噬菌體在防治畜禽沙門氏菌感染中的應(yīng)用

于 堃，曹中贊，萬 明，盧立志，欒新紅

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)所，浙江杭州 310000)

規(guī)模化養(yǎng)殖在養(yǎng)殖業(yè)中占有越來越重要的地位，較高密度的養(yǎng)殖環(huán)境給疾病的發(fā)生帶來隱患，其中，細菌性疾病是嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展的原因之一?？股氐氖褂每梢暂^好地預(yù)防和治療細菌性疾病，促進養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。另外，抗生素還可以參與調(diào)節(jié)動物腸道菌群，增加動物的抗病能力，提高飼料轉(zhuǎn)化率和降低飼養(yǎng)成本等[1]。但是隨著抗生素的廣泛、不合理、過度的使用，細菌對抗生素也逐漸產(chǎn)生耐藥性。對于臨床嚴(yán)重感染的病例，抗生素已經(jīng)無法發(fā)揮其抗菌抑菌的作用，從而造成養(yǎng)殖業(yè)的嚴(yán)重損失[2]。

噬菌體是一類可以感染細菌的病毒，是病毒中最為普遍、分布最為廣泛的群體。通常情況下，充滿細菌群落的地方，如飼養(yǎng)場、動物胃腸道等都可以找到噬菌體。噬菌體發(fā)現(xiàn)之初，人們就發(fā)現(xiàn)它可以用于抵抗病原微生物，但是隨著抗生素不斷發(fā)展和使用，噬菌體逐漸被忽視。當(dāng)過度使用抗生素的弊端逐漸顯現(xiàn)、超強耐藥細菌不斷出現(xiàn)時，研究者對噬菌體的研究工作又開始逐漸增多。而噬菌體的應(yīng)用不僅僅局限于治療人類疾病，同時發(fā)展到動物疾病的預(yù)防，種畜禽場和水產(chǎn)業(yè)細菌性疾病的凈化，飼料和水源中細菌的清除及食品安全衛(wèi)生等方面[3]。

沙門氏菌是一種革蘭氏陰性胞內(nèi)兼性厭氧菌，常寄居于人類和動物的腸道中，是一種常見的人獸共患病原菌，它不僅能夠引起畜禽的各種疾病，還能夠通過污染的畜禽產(chǎn)品，威脅人類健康?？股仡愃幬锏臑E用，同樣也帶來沙門氏菌耐藥性的逐年增強。因此，尋找安全、高效、經(jīng)濟的新型生物防控劑替代抗生素防治畜禽沙門氏菌感染是當(dāng)今亟待解決的問題。為此，本文就噬菌體的生物學(xué)特性及侵染細菌的機制，以及在防控畜禽沙門氏菌感染中的應(yīng)用情況展開綜述，以期為使用噬菌體防控養(yǎng)殖業(yè)中的細菌性疾病提供理論參考。

1 噬菌體的生物學(xué)特性

噬菌體是大小為20 nm～200 nm的病毒，完全依賴細菌進行復(fù)制和增殖。最早是在研究痘苗病毒的變異株時發(fā)現(xiàn)菌落周圍出現(xiàn)水樣化變化,并定義為乳樣斑，或稱為噬斑[4]。噬菌體的命名和分類是根據(jù)國際病毒分類委員會(ICTV)和下屬的古細菌病毒委員會(BAVS)共同完成[5]。自1959年以來，已有超過5100種噬菌體在電子顯微鏡下被檢測到，大約4950個噬菌體(占96%)屬于有尾噬菌體目，只有186個噬菌體(占3.6%)是立方體、絲狀或多形性的[6]。噬菌體由蛋白質(zhì)和核酸組成。根據(jù)噬菌體的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，可以分為無尾部結(jié)構(gòu)的20面體、有尾部結(jié)構(gòu)的20面體和線狀體。迄今已知的噬菌體大多數(shù)是有尾部結(jié)構(gòu)的20面體。噬菌體的核酸一般只有一種類型，DNA或RNA，大體上細分為ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA。而噬菌體的增殖一般分為5個階段，即吸附、侵入、復(fù)制與生物合成、裝配和釋放。根據(jù)噬菌體的增殖特性可將其分為溶菌性噬菌體和溶源性噬菌體。凡在短時間內(nèi)能連續(xù)完成以上5個階段而實現(xiàn)其增殖的噬菌體，稱為烈性噬菌體，也稱為毒性噬菌體。溶源性噬菌體也稱為溫和性噬菌體，其吸附并侵入細菌后，不進行增殖，也不會引起宿主裂解，如大腸埃希氏菌λ噬菌體等[7]。

