MicroRNA在非洲豬瘟研究中的應(yīng)用

張兆博，張思詩，漢可欣，李曉易，文雪霞，漢麗梅,4*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧沈陽 110866; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241; 3.長春師范大學(xué),吉林長春 130031; 4.東北畜禽疫病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧沈陽 110866)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的急性、熱性傳染病，家豬和野豬都為該病的易感對(duì)象。ASFV是一種20面體、有囊膜的雙鏈DNA病毒，不同來源的分離株病毒基因組長度在170 kb～193 kb之間[1]。ASFV約有151個(gè)～167個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORF)，編碼5個(gè)多基因家族，但目前部分ORF編碼蛋白的功能尚未明確[2]。ASFV的傳播方式多樣，其既可以通過易感動(dòng)物之間的直接接觸傳播，也可以通過污染的豬肉、毒蛇、車輛、人及扁虱等途徑間接傳播[3]。作為一種急性動(dòng)物疫病，其強(qiáng)毒株可導(dǎo)致患病豬只出現(xiàn)發(fā)熱、出血及多器官損傷等癥狀，并在短時(shí)間內(nèi)死亡，部分強(qiáng)毒株感染后病死率可達(dá)100%。由于疫苗和特效藥的缺乏使得目前ASF的防控十分困難，因此，每年給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[4]。2018年8月1日，我國遼寧省沈陽市發(fā)現(xiàn)ASF疫情，這是我國本土首次發(fā)生ASF疫情。目前ASF在我國的流行已嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的正常發(fā)展[5]。本文主要對(duì)ASF發(fā)病過程中microRNA的來源、功能及其在ASF防控等領(lǐng)域的研究進(jìn)行綜述，并對(duì)未來microRNA在ASFV致病機(jī)制的研究及其防治進(jìn)行展望，旨在為未來ASF的預(yù)防與疫苗的開發(fā)提供新思路。

1 microRNA概述

microRNA(miRNA)是一種核酸長度為19 nt～23 nt的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA,自1993年首次在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)后，它被廣泛的在真核生物中所發(fā)現(xiàn)。miRNA是非編碼RNA中小非編碼RNA(small non coding RNA,sncRNA)的一種。miRNA由核內(nèi)編碼miRNA的基因轉(zhuǎn)錄后經(jīng)過剪切、折疊形成miRNA前體，并在Dicer酶的作用下，將pre-miRNA加工為成熟的miRNA，成熟的miRNA具有保守性與穩(wěn)定性[6-7]。miRNA不具有編碼的能力，但其可以通過誘導(dǎo)AGO蛋白至3’非編碼區(qū)，使裝載有miRNA的AGO蛋白形成miRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)錄或翻譯起到調(diào)控作用，從而介導(dǎo)基因沉默[8]。miRNA可廣泛的參與各種細(xì)胞過程，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)、胚胎發(fā)育、蛋白質(zhì)編碼和癌癥發(fā)生等過程起到重要的作用。而miRNA本身也受到多種因素的調(diào)控，如特異性轉(zhuǎn)錄因子、基因突變、染色體缺失、表觀遺傳因子等[9]。目前，對(duì)miRNA的發(fā)掘及其功能的鑒定已經(jīng)成為研究病原與宿主互作的熱點(diǎn)方向之一。

2 ASF發(fā)病過程中miRNA的來源及功能

ASF發(fā)病過程中miRNA的來源可分為兩類，一類為來源于豬體內(nèi)的miRNA，它們來源于豬本身，即內(nèi)源性miRNA；而另一類則為來源于ASFV的miRNA，它們是由ASFV中特定的miRNA經(jīng)一系列作用形成的，健康狀態(tài)下的宿主細(xì)胞內(nèi)并不存在該種miRNA，即來源于病毒的外源性miRNA。

