細小病毒反向遺傳操作技術(shù)研究進展

趙永強，吳艷虹，韋 韜，叢 麗，岳志剛，肖家美，邵西群

(中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林長春 130112)

反向遺傳學與經(jīng)典遺傳學相對而言，經(jīng)典遺傳學是從生物的表型、性狀的改變出發(fā)，研究其相對的基因特征，反向遺傳學則從生物的基因著手，研究基因的改變對生物表型、性狀的影響。反向遺傳學操作技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于各個領(lǐng)域，尤其是病毒的反向遺傳學操作，狹義的反向遺傳學僅僅是微生物的感染性分子克隆構(gòu)建。病毒反向遺傳學是通過體外構(gòu)建DNA或者RNA病毒的感染性分子克隆，在病毒DNA或者cDNA分子水平上對其進行基因敲除、置換等體外人工操作，也被稱為“病毒拯救”[1]。許多病毒的反向遺傳學系統(tǒng)已建立，成功實現(xiàn)體外病毒拯救。應用體外基因突變、基因插入或者缺失和基因置換來研究生物基因結(jié)構(gòu)和功能都是在反向遺傳學技術(shù)基礎(chǔ)上實現(xiàn)的，目前研究較熱的基因敲除、RNA干擾等等都是反向遺傳技術(shù)的延伸。反向遺傳操作技術(shù)在病毒上的應用，推動了基因缺失疫苗、標記疫苗的研制，構(gòu)建嵌合體病毒、突變病毒等。

1 病毒反向遺傳學研究的發(fā)展

1.1 RNA病毒的反向遺傳操作技術(shù)

RNA病毒反向遺傳操作技術(shù)是以構(gòu)建RNA病毒的感染性分子克隆為基礎(chǔ)的。由于RNA病毒自身遺傳物質(zhì)的不穩(wěn)定，反向遺傳學操作的核酸為DNA，因此，獲得病毒全基因組序列的逆轉(zhuǎn)錄DNA成為該項技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。正鏈RNA病毒的主要研究思路是用RT-PCR技術(shù)，采用“分段克隆”的方式，將病毒基因組各片段按原順序依次克隆到復制嚴謹性較高的克隆載體上，通過載體構(gòu)建將RNA聚合酶的啟動元件插入病毒全長cDNA分子克隆中，同時在構(gòu)建的載體上引入一處或多處沉默突變，便于鑒定拯救的病毒，體外轉(zhuǎn)染易感細胞或侵染宿主，拯救出與親代病毒相似的子代病毒[1]。逆轉(zhuǎn)錄DNA克隆的準確性和完整性是RNA病毒拯救的關(guān)鍵，決定著病毒拯救的效率。對于負鏈RNA病毒，其cDNA轉(zhuǎn)錄的RNA或者裸露的負鏈RNA不具有感染性，必須與依賴性聚合酶、核衣殼蛋白等形成核糖核蛋白復合體(RNP)才可以進行病毒的正常復制與衣殼蛋白的組裝。因此，針對負鏈RNA病毒(如狂犬病毒)，構(gòu)建感染性分子克隆不僅需要構(gòu)建全長的cDNA質(zhì)粒，還需要構(gòu)建RNA復制酶的相關(guān)輔助質(zhì)粒。

1.2 DNA病毒反向遺傳操作技術(shù)

DNA病毒的反向遺傳相對于RNA病毒發(fā)展得更早、更成熟，并且進步也相對更快一些。通常情況下，將病毒全長基因組克隆到載體上，然后轉(zhuǎn)染進入合適的宿主，即可實現(xiàn)病毒的拯救[1]。許多DNA病毒反向遺傳學平臺都已經(jīng)建立，如雙鏈DNA病毒皰疹病毒、腺病毒，以及單鏈DNA病毒圓環(huán)病毒、細小病毒等，而對于有些DNA病毒,由于基因組存在特殊的結(jié)構(gòu)，比如細小病毒末端存在ITR回文序列，其感染性克隆構(gòu)建報道相對較少。

2 細小病毒反向遺傳學技術(shù)概述

2.1 細小病毒基因組結(jié)構(gòu)

