豬δ冠狀病毒病原檢測方法研究進展

強桃艷，成溫玉，張 犇，馮 旭

(安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西安康 725000)

腹瀉性疾病嚴重限制養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，復(fù)雜多樣的病原感染是導(dǎo)致豬腹瀉的重要病因之一。由豬δ冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)引起的新發(fā)病毒性腹瀉成為當前豬病防控的又一難題。PDCoV于2012年由Woo等在對中國香港地區(qū)不同動物來源的樣品開展冠狀病毒監(jiān)測時被首次檢測到，直到2014年美國俄亥俄州某豬場發(fā)生了由PDCoV引起的仔豬腹瀉才確認該病毒的致病性[1]。隨后美國其他州的豬場也在腹瀉豬的糞便和小腸中檢測到該病原，很快引起了養(yǎng)豬行業(yè)的關(guān)注。目前該病原已在美國、加拿大、墨西哥、泰國、越南、老撾、韓國、日本、中國臺灣及中國大陸等地檢出且呈現(xiàn)流行趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[2]。豬感染PDCoV主要表現(xiàn)為厭食、嘔吐、嚴重腹瀉和脫水等癥狀，與豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)、豬呼吸道冠狀病毒(Porcine respiratory coronavirus，PRCV)、豬環(huán)曲病毒(Porcine torovirus，PToV)、豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PoRV)、豬庫布病毒(Porcine Kobuvirus，PKV)和豬札幌病毒(Porcine Sapovirus，PSaV)感染引起的臨床癥狀相似，從臨床癥狀和病理變化上很難區(qū)分[3-4]。同時，PDCoV常與其他病原混合感染或繼發(fā)感染，不僅加重了豬群的危害，而且給臨床上準確、及時診斷帶來了困難?；诖?，學(xué)者不斷致力于PDCoV檢測技術(shù)的研究開發(fā)工作，相繼建立了一系列針對PDCoV特異性的檢測方法。為了對比各檢測方法的優(yōu)缺點、靈敏度及特異性，作者歸納總結(jié)了PDCoV的核酸檢測方法，以期為臨床選擇合適的檢測方法提供參考。

1 PDCoV基因組結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性

自中國香港學(xué)者發(fā)現(xiàn)新的冠狀病毒后，國際病毒分類委員會于2011年第9次報告就將冠狀病毒劃分為α、β、γ、δ共4個屬。PDCoV屬于套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒亞科(Coronavirinae)、δ冠狀病毒屬(Deltacoronavirus)。病毒粒子為球形或橢圓形，外膜有棘突狀結(jié)構(gòu)包被，呈典型的冠狀，直徑約為60 nm～180 nm。與其他冠狀病毒科成員相似，PDCoV的基因組為單股正鏈RNA，由9個開放閱讀框(open reading frame，ORF)以5′UTR-ORF1a-ORF1b-S-E-M-NS6-N-NS7(NS7a)-3′UTR為順序組成25.3～25.4 knt的基因組，共編碼15個成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白、4個結(jié)構(gòu)蛋白和3個輔助蛋白。其中ORF1a和ORF1b基因占據(jù)整個基因組的2/3，編碼的2個病毒復(fù)制酶多聚蛋白(pp1a和pp1ab)經(jīng)剪切加工后形成15個成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp2～nsp16)；其余1/3的基因組編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白，即棘突蛋白S(spike)、囊膜蛋白E(envelope)、膜蛋白M(membrane)和核衣殼蛋白N(nucleocapsid)，以及3個輔助蛋白(NS6、NS7和NS7a)[2,5]。值得注意的是，編碼輔助蛋白NS6的基因位于M基因和N基因之間，NS7基因位于N基因內(nèi)，而NS7a基因則又是NS7基因的一部分[5]。

