，比較在固有免疫激活和失活狀態(tài)下不同miRNA表達(dá)譜，結(jié)果表明PRRSV感染與poly-I∶C刺激的PAM相比，僅對宿主細(xì)胞miRNA的表達(dá)有輕微改變作用，證實(shí)PRRSV在感染早期可抑制宿主固有免疫應(yīng)答[8]。在差異表達(dá)的miRNA中，ssc-miR-27b-3p能顯著抑制Marc-145細(xì)胞和PAM中PRRSV復(fù)制。此外，PRRSV對豬原代PAMs早期感染過程中IFN-β蛋白有抑制作用，且中國高致病性PRRSV介導(dǎo)的抑制作用更強(qiáng)[9]；let-7b、miR-26a、miR-34a和miR-145能夠通過直接靶向豬IFN-β的3′UTR抑制原代PAM中IFN-β蛋白表達(dá)，在體外早期受PRRSV感染的PAM中表達(dá)上調(diào)，并且HP-PRRSV JXwn06感染PAM的miRNA水平高于低致病性PRRSV HB-1/3.9感染PAM的miRNA水平。表明PRRSV在體外通過上調(diào)PAM中的細(xì)胞miRNA抑制IFN-β表達(dá)。

以上研究揭示了PRRSV與宿主的相互作用，提供了PRRSV感染過程中miRNA表達(dá)變化的宏觀信息，表明PRRSV感染后不但會(huì)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞miRNA的表達(dá)活性改變，同時(shí)功能分析顯示miRNA在PRRSV感染后參與了機(jī)體炎癥和免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)過程，為PRRSV介導(dǎo)的豬先天免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究提供了新的線索，但仍有很多問題亟待研究。如PRRSV感染后參與了機(jī)體炎癥和免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)過程的miRNA，其確切功能及發(fā)揮機(jī)制如何？不同種的豬感染PRRSV后miRNA表達(dá)存在差異，其具體分子調(diào)控機(jī)制如何？如何使之在抗PRRSV中有應(yīng)用價(jià)值?這些問題都有待于進(jìn)一步深入探索。

2 miRNA參與PRRSV復(fù)制和感染的調(diào)控

在病毒和miRNA之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，miRNA在病毒的感染與復(fù)制過程中發(fā)揮了促病毒或抗病毒兩種功能作用，通過總結(jié)分析，可以將參與調(diào)節(jié)PRRSV復(fù)制感染的miRNA根據(jù)其靶點(diǎn)分為3類，即直接靶向PRRSV基因組，靶向影響PRRSV復(fù)制的信號通路，靶向參與PRRSV復(fù)制的宿主因子。

2.1 miRNA促進(jìn)PRRSV感染和復(fù)制

研究表明，miRNA在PRRSV復(fù)制中起促進(jìn)作用，對PRRSV調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)進(jìn)行研究，顯示PRRSV通過調(diào)節(jié)Sp1的表達(dá)上調(diào)miR-373，而miRNA-373通過靶向核因子Ⅰ(NFⅠ A，NFⅠ b)、白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶(IRAK1，IRAK4)和干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF1)來抑制β干擾素(IFN-β)的產(chǎn)生，以促進(jìn)體外PRRSV復(fù)制[10]。Ⅰ型干擾素(IFN)在抗病毒反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，病毒侵入細(xì)胞后，病毒核酸和其他病原體相關(guān)分子模式(PAMP)可被視黃酸誘導(dǎo)基因I(RIG-I)樣受體和Toll樣受體(TLR)等細(xì)胞模式識別受體(PRR)識別；隨后TLR通過結(jié)合髓樣分化因子88(MyD88)或含有銜接蛋白的Toll/IL-1受體結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)IFN-β(TRIF)，而RIG-I或黑色素瘤分化相關(guān)基因5(MDA5)通過結(jié)合其銜接蛋白線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)向TANK結(jié)合激酶1(TBK1)和IκB激酶ε(IKK-ε)傳遞信號；然后，TBK1/IKK-ε激活I(lǐng)RF-3、IRF-7、核因子kappa B(NF-κB)等轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素轉(zhuǎn)錄；最后Ⅰ型干擾素與細(xì)胞表面的IFN-α/β受體結(jié)合，最終誘導(dǎo)產(chǎn)生大量IFN刺激基因，從而抑制或消除病毒。miR-382-5p表達(dá)被PRRSV誘導(dǎo)上調(diào)，并能抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生和促進(jìn)PRRSV復(fù)制[11]，MiRNA-30c靶向干擾素-α/β受體β鏈，促進(jìn)2型PRRSV感染[12]。