細小病毒是線性、單鏈DNA病毒，無囊膜，基因組長約4 kb～6.3 kb，它是等軸對稱DNA病毒中最小病毒之一，分子質(zhì)量約1.5×103～2.0×103ku，G+C含量約為40%～50%，末端存在120 nt～550 nt的回文序列，這些回文序列可以折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，病毒的3′端成Y型或者T型結(jié)構(gòu)，5′端成U型結(jié)構(gòu)，對病毒的復制起著至關(guān)重要的作用。X射線晶體學研究明確了細小病毒顆粒為20面體結(jié)構(gòu)。大部分的細小病毒具有2種～4種病毒殼粒蛋白，而簡短濃核病毒屬(Brevidensovirus)和環(huán)星黑煙濃核病毒屬 (Pefudensovirus)則有5種病毒殼粒蛋白 (VP1-VP5)。細小病毒有左、右兩個開放閱讀框(L-ORF、R-ORF)，其中L-ORF通過可變剪接編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS,R-ORF編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP[2-3]。

細小病毒科又分為細小病毒亞科(Parvovirinae)和濃核病毒亞科(Densovirinae)，細小病毒亞科可感染脊椎動物，廣泛存在于脊椎動物體內(nèi)，可感染貓科、犬科、豬科、?？啤Ⅷ喛?、鼬科等動物，嚴重危害畜牧業(yè)養(yǎng)殖，而濃核病毒亞科可感染節(jié)肢動物。許多細小病毒由于沒有適于體外培養(yǎng)的細胞系，如多種阿留申病毒，難以在體外傳代增殖，所以其生物學特性的研究需要依靠反向遺傳操作技術(shù)輔助完成。

2.2 細小病毒滾動復制機制

細小病毒主要為自主復制型病毒。因為細小病毒在宿主細胞核內(nèi)進行復制，只有當宿主細胞進入S期時，病毒才會利用宿主 DNA 聚合酶和其他細胞成分，隨著細胞增殖而復制。由于細小病毒基因組3′末端自我互補序列可以折疊的緣故，其DNA復制過程不需要環(huán)化或者 RNA 引物，是以其基因組3′末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3′-OH 做為病毒復制的引物、線性化 DNA 親代鏈作為模板，合成基因組的互補鏈，形成復制中間體RF。NS1蛋白在復制早期生成，具有切割酶、解旋酶的活性[4]，切割親代 DNA 鏈，再次暴露子代 DNA 鏈的3′-OH，復制得以繼續(xù)，此時在NS1蛋白的解旋酶作用下，5′末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)生解折疊，再次做為復制模板。最后，親代鏈和子代鏈各自利用各自的回文結(jié)構(gòu)形成末端 ITR。新的子代 DNA 既可包裝衣殼形成病毒粒子，也可作為模板繼續(xù)復制。這是細小病毒滾動復制的全部過程，其滾動式復制的特點：一是病毒基因組3′末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)揮類似引物的功能，開始病毒復制；二是病毒復制中間體 RF 的兩條鏈均可以作為下一輪復制的模板；三是病毒基因組3′和5′末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)會形成“Y”/“T”和“U”型結(jié)構(gòu)，而不同種屬的細小病毒末端基因組序列以及形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)也存在差異[5]。高度變異的肉食動物阿留申病毒屬不同毒種病毒的末端序列也存在差異，獲知存在復雜結(jié)構(gòu)的末端序列不易。

2.3 細小病毒反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建策略

由于細小病毒基因組末端存在穩(wěn)定的回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)，不容易獲取末端序列，導致克隆細小病毒全基因組存在很大困難。

目前，構(gòu)建細小病毒全基因組感染性克隆通常分為三個步驟：首先，采用分段擴增的方法獲得覆蓋全基因組的多個DNA片段；然后，利用體外連接的方法，將各個DNA片段連接起來，克隆到載體上，獲得全長基因組DNA；最后，將獲得的全長DNA轉(zhuǎn)染易感細胞，并對拯救病毒的毒力、感染性以及免疫原性進行驗證。細小病毒亞科不同屬的成熟病毒顆粒優(yōu)先包裝單股正鏈或負鏈DNA，對于細小病毒屬(Parvovirus)，本屬大多數(shù)成員的成熟病毒顆粒中主要為負鏈DNA，如水貂阿留申病毒(AMDV)顆粒中95%為負鏈，鼠細小病毒(MVM)顆粒中99%為負鏈，病毒顆粒中有1%～50%包裝單股正鏈DNA；對于依賴病毒屬(Dependovirus),包裝正鏈DNA和負鏈DNA的成熟病毒顆粒比例相等，如腺相關(guān)病毒AAV、AAV2，紅病毒屬(Erythrovirus)的人細小病毒(B19V)與AAV相同。所以，將目的片段克隆到載體時，應注意目的片段屬于正鏈亦或是負鏈，正鏈DNA和負鏈DNA連接到載體復制原點后的方向應該相反。