2.1 來源于豬體內(nèi)miRNA的功能研究

在體外細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)，ASFV的感染引起miR-10b、miR-486-1、miR-144和miR-199a等miRNA表達(dá)顯著上調(diào)，值得注意的是動(dòng)物在感染ASFV后極短時(shí)間內(nèi)miR-10b就發(fā)生了差異表達(dá)，并在感染6 h后恢復(fù)正常水平。研究表明，在巨噬細(xì)胞中，miR-10b可以通過靶向三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的膽固醇外流[10-11]，而宿主細(xì)胞膽固醇代謝與ASFV感染及其在宿主細(xì)胞中復(fù)制密切相關(guān)[12]，且ASFV可通過內(nèi)吞作用進(jìn)入豬巨噬細(xì)胞，因而推測miR-10b、ABCA1可能在巨噬細(xì)胞內(nèi)吞作用介導(dǎo)的ASFV的早期感染及病毒復(fù)制的過程中起重要作用，但其作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究[10]。

在動(dòng)物體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)miR-451、miR-145-5p、miR-181a及miR-122miRNA在病毒感染后7 d出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，在同期miR-92a、miR-23a、miR-92b-3p、miR-126-5p 、miR-126-3p、miR-30d、miR-23b和miR-92c表達(dá)下調(diào)。應(yīng)用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)上述miRNA進(jìn)行靶標(biāo)及生物學(xué)功能預(yù)測結(jié)果表明，有7種miRNA(miR-23a、miR-30e-5p、miR-92a、miR-122、miR-125b、miR-126-5p和miR-125a)參與免疫反應(yīng)過程[13]，如T細(xì)胞受體信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、自噬調(diào)節(jié)及FcεRI信號(hào)通路(Fc epsilon RI signaling pathway)調(diào)節(jié)等；而ASFV編碼的蛋白如A179L、DP71L、EP153R及p54等在逃逸宿主抗感染免疫、細(xì)胞自噬等一系列免疫過程中起重要的作用[14-15]，推測miRNA可能與ASFV編碼基因的功能發(fā)揮密切相關(guān)。

2.2 來源于ASFV miRNA的功能研究

基于動(dòng)物體內(nèi)的研究結(jié)果，篩選出6個(gè)候選病毒miRNA，通過試驗(yàn)驗(yàn)證與分析表明沒有符合條件的病毒源miRNA，并由此得出ASFV不會(huì)產(chǎn)生miRNA的結(jié)論[16]。將研究范圍擴(kuò)大到sncRNA，對(duì)符合條件的sncRNA進(jìn)行研究與鑒定，發(fā)現(xiàn)存在3種由ASFV所編碼的病毒sncRNA，并將其分別命名為ASFVsRNA1、ASFVsRNA2與ASFVsRNA3。它們均在攻毒后16 h動(dòng)物體內(nèi)被檢測到，而ASFVsRNA2則可以在攻毒后6 h與16 h均被檢測到，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也得到驗(yàn)證[10]。通過對(duì)ASFVsRNA2的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ASFVsRNA2的過表達(dá)可以顯著下調(diào)病毒的復(fù)制，且ASFV可通過3′尿苷化和非尿苷化的互變來調(diào)節(jié)ASFVsRNA2的表達(dá)，以此來調(diào)控病毒自身在感染不同階段復(fù)制的速度。而miRNA的合成、穩(wěn)定性與靶向性也同樣被認(rèn)為受到3′尿苷化的調(diào)控[17]。免疫沉淀結(jié)果顯示，ASFVsRNA2并非通過經(jīng)典miRNA產(chǎn)生途徑所產(chǎn)生，且無法預(yù)測到合理的miRNA前體[18]。上述3種sncRNA是否具有miRNA的作用，以及其生成方式和生物學(xué)功能等，仍有待深入研究與探討。