2.2 miRNA抑制PRRSV感染和復(fù)制

miRNA可以通過靶向病毒復(fù)制所必需的細(xì)胞基因或直接靶向病毒基因組以多種方式調(diào)控抑制PRRSV感染和復(fù)制。第1個(gè)確定的靶向miRNA的PRRSV基因組是miRNA-181，對PRRSV復(fù)制有極強(qiáng)抑制作用[13]；另一方面，有些miRNA靶向影響PRRSV復(fù)制的信號通路，miR-26a能抑制PAM中1型和2型PRRSV復(fù)制，其抑制效率高于miR-26b，熒光素酶報(bào)告結(jié)果證實(shí)miR-26a并不靶向PRRSV基因組，而是誘導(dǎo)Ⅰ型IFN表達(dá)并在PRRSV感染過程中上調(diào)IFN刺激基因MX1和ISG15[14]。此外，一些miRNA能夠靶向PRRSV復(fù)制中涉及的宿主因子，非肌肌球蛋白重鏈9(MYH9)是PRRSV感染的重要因素，通過生物信息學(xué)預(yù)測和試驗(yàn)驗(yàn)證，MYH9表達(dá)受miRNA let-7f-5p調(diào)控，miRNA let-7f-5p與MYH9 mRNA 的3′UTR結(jié)合，抑制MYH9的表達(dá)從而顯著抑制PRRSV復(fù)制[15]。其他研究有miR-c89及miR-10a-5p分別通過靶向宿主因子豬維甲酸X受體β和信號識別顆粒14抑制PRRSV復(fù)制[16-17]。

這些研究不僅揭示了PRRSV通過miRNA調(diào)控宿主因子作用機(jī)制，顯示miRNA在PRRSV感染中的促進(jìn)或抑制等不同功能作用，而且為預(yù)防控制PRRSV感染開辟了一條新的有效途徑。雖然這方面的多數(shù)研究尚停留在實(shí)驗(yàn)室階段，主要針對體外細(xì)胞進(jìn)行，相信隨著研究工作的深入開展及研究手段的不斷更新，未來miRNA對PRRSV感染與復(fù)制的調(diào)控作用也將研究得更加深入，并進(jìn)一步擴(kuò)展到動(dòng)物模型，對于成功防控PRRS將有幫助。

3 miRNA在PRRSV感染中的其他研究

關(guān)于PRRSV影響miRNA表達(dá)的研究是通過細(xì)胞系和仔豬進(jìn)行，它們對病毒感染的反應(yīng)可能不同于成年公豬，研究PRRSV感染公豬早期精子、精液和血清的miRNA表達(dá)譜，探討在PRRSV感染的早期是否改變了特異性miRNA豐度，對感興趣的miRNA的預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果表明PRRSV感染確實(shí)導(dǎo)致所有組織中miRNA豐度差異，但是精子細(xì)胞中miRNA豐度差異最大[18]；KEGG分析鑒定顯示P2X/P2×7通路在所有3種組織類型中均被鑒定到，表明PRRSV感染可引起miRNA豐度差異，進(jìn)而影響精液質(zhì)量并通過這一通路調(diào)節(jié)生殖能力。另一方面，因?yàn)樗拗鲀?nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)喪失可能意味著基因等表達(dá)譜的潛在變化，通過檢測miRNA和tRNA差異表達(dá)以及它們的生物學(xué)通路探討高致病性PRRSV(HP-PRRSV)感染對宿主體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的影響，結(jié)果表明HP-PRRSV感染通過改變miRNA和tRNA的表達(dá)影響宿主穩(wěn)態(tài)[19]。對豬乳外胞體中總miRNA提取，將提取的外胞體和總miRNA處理感染PRRSV的Marc-145細(xì)胞，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染豬乳外胞體和轉(zhuǎn)染豬乳外胞體總miRNA細(xì)胞中的PRRSV滴度都顯著低于轉(zhuǎn)染PBS陰性對照，說明豬乳外胞體中存在與抑制PRRSV復(fù)制有密切關(guān)系的miRNA，為PRRS的預(yù)防和治療提供新的理論依據(jù)[20]。此外，有研究報(bào)道胎盤細(xì)胞和豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡是妊娠母豬繁殖失敗的明顯標(biāo)志，但其作用機(jī)制尚不清楚。研究分離Sn陽性豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(PEC)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，隨后對模擬和PRRSV感染的PEC的整個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較鑒別，有54個(gè)差異表達(dá)的miRNA，104差異表達(dá)基因(DEG)、22個(gè)差異表達(dá)lncRNA(DE lncRNA)，主要富集在細(xì)胞凋亡、壞死和p53信號通路[21]。通過對差異表達(dá)miRNA和差異表達(dá)基因的整合分析，2個(gè)miRNA(ssc-miR-339-5p和ssc-miR-181d-5p)和5個(gè)基因(SLA-DQB1、THBS1、SLC3A1、ZFP37和LOC100517161)參與了凋亡信號，其中THBS1和SLC3A1主要與p53通路有關(guān)，功能分析顯示miR-339-5p在PRRSV感染后PEC凋亡中起調(diào)節(jié)作用。這些研究進(jìn)一步從不同細(xì)胞及組織，不同角度研究miRNA在PRRSV感染中的表達(dá)及功能作用，有助于拓寬對miRNA在PRRSV感染過程中的功能認(rèn)識，并為闡明PRRSV的病理機(jī)制及研究miRNA在PRRSV感染與防控中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