2.3.1 分段克隆 反向遺傳操作技術(shù)的關(guān)鍵步驟是獲得病毒全基因組克隆，許多研究者均采用分段克隆的策略，即將包含病毒全基因組的各個DNA片段依次克隆到載體上。同時在基因組合適的位置引入一處或者多處無義突變，便于鑒定和拯救病毒。細小病毒單鏈末端的回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)復雜，很難通過常規(guī)PCR技術(shù)進行擴增，研究者采用多種方法獲得病毒基因組末端序列。水貂阿留申病毒(AMDV)細小病毒全基因組在1990年被第一次測通。隨著PCR、測序技術(shù)和人工合成基因片段技術(shù)的成熟，一部分研究者通過末端變性后分段PCR，將末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列準確測序，并通過人工合成末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列。有研究根據(jù)人博卡病毒(HBoV1)復制過程產(chǎn)生的頭-尾連接的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)頭-尾連接的頭部結(jié)構(gòu)中包含兩段序列，這兩段序列和牛乳頭狀瘤病毒(BPV1)的3′末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)中部分序列相同，于是根據(jù)頭部序列設(shè)計下游引物，根據(jù)BPV1 3′末端序列設(shè)計上游引物，成功擴增出HBoV1 3′末端發(fā)夾序列，接著還發(fā)現(xiàn)頭-尾連接處的尾部結(jié)構(gòu)中也包含一段序列，該段序列被證實和犬博卡病毒(BoV)的5′末端發(fā)夾部分序列相同，因此他們推測HBoV1 5′末端發(fā)夾序列和MVC 5′末端發(fā)夾序列相似，因此針對該序列設(shè)計上下游引物擴增出HBoV1 5′末端發(fā)夾序列，并通過人工合成了末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列[6]。用人工合成法合成并克隆MEV基因組的3′末端(約220 bp)、5′末端(約200 bp)，然后用PCR技術(shù)分段擴增基因組中間序列，并通過重疊PCR進行連接得到中間序列約4 700 bp[7]。在兩末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)處各設(shè)計2對引物，通過優(yōu)化PCR反應條件使末端發(fā)卡結(jié)構(gòu)變性，克服末端復雜結(jié)構(gòu)，并通過分段 PCR成功擴增出CPV末端發(fā)夾序列，再連接 T 載體測序，最后通過人工合成末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列，將細小病毒全基因測序過程簡化，更便于細小病毒感染性克隆的構(gòu)建[8]；采用末端變性[9-10]，優(yōu)化PCR反應條件，成功擴增出AMDV-BJ株末端發(fā)夾序列，與AMDV末端序列同源性高，獲得FPV的末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列。有研究建立一種快速構(gòu)建豬細小病毒(PPV)感染性克隆的方法[11]，采用分段擴增末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列并測序，然后人工合成末端序列連接到載體pBlueScript Ⅱ SK(+)。用人工合成兩末端片段[12]，并組裝到低拷貝質(zhì)粒構(gòu)建pKQLL(F1+F2)，然后設(shè)計2對分別帶有Flag和His標簽的引物來擴增中間區(qū)域序列，獲得帶有標簽的F3和F4中間片段。在發(fā)夾結(jié)合的位置設(shè)計引物，采用PCR分段擴增末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列，對樣品DNA進行變性預處理，使其發(fā)夾結(jié)構(gòu)充分打開并保持單鏈形式，便于與引物結(jié)合，對有效引發(fā)擴增非常重要。另外，利用人工合成的方法，將3′和5′端單鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列合成為dsDNA序列較短片段拼接連接載體更為準確、經(jīng)濟。

在構(gòu)建番鴨細小病毒(MDPV)ZW株全長質(zhì)粒時，將ZW毒株在鴨胚中大量繁殖，并利用差速離心和超速離心法純化病毒，提取單鏈DNA病毒(ssDNA)，然后95℃保持5min再緩慢降溫到55℃退火，以致形成雙鏈型DNA(dsDNA)，最后利用XbaI酶切獲得的dsDNA分別產(chǎn)生兩段包含3′、5′末端ITR序列的亞基因片段[13]。