2 噬菌體侵染細菌的機制

噬菌體必須寄生在活菌內(nèi)，并有嚴(yán)格的宿主特異性，這種特異性取決于它的吸附器官和宿主菌體表面受體的分子結(jié)構(gòu)和互補性。噬菌體的增殖過程實際就是它侵染細菌的過程，共分5個步驟，主要包括吸附、侵入、復(fù)制與生物合成、裝配和釋放。吸附是指噬菌體的尾絲可逆或不可逆地吸附到宿主菌表面特異性受體上，這是病毒-宿主互相作用的第一步。吸附階段決定了噬菌體-宿主的特異性和控制細菌對病毒感染抗性的機制。因為其特殊的結(jié)構(gòu)，噬菌體不能主動吸附于細菌表面，所以可以適時加大噬菌體的濃度，加速它與細菌的碰撞，提高吸附率。當(dāng)然，還有一些外部的非特異性因素，如溫度30℃～42℃、pH5～7、部分噬菌體適當(dāng)添加金屬陽離子(如Mg2+和Ca2+等)，都會增加其吸附速率。吸附過程又分為可逆和不可逆的兩種結(jié)合方式，吸附階段的分子相互作用機制對于不同的噬菌體-宿主系統(tǒng)具有特異性，在不同分類群中可能也有較大差異。

侵入是指噬菌體將自身核酸成分注入到宿主菌的過程。一般情況下，核酸的滲透發(fā)生在不可逆吸附相之后，這一過程的機制是特定于每個噬菌體或噬菌體組。膜電位、ATP、肽聚糖層的酶分裂或這3個因素可能對細菌細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的滲透至關(guān)重要[8]。以T4噬菌體為例，首先噬菌體的長尾絲可逆地吸附在細菌的表面，當(dāng)3個或3個以上的尾絲吸附到菌體表面的時候，才能將噬菌體的核酸成分導(dǎo)入到菌體內(nèi)[8]。一般噬菌體通過尾絲吸附到宿主菌表面后，噬菌體的基板結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，形成更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。在吸附過程以后，就會產(chǎn)生6條短纖維尾絲，不可逆的吸附到宿主菌表面的庚糖，從而進一步地吸附到菌體表面的核心多糖?；鍢?gòu)象改變的同時，展開的尾鞘收縮，中空的尾管穿透細菌的外膜，將噬菌體的核酸成分注入到菌體內(nèi)部，噬菌體的中空尾管末端會形成溶菌酶和gp5蛋白，提高滲透作用，溶解細菌的細胞壁，使其產(chǎn)生小孔，導(dǎo)致細菌內(nèi)物質(zhì)漏出。但是正常情況下，小孔會很快被細菌修復(fù)[9]。

復(fù)制與生物合成是指注入到宿主菌的核酸會利用細菌的代謝機制來復(fù)制自身遺傳物質(zhì)達到生物合成的目的。以DNA為遺傳物質(zhì)的噬菌體，可以直接轉(zhuǎn)錄成mRNA，引導(dǎo)宿主菌的核糖體進行下一步蛋白質(zhì)片段的合成。而以RNA為遺傳物質(zhì)的噬菌體，首先反轉(zhuǎn)錄成DNA，再按照DNA噬菌體的路徑進行翻譯和蛋白片段合成。

裝配是將噬菌體的各個部件按照一定順序組裝成一個完整的噬菌體的過程[3]。翻譯后期新合成的蛋白片段被組裝起來，形成噬菌體的頭部蛋白質(zhì)亞單位、尾鞘、尾髓、基板和尾絲等部件，然后按照以下5個過程完成裝配：頭部的裝配、尾部的裝配、頭與尾部結(jié)合、長尾絲裝配。釋放是指組裝完成后的子代噬菌體裂解宿主菌的細胞壁釋放出子代噬菌體的過程。這個過程不僅僅是噬菌體的增殖過程，也是裂解細菌的過程。