目前，GenBank共收錄了119條完整的PDCoV基因組序列，其主要分離自中國、美國、日本、韓國和越南等國家和地區(qū)。通過遺傳進化分析顯示，這些PDCoV的全基因組表現(xiàn)出較高的序列同源性(91.2%～99.0%)，但在系統(tǒng)進化上呈現(xiàn)明顯的地域特征，聚類形成4大主要支系(lineage)，即美國、日本和韓國毒株為一支系，越南、泰國和老撾毒株為一支系，早期中國分離支系以及中國支系。然而，在美國支系中也包含2株中國分離株，表明中國的PDCoV毒株存在更大的遺傳多樣性[2]。對于冠狀病毒而言，S蛋白決定病毒的宿主范圍和組織嗜性，因此S基因被廣泛用于病毒的進化分析?；趯σ阎獊碜圆煌瑖液偷貐^(qū)PDCoVS基因的對比分析表明，S基因也呈現(xiàn)出較高的序列同源性，且系統(tǒng)發(fā)生樹表現(xiàn)出與全基因一致的結(jié)果。以中國支系中HKU15-44毒株的S蛋白的氨基酸序列為參照，發(fā)現(xiàn)與其他支系上的代表性毒株存在38個位點上氨基酸的替換[6]。同時來自中國不同地區(qū)的毒株在S基因區(qū)域也存在核苷酸的插入或者缺失[2,7]。另外，在不同體外培養(yǎng)代次間，S基因也出現(xiàn)明顯的核苷酸缺失[7]。從鳥類對PDCoV的易感性表明，PDCoV的自然宿主并非是豬，目前病毒仍未完全適應(yīng)豬這一宿主，上述S基因的缺失或插入表明病毒仍在持續(xù)不斷的進化中。

2 PDCoV的臨床特征

豬感染PDCoV主要表現(xiàn)為厭食、精神沉郁、嘔吐、嚴重腹瀉及脫水等臨床癥狀，與PEDV、TGEV和PoRV等病毒感染導(dǎo)致的臨床癥狀極為相似。各生長階段的豬均可感染PDCoV，但以5日齡～21日齡仔豬的腹瀉最嚴重[8]。在感染初期，患病仔豬表現(xiàn)出輕微腹瀉、厭食、低熱和精神沉郁；2 d～6 d后出現(xiàn)持續(xù)性的水樣腹瀉、嘔吐、脫水、厭食、虛弱和被毛粗亂等癥狀，排出的糞便常呈黃色，部分仔豬因嚴重脫水而死亡[1,8]。臨床剖檢可見仔豬小腸脹氣、充滿黃色水樣內(nèi)容物、腸壁稀薄透亮、腹腔和胸腔積水以及偶伴胸腺萎縮等，對于未斷奶仔豬可見小腸和胃內(nèi)存在未消化的凝乳塊[1,8]。盡管PDCoV可感染各年齡段的豬，但對仔豬的發(fā)病率和病死率最高，尤其是哺乳期的仔豬。通常PDCoV對哺乳仔豬的致死率約30%～40%，在個別豬場中PDCoV感染的哺乳仔豬出現(xiàn)超過80%的病死率[8,9]。育肥豬和母豬感染PDCoV后多數(shù)情況下不表現(xiàn)出臨床癥狀或僅出現(xiàn)短暫腹瀉，因此容易被忽視，造成帶毒母豬交叉感染仔豬的現(xiàn)象[10]。PDCoV感染除了引起豬只腹瀉，導(dǎo)致仔豬死亡外，對于豬群的生長發(fā)育也有影響，一些耐過后的仔豬生長遲緩、采食量降低[10]。因此，在生產(chǎn)實踐中PDCoV對豬群的危害不容小覷。