2.3.2 拼接全長DNA片段 獲得覆蓋細小病毒全長基因組的各個亞克隆以后，即可將其拼接組合成全長病毒基因組DNA的質(zhì)粒。但應值得注意的是，細小病毒末端回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)對其復制過程起著至關(guān)重要的作用，因此在構(gòu)建細小病毒感染性克隆時應獲得完整的末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列，由于很難通過常規(guī)PCR進行擴增，有些研究者通過末端變性PCR方法克隆末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)，也有用人工合成末端發(fā)夾序列，然后通過無縫克隆技術(shù)將細小病毒病末端和中間非編碼區(qū)序列連接起來。在拼接全長DNA片段時載體的選擇也很關(guān)鍵，構(gòu)建單鏈DNA病毒感染性克隆時應選擇穿梭質(zhì)粒作為載體，同時載體的拷貝數(shù)不應太高，在構(gòu)建鵝細小病毒(GPV)全長質(zhì)粒時[14]，最先選用高拷貝的質(zhì)粒作為載體，但含有完整末端ITR全長質(zhì)粒在E.coliSure 感受態(tài)細胞中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，換用低拷貝的載體后則成功轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞。穿梭質(zhì)粒載體具有兩個不同復制起點，可以在原核和真核細胞兩個不同類群宿主中復制和表達，如pBluescript Ⅱ SK(+)載體，其具有pUC和f1(+)兩個復制起始位點，pUC方向允許dsDNA在大腸埃希氏菌感受態(tài)細胞中進行復制，進入動物細胞后則利用f1(+)方向復制起點產(chǎn)生病毒ssDNA，類似病毒基因組進入細胞復制表達。

在拼接AMDV全基因組質(zhì)粒時，選用pGEM3載體作為表達載體，用HindⅢ和EcoRⅠ酶對獲得的含有3′末端片段的載體進行雙酶切，產(chǎn)生兩個粘性末端，同時用這兩種酶對pGEM3載體進行雙酶切，將含有3′末端的片段導入酶切后的pGEM3載體，然后用EcoRⅠ酶將導入3′末端片段的載體線性化，同時用EcoRⅠ酶切含有5′末端雙鏈基因組序列的載體，最后將含有3′末端和5′末端的雙鏈基因組序列進行拼接，并將完整的AMDV雙鏈基因組序列導入pGEM3載體，即獲得AMDV全長質(zhì)粒。隨著無縫克隆技術(shù)逐漸發(fā)展成熟，許多研究者開始采用無縫克隆技術(shù)進行全基因組序列的拼接，在構(gòu)建MEV全基因組質(zhì)粒時，選擇pBluescript Ⅱ SK(+)載體作為表達載體，并將載體中的酶切位點改造為克隆所需的酶切位點，然后采用In-Fusion無縫克隆技術(shù)將人工合成的末端序列和中間非編碼區(qū)序列進行無縫拼接，獲得麻疹病毒(MeV)基因組全長序列，最后將其克隆到經(jīng)過改造之后的pBluescript Ⅱ SK(+)載體上，獲得MeV全長質(zhì)粒[7]。根據(jù)GenBank上公布的CPV Y1毒株序列， 將人工合成的3′和5′端dsDNA序列和PCR分段擴增CPV/BJL1基因組約4 700 bp的中間區(qū)域序列，用重疊PCR技術(shù)將3個片段連接起來，成功獲得CPV全基因組序列[15]。在拼接PPV全長質(zhì)粒時也是用In-fusion無縫克隆技術(shù)[11]，將中間片段(PM)導入質(zhì)粒p(FI)構(gòu)建質(zhì)粒p(FM+FI),最后將FⅡ片段導入質(zhì)粒p(FM+FI)，即獲得了全長質(zhì)粒pPPV?？寺∫恢晁醢⒘羯瓴《局?AMDV-125)全基因組，并將全基因組導入真核表達載體pcDNA3.1,該載體亦為穿梭質(zhì)粒載體，構(gòu)建了全基因核酸疫苗(pcDNA3.1-AMDV)，并在此基礎(chǔ)上又構(gòu)建了基因缺失疫苗，經(jīng)驗證此疫苗免疫水貂能產(chǎn)生AMDV抗體，起到部分保護作用[16]。另外，構(gòu)建感染性克隆還需要選擇合適的感受態(tài)細胞，目前常用的感受態(tài)細胞為E.coliHB101菌株。而在載體構(gòu)建過程中，經(jīng)常會遇到一些基因片段具有高度的重復，這類插入載體質(zhì)粒中的基因由于被細菌的重組酶系統(tǒng)和限制內(nèi)切酶識別作用，產(chǎn)生高頻率插入基因的片段的缺失和重排，使其在細菌中擴增不穩(wěn)定，因此，在質(zhì)粒擴增過程可以嘗試使用重組酶和限制性內(nèi)切酶缺陷的大腸埃希氏菌菌株，如Sure菌株。選擇pBBSmaI載體作為表達載體，pBBSmaI載體是經(jīng)過在pProEX HTb載體中插入一系列酶切位點改造而來，所有的克隆工作是在E.coli感受態(tài)細胞中進行,成功構(gòu)建了HBoV1全基因組質(zhì)粒[6]。將構(gòu)建的番鴨細小病毒FZ91-30全長質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入DH5α和Sure菌株中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性質(zhì)粒能夠在Sure細胞中穩(wěn)定復制，而DH5α中的陽性質(zhì)粒末端ITR發(fā)生了不同程度的缺失。說明Sure菌株是經(jīng)過改造的特殊菌株，適用于有復雜結(jié)構(gòu)的DNA片段的克隆，增強外源DNA的穩(wěn)定性，提高克隆效率[17]。