3 噬菌體在防治豬和牛等動物沙門氏菌病中的應(yīng)用

豬霍亂沙門氏菌病在臨床上極為常見，嚴(yán)重影響斷奶前后仔豬的健康，導(dǎo)致較大經(jīng)濟損失。臨床上一般使用藥物治療仔豬副傷寒，但隨著人們對噬菌體認識地不斷深入，已經(jīng)有采用從糞便和污水中分離出的多種類型的噬菌體來防治養(yǎng)豬場沙門氏菌感染，并取得一定進展。從豬場糞便中分離到能有效裂解鼠傷寒沙門氏菌的烈性噬菌體制成噬菌體雞尾酒，用于治療感染鼠傷寒沙門氏菌的豬，發(fā)現(xiàn)該噬菌體制劑可以有效減少豬直腸中沙門氏菌的分離率，仔豬腸道中菌群減少，以直腸表現(xiàn)最明顯，所以噬菌體在控制豬沙門氏菌上是一個可行的工具，但是進入實際應(yīng)用還有待確定最有效的給藥方案和最有效的噬菌體組合[10]。從107株沙門氏菌中共鑒定出34個血清型，同時分離出13株噬菌體，從中選出4株噬菌體制備4種含有不同噬菌體的噬菌體雞尾酒，給4周齡仔豬口服，1周后給予鼠傷寒沙門氏菌(ATCC 14028)攻毒，采集肛門拭子檢測，發(fā)現(xiàn)提前給予噬菌體的豬開始可以檢測出較多沙門氏菌，之后沙門氏菌數(shù)量開始下降，直至檢測不到，說明噬菌體在仔豬體內(nèi)增殖定居，并開始復(fù)制，可以有效消除沙門氏菌[11]。顯然，沙門氏菌特異性噬菌體雞尾酒可能是控制豬沙門氏菌感染的安全有效的工具。

牛肉作為當(dāng)今人們不可缺少的食物之一，但被沙門氏菌感染的無癥狀牛及其動物產(chǎn)品的運輸和食用會引起很嚴(yán)重的食品安全問題。鼠傷寒沙門氏菌或都柏林沙門氏菌都可以引發(fā)牛沙門氏菌病。犢牛比成牛易感，常常表現(xiàn)體溫升高、停食、腹瀉帶血等癥狀。從肉牛飼養(yǎng)場環(huán)境中分離沙門氏菌和沙門氏菌噬菌體，并進行噬菌譜檢測，發(fā)現(xiàn)從糞便和土壤中分離出噬菌體的概率比從飼料和飲水中多。然而，要更全面地了解這些噬菌體的生物學(xué)特性，并推斷它們的生活方式和可能的生態(tài)作用，需要對來自養(yǎng)殖場環(huán)境的單個噬菌體克隆進行表達，以探索噬菌體通過控制沙門氏菌來增強牛肉等產(chǎn)品安全的潛力[12]。

4 噬菌體在防治家禽沙門氏菌病中的應(yīng)用

雞作為沙門氏菌的主要宿主，一旦感染沙門氏菌，常常引起雛雞大批死亡。成年雞感染沙門氏菌雖然沒有明顯癥狀，但會影響產(chǎn)蛋率和生產(chǎn)性能。同時，隱性感染的個體往往會通過蛋類和禽肉作為媒介，引發(fā)人類食源性沙門氏菌病。美國學(xué)者通過對美國8個州一些家禽死亡原因調(diào)查得出，導(dǎo)致這些家禽死亡的主要病原菌就是沙門氏菌。試驗證明口服接種噬菌體φ2.2可以提高對雛雞感染鼠傷寒沙門氏菌的保護率。從鴨場環(huán)境中分離出4株噬菌體，對24株沙門氏菌都有良好的裂解作用，制成的噬菌體雞尾酒用于生雞胸肉抑菌試驗，表明對腸桿菌的生長具有良好的抑制作用[13]。用不含毒力基因和抗性基因的噬菌體對患有雞白痢的3日齡雛雞進行治療試驗，治愈率達到50%。被多重耐藥菌污染的雞蛋也是危害人類健康和公共衛(wèi)生安全的潛在隱患，因此越發(fā)需要控制多重耐藥沙門氏菌的新方法[14]。從環(huán)境中分離出數(shù)株沙門氏菌噬菌體，從中挑選出一株裂解力最強、噬菌譜最廣的噬菌體D1-2，可以有效抑制蛋黃和蛋白中污染的2株多重耐藥沙門氏菌[15]。以上研究都說明分離出噬菌譜廣、裂解力強的沙門氏菌噬菌體對雞沙門氏菌病都有良好的控制和預(yù)防作用。