4 miRNA在抗PRRSV復(fù)制和感染中的應(yīng)用

RNA干擾(RNAi)是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，自從1994年RNAi作為一種天然的抗病毒機(jī)制被發(fā)現(xiàn)以來，它已經(jīng)成為對抗各種病毒感染的可行策略。研究證明治療性miR-181c可以降低感染HP-PRRSV豬的感染嚴(yán)重程度[13]。miR-181-mimics可通過特異性結(jié)合到病毒基因組，在體外強(qiáng)烈抑制PRRSV復(fù)制，尤其是用miR-181模擬物處理的HP-PRRSV株感染豬與陰性對照組相比，血液中病毒載量顯著降低并且緩解了PRRSV引起的發(fā)熱。這些結(jié)果表明宿主miRNAs在調(diào)節(jié)PRRSV感染及在RNA干擾(RNAi)介導(dǎo)的抗病毒治療策略中的重要作用。在PRRSV基因組的5′非翻譯區(qū)(bps 155-162)中發(fā)現(xiàn)了miR-130潛在結(jié)合位點(diǎn)，鼻腔接種miR-130b的仔豬在體內(nèi)表現(xiàn)出抗病毒活性，部分保護(hù)仔豬免受HP-PRRSV株vJX143的致命攻擊，表明miR-130家族在調(diào)節(jié)PRRSV復(fù)制中的重要性，為細(xì)胞miRNA在抗PRRSV感染中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，尤其是動(dòng)物試驗(yàn)的研究為了解宿主與病原體的相互作用以及開發(fā)治療病毒感染的方法開辟了新的途徑[22]。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平上參與基因調(diào)控，并通過與具有高度互補(bǔ)性的靶位點(diǎn)結(jié)合而實(shí)現(xiàn)mRNA沉默。因此將宿主miRNA識別序列克隆到RNA病毒基因組中是控制病毒復(fù)制的合理策略。對PRRSV感染后體外培養(yǎng)的Marc-145細(xì)胞進(jìn)行了深度測序，獲得了小RNA(sRNA)的表達(dá)譜并選擇了6個(gè)不同豐度的候選miRNA(miR-21、miR-140-3p、miR-185、miR-26a、miR-505和miR-199a)進(jìn)行進(jìn)一步研究，通過構(gòu)建PRRSV突變體人工提供了與內(nèi)源性miRNA序列完全互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果表明高豐度miRNA靶向突變體對病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制均具有抑制作用，尤其是含有miR-140靶點(diǎn)的突變體(v140-t)在體外對病毒復(fù)制有較強(qiáng)的抑制作用，這對利用細(xì)胞內(nèi)源miRNA抑制PRRSV復(fù)制的策略進(jìn)行了有益探索[23]。

另一方面，人工miRNA(amiRNA)是利用天然miRNA生成和作用原理，將天然miRNA的成熟序列替換成人工設(shè)計(jì)的靶向其他感興趣基因的反義序列，其以一個(gè)或多個(gè)特定基因?yàn)榘袠?biāo)，通過天然miRNA的生成和作用途徑達(dá)到RNAi的效果，具有高效、作用迅速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，有廣闊的應(yīng)用前景。唾液酸黏附素(Sn)和CD163是 PAM上2種 PRRSV細(xì)胞受體，用miRNA設(shè)計(jì)工具預(yù)測靶向Sn或CD163受體的候選miRNA，并通過轉(zhuǎn)染每個(gè)amiRNA表達(dá)載體和報(bào)告載體的細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明Sn-和CD163靶向的amiRNAs具有抗PRRSV作用。這些研究朝著開發(fā)更有效的抗PRRSV策略邁出了一步，后續(xù)有效的在體研究及體內(nèi)釋放仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，同時(shí)，靶向的準(zhǔn)確性也是使之將來作為一種治療手段所需要克服的問題[24]。

PRRS仍是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的主要疫病之一，隨著研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)miRNA是介導(dǎo)病毒和宿主間博弈的重要工具，也越來越意識到 miRNA在PRRS診斷和防控中的潛在應(yīng)用價(jià)值，開發(fā)和利用以miRNA為靶標(biāo)的生物診斷標(biāo)記物或治療靶標(biāo)，必然在將來PRRS防控中發(fā)揮更大的作用。