2.3.3 病毒的拯救 構(gòu)建病毒感染性分子克隆的關(guān)鍵步驟是獲得病毒的全基因組克隆，但獲得的病毒全基因組克隆需轉(zhuǎn)染易感宿主細胞，進而實現(xiàn)病毒的拯救。在過去，構(gòu)建的病毒全基因質(zhì)粒主要通過借助磷酸鈣或者DEAE-葡萄糖的生化方法轉(zhuǎn)染進入培養(yǎng)的真核細胞中，通過磷酸鈣介導的方法，將構(gòu)建的MeV全基因組質(zhì)粒導入CRFK細胞，成功拯救出病毒?，F(xiàn)在，很多研究者采用脂質(zhì)體介導方法轉(zhuǎn)染易感宿主細胞，因為這種方法可以獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，并且脂質(zhì)這種類型的試劑能夠介導所有類型的核酸轉(zhuǎn)染進入各種類型的宿主細胞，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)[6]，將構(gòu)建的HBoV1全長質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入HEK293細胞，成功拯救出病毒；用脂質(zhì)體介導的方法[7]，將構(gòu)建的MeV全基因組質(zhì)粒導入F81細胞，成功拯救病毒；采用脂質(zhì)體介導的方法[15，18]，將構(gòu)建的質(zhì)粒導入F81細胞，分別拯救出AMDV和CPV。有研究嘗試脂質(zhì)體介導和電穿孔等轉(zhuǎn)染細胞方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用細胞核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(AMAXA Cell Line Nucleofector system)轉(zhuǎn)染細胞效果最好，通過此方法將構(gòu)建的B19全基因組質(zhì)粒導入UT7/Epo-S1細胞，拯救出B19病毒。

3 小結(jié)

反向遺傳操作技術(shù)為研究細小病毒生命活動過程中的各種調(diào)控機制，如病毒的復制及致病性分子機理，提供了一個重要工具，特別對體外難以培養(yǎng)增殖的細小病毒的生物特征研究。反向遺傳操作技術(shù)通過體外基因的改造，對毒力基因的刪除，還可以用于新型疫苗株的篩選，同時還可以引入分子標記以研制標記疫苗。還可以通過構(gòu)建嵌合體病毒，進一步研究病毒的復制及致病機制。細小病毒反向遺傳操作的構(gòu)建策略總體分為三步，首先分段克隆覆蓋細小病毒全基因組序列的DNA片段；然后將獲得的各個DNA片段進行拼接，并與選擇的穿梭質(zhì)粒載體進行連接，獲得加載病毒全基因組的質(zhì)粒；最后用構(gòu)建的病毒全基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染病毒易感的細胞，拯救病毒，并驗證病毒感染性克隆是否構(gòu)建成功。總的來說，構(gòu)建細小病毒感染性克隆的關(guān)鍵步驟在于獲取病毒的全基因組，其中難點在于獲得病毒3′和5′末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列，因此,開發(fā)有效克隆末端未知復雜結(jié)構(gòu)序列的方法是順利開展細小病毒全基因組序列感染性克隆構(gòu)建的關(guān)鍵。