鴨沙門氏菌病又叫鴨副傷寒，是由沙門氏菌引起的一種急性敗血性傳染病。該病呈現(xiàn)地方流行性，主要感染3周齡以內(nèi)的雛鴨，其中6日齡～10日齡為感染高峰期，1月齡以上的鴨感染則具有較強的抵抗力，一般不會引起死亡，而成年鴨往往不表現(xiàn)出癥狀；蛋鴨在產(chǎn)蛋過程中，鴨蛋會受到污染，因此造成死胚率升高[16]。同時，沙門氏菌可以通過水平傳播和垂直傳播，種鴨場一旦感染很難被清除，因此種鴨帶菌也是本病暴發(fā)的主要原因之一。歐洲部分國家就曾發(fā)生過鴨蛋中攜帶鼠傷寒沙門氏菌的情況，并給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。從鴨場中分離出1株沙門氏菌噬菌體，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，該噬菌體噬菌譜很廣，可以裂解鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、圣保羅沙門氏菌、阿哥納沙門氏菌、邁阿密沙門氏菌、鴨沙門氏菌、海德爾堡沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌，且沒有毒力基因和抗性基因[17]；選取鼠傷寒沙門氏菌攻毒，進行噬菌體保護試驗顯示，攻毒鼠傷寒沙門氏菌后，再接種噬菌體，噬菌體具有良好的防控鴨源沙門氏菌的效果。從鴨源沙門氏菌、巴氏桿菌和大腸埃希氏菌中分離出1株沙門氏菌噬菌體，體外試驗證明該噬菌體可保持強裂解沙門氏菌能力長達3 h[18]。從鴨場下水道中分離出噬菌體，該噬菌體既可以裂解腸炎沙門氏菌，也可以分解部分腸內(nèi)革蘭氏陰性菌，食用被腸炎沙門氏菌污染的雞可以通過給雞飼喂腸炎沙門氏菌特異性噬菌體作為飼料添加劑來減少疾病的發(fā)生[19]。分離沙門氏菌的噬菌體SLMP1，原核表達獲得重組裂解酶，可以裂解4種沙門氏菌血清型，即鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌和乙型副傷寒沙門氏菌，以及大腸埃希氏菌O157、鮑氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌和單核細胞增生李斯特氏菌等[20]。該裂解酶若是可以在家禽細菌性疾病中應(yīng)用，將會很好地控制臨床上細菌性疾病的發(fā)生。

鵝沙門氏菌病又叫鵝副傷寒，是沙門氏菌引起的一種急性或慢性傳染病。鵝沙門氏菌病可以垂直或水平傳播，且各個年齡段的鵝都易感，其中雛鵝最易感，常表現(xiàn)為死胚或者破殼后不久死亡。成年鵝抵抗力較強，一般沒有臨床癥狀，但會隱性帶菌。從多家鵝場430份病料樣本中分離獲得107株沙門氏菌，感染率或隱性帶菌率極高[21]。從4個鵝場中分離出的鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌，對四環(huán)素類、氨芐青霉素、鏈霉素具有極高的耐藥性，鵝沙門氏菌病一般通過消化道或呼吸道傳播，但也會通過墊料、飲水、食物等傳播，同時還會通過其動物產(chǎn)品傳染給人類，所以控制鵝源沙門氏菌是保護人類健康的關(guān)鍵之一[22]。在鵝源沙門氏菌的報道中，腸炎沙門氏菌占據(jù)了大多數(shù)，但總體來說相關(guān)報道比較少。因此，從鵝場分離出來的沙門氏菌噬菌體如果能夠應(yīng)用到防控鵝沙門氏菌病，將對養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展具有重大意義。