3 miRNA在ASF防控過程中的作用

3.1 用于疫苗的研發(fā)特定靶點(diǎn)篩選

miRNA在ASF發(fā)病過程中的重要作用，使研究人員擬通過對(duì)它們作用機(jī)制的深入研究，以有利于探索對(duì)ASF的防控途徑及疫苗的研發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)miR-142-3p可在豬巨噬細(xì)胞中大量表達(dá)，通過靶點(diǎn)預(yù)測及試驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)ASF病毒E183L是miR-142-3p的靶基因，即p54基因[19]。其編碼的p54蛋白是ASFV一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，具有高度免疫原性，并在ASFV感染入侵過程中起重要作用，p54蛋白可以與p30蛋白共同參與ASFV與靶細(xì)胞結(jié)合的過程，并在ASFV進(jìn)入宿主細(xì)胞后與宿主的動(dòng)力蛋白相互作用，從而參與成熟病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)[20-21]，此外，p54蛋白與caspase-3的激活和caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程存在密切關(guān)系。因此，p54蛋白可能是針對(duì)ASFV的DNA亞單位疫苗研發(fā)的重要候選抗原蛋白[4,22]。通過對(duì)miR-142-3p的深入研究，可為ASFV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制方式的研究以及疫苗的開發(fā)提供重要的理論依據(jù)。

3.2 ASFV毒力與miRNA的差異表達(dá)

ASFV的不同毒株毒力不同，使用不同毒株攻毒動(dòng)物，其miRNA的表達(dá)情況也存在差異，這些差異表達(dá)的miRNA對(duì)ASFV強(qiáng)毒株致病機(jī)制的研究、ASFV疫苗生產(chǎn)用毒株的選擇及ASF免疫機(jī)制研究等具有重要意義[23]。在應(yīng)用強(qiáng)毒株與其傳代的減毒株的攻毒試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，與用減毒株攻毒的動(dòng)物相比，使用強(qiáng)毒株攻毒的動(dòng)物在感染后出現(xiàn)8種差異表達(dá)的miRNA，其中miR-126-5p、miR-92c、miR-92a、miR-30e-5p和miR-500a-5p呈差異上調(diào)表達(dá)，而miR-125b、miR-451和miR-125a呈差異下調(diào)表達(dá)[9]，這些差異表達(dá)的miRNA可能與ASFV毒株毒力及其致病性相關(guān)，并可能在減毒毒株的制備及免疫原性的提高等與疫苗研發(fā)相關(guān)方面發(fā)揮重要作用，如通過miRNA靶向特異位點(diǎn)的方法已獲得減毒黃病毒毒株[24]。

4 展望

ASF作為近年來在中國新發(fā)并流行的一種重要?jiǎng)游飩魅静。褔?yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的正常發(fā)展，對(duì)ASF的深入研究及相應(yīng)疫苗的研發(fā)迫在眉睫。而近年來病毒與宿主互作機(jī)制研究的熱點(diǎn)之一miRNA等非編碼RNA在ASF發(fā)病機(jī)制的研究過程中均取得重要的研究進(jìn)展，但受限于研究技術(shù)等因素，對(duì)miRNA等非編碼RNA功能了解較少。隨著二代測序技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用，使組學(xué)水平上大量發(fā)掘miRNA成為可能[25]。傳統(tǒng)的細(xì)胞測序技術(shù)是在多細(xì)胞水平上進(jìn)行的，這種方法忽略了細(xì)胞間的異質(zhì)性，而單個(gè)及少部分細(xì)胞在疾病發(fā)生過程中獨(dú)有的細(xì)胞特性往往被忽略，從而影響試驗(yàn)結(jié)果的可靠性[26]。為了解決這一問題，單細(xì)胞測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，通過單細(xì)胞測序技術(shù)，少數(shù)特異性細(xì)胞的差異表達(dá)可以被準(zhǔn)確地檢測與鑒定，從而獲得更加準(zhǔn)確與科學(xué)的結(jié)論[27]。隨著這一技術(shù)的迅速推廣，將會(huì)對(duì)miRNA及其他非編碼RNA在ASFV感染及致病過程中作用以及ASF的發(fā)病機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)，并為ASF的防控與疫苗的開發(fā)提供新思路。