5 噬菌體防控細菌感染的優(yōu)勢和局限性

噬菌體在家禽養(yǎng)殖方面用于防控腸桿菌有諸多優(yōu)點，且不存在耐藥性的問題，因此在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景。首先，噬菌體和細菌廣泛存在于自然界中，與傳統(tǒng)的抗生素相比，噬菌體的研發(fā)時間短、成本低，只需要簡單的從細菌中篩選出來，找到其最佳感染復(fù)數(shù)，再輔以能發(fā)揮最好效果的加工工藝，噬菌體將會是很好的臨床防控細菌性疾病的手段。其次，噬菌體具有專一性，口服攝入到消化道中不會引起菌群失調(diào)，或引起副作用和繼發(fā)感染，同時，相對于抗生素需要多次給藥才能達到治療效果的前提來看，噬菌體可以單次給藥就能得到良好的治療效果[9]。再者，使用噬菌體治療細菌性感染安全性較高，噬菌體主要組成成分就是蛋白質(zhì)外殼和核酸，本身不具有毒副作用，且噬菌體也廣泛存在于自然界，與動物共存，攝入噬菌體也是自然作用，并非是異源體[23]。最后，隨著對噬菌體的研究不斷深入，噬菌體的分離方法、檢測方法不斷被優(yōu)化，噬菌體的生物學(xué)特性及作用機制也越來越清晰，這都為噬菌體進入正式臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

盡管噬菌體在治療細菌性感染方面有很多的優(yōu)勢，但也存在相對的局限性。一是安全性問題。部分溶源性噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)耐藥基因blaCTX-M、mel和tetM在大腸埃希氏菌屬、沙門氏菌屬和志賀氏菌屬間傳播[24]，所以，并不是所有的噬菌體都可以用于治療，且用于治療的噬菌體除了有強裂解能力之外，不能含有毒力基因和抗性基因，安全系數(shù)高，且環(huán)境友好。二是噬菌體的噬菌譜。由于噬菌體有獨特的專一性，所以用于臨床使用的噬菌體必須有較廣的噬菌譜?，F(xiàn)階段大多選擇幾種裂解效果好的噬菌體按比例混合，制成噬菌譜廣的噬菌體雞尾酒用于臨床治療。三是噬菌體給藥方式的局限性。由于噬菌體獨特的結(jié)構(gòu)，所以缺少合適的給藥方式，在治療消化道感染的時候，口服噬菌體制劑會被胃液和腸道中各種消化酶破壞，所以開發(fā)耐消化液和消化酶的噬菌體制劑是亟待解決的關(guān)鍵問題[3]。四是沙門氏菌已經(jīng)通過其毒力因子進化出了抵抗宿主物理屏障和抑制后續(xù)免疫反應(yīng)激活的機制[25]，如產(chǎn)生IL-10和NO的誘導(dǎo)iNOS的表達，來抑制T細胞的表達；且存在于不同血清型沙門氏菌染色體和質(zhì)粒中的23個編碼沙門氏菌毒力相關(guān)基因的區(qū)域SPI通過多種機制，逃避宿主細胞免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，從而可以在體內(nèi)生存和增殖。

6 展望

綜上所述，在養(yǎng)殖實踐中，利用噬菌體來代替抗生素的使用，具有良好的前景，而且一些噬菌體制劑已經(jīng)在美國、加拿大等一些國家進入臨床試用階段，甚至英國已經(jīng)研制出噬菌體DNA疫苗。

但由于有的噬菌體的噬菌譜較窄，加上其獨有的特異性，從而無法達到廣譜殺菌的作用。噬菌體獨特的生物結(jié)構(gòu)成分，如果直接進入體內(nèi)，可能會被消化道直接消化或者引起機體免疫應(yīng)答，導(dǎo)致其無法發(fā)揮作用。因此，在噬菌體的給藥方式、制作工藝上需要做深入研究；再則，噬菌體有其獨特的裂解細菌的機制，所以臨床上確定噬菌體的給藥劑量之前，需要充分試驗來確保其良好的治療效果；還有，宿主菌本身也存在抵御噬菌體的方法，例如能夠合成DNA裂解酶來降解外來噬菌體導(dǎo)入細菌體內(nèi)的基因片段，或剪切噬菌體注入細菌體內(nèi)的病毒DNA，且細菌的CRISPER基因可以保留或記憶曾經(jīng)外來的基因組片段，從而通過RNA干擾的方式來阻斷外來病毒的復(fù)制，這也給噬菌體的應(yīng)用帶來一定的難度。因此，分離獲得噬菌譜廣且較安全的噬菌體、避免噬菌體產(chǎn)生毒力基因和抗性基因、良好的給藥方式、恰當(dāng)?shù)慕o藥劑量等都是以后研究的難點和熱點。相信隨著科技的發(fā)展，噬菌體有望成為一種真正的綠色、健康、高效的生物制劑，應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖行業(yè)防控細菌性疾病，這將對整個人類和動物健康具有重要意義。