3 PDCoV病原檢測技術(shù)

3.1 病毒分離培養(yǎng)鑒定

病毒分離是實驗室診斷的“金標準”，也是后期分析病原致病機制以及研制疫苗的前提。盡管PDCoV具有廣泛的細胞嗜性，能夠有效感染人源、禽源和豬源的多個細胞系，但只有豬睪丸細胞(ST)和豬腎上皮細胞(LLC-PK)是目前發(fā)現(xiàn)最佳的病毒分離和傳代的細胞模型[11]。在病毒分離過程中，以腹瀉豬的糞便、小腸內(nèi)容物或者組織樣品為材料，需在ST和LLC-PK細胞的培養(yǎng)基中添加10 μg/mL的胰酶、10 mg/mL的胰腺酶或小腸內(nèi)容物才能保證細胞病變(cytopathic effect,CPE)的產(chǎn)生[8]。盡管用LLC-PK細胞分離PDCoV時也可以不添加胰酶，但不利于CPE的形成且病毒滴度也相對較低[8,12]。然而在用ST細胞進行PDCoV分離培養(yǎng)時則需添加胰液素或小腸內(nèi)容物才會促進CPE產(chǎn)生，而且培養(yǎng)相同代次后ST細胞分離培養(yǎng)的PDCoV滴度常低于LLC-PK細胞，表明PDCoV對ST細胞的敏感性低于LLC-PK 細胞[8]。在分離自然感染樣品中的PDCoV時，一般第1代細胞不會出現(xiàn)CPE，盲傳至第3代可出現(xiàn)局部的CPE，細胞先是表現(xiàn)出變大、變圓和聚集，隨后皺縮脫落并出現(xiàn)凋亡性壞死[12]。因此，相對其他病毒的分離而言，PDCoV的分離存在一定難度，例如初期CPE不明顯、自然毒株對細胞系不適應(yīng)、培養(yǎng)基存在抑制病毒與細胞結(jié)合的血清因子以及細胞對胰酶耐受能力差等因素，都會造成分離時丟失病毒或分離失敗。目前國內(nèi)也僅有為數(shù)不多的研究團隊分離到PDCoV細胞適應(yīng)株。

PDCoV的電鏡觀察一般在細胞上連續(xù)傳至數(shù)代后才可進行，必須保證細胞培養(yǎng)物中含有足量的病毒粒子(105個/mL～106個/mL)才能觀察到。在透射電鏡下，病毒粒子呈球形，中心不透明，外圍帶有囊膜結(jié)構(gòu)，呈典型的冠狀結(jié)構(gòu)，病毒粒子大小為60～180 nm[8]。由于PDCoV與大部分冠狀病毒粒子在電鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)十分相似，同時臨床上多見PDCoV與PEDV和/或TGEV混合感染的現(xiàn)象，因此單靠電鏡觀察很難與其他常見的豬冠狀病毒(PEDV和TGEV)進行區(qū)分，需結(jié)合其他方法進行確診。另外，電鏡檢測儀器設(shè)備依賴性強、成本高，而且需要專業(yè)技術(shù)人員操作，不利于PDCoV常規(guī)檢測。

3.2 病原核酸檢測

3.2.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) PDCoV作為RNA病毒，RT-PCR是檢測其最常規(guī)的方法。在發(fā)現(xiàn)PDCoV之前，有學(xué)者為了一次性能夠檢測出人感染冠狀病毒情況，建立了針對所有已知冠狀病毒的泛冠狀病毒RT-PCR(Pan-coronavirus RT-PCR)，后來被推廣到豬冠狀病的發(fā)現(xiàn)和檢測中，并用此方法結(jié)合測序技術(shù)成功從腹瀉仔豬和母豬的糞便中檢測到PDCoV[13]。Pan-coronavirus RT-PCR擴增的靶點是冠狀病毒的聚合酶基因，擴增片段大小為251 bp，因聚合酶基因序列在所有冠狀病毒中高度保守，所以該方法不具備PDCoV的特異性檢測，不適合常規(guī)臨床樣品的檢測。

除上述泛冠狀病毒PCR外，應(yīng)用最普遍的就是分別針對PDCoV的N、M、S基因所建立的特異性RT-PCR。N、M基因在所有已知PDCoV基因組中保守性高，而與其他冠狀病毒(PEDV、TGEV和PRCV)的同源性低，因此適合PDCoV特異性檢測。逄鳳嬌等[14]建立了一種基于PDCoVM基因的RT-PCR檢測方法，其最低檢測限為6.33×104拷貝/μL，而在張帆帆等[15]建立的針對PDCoVN基因的RT-PCR中，最低檢測限達1×103拷貝/μL，表明N和M基因在RT-PCR檢測中其靈敏性存在差異。此外，有研究用N基因建立了套式RT-PCR(nested RT-PCR)，且在臨床樣品檢測時表現(xiàn)出較高的陽性率，但未與RT-PCR進行敏感性對比[16]。S基因是PDCoV基因組中變異性最大的基因，常被用于病毒的遺傳進化分析。由于S基因長度較大(3480/3483 nt)，在進行RT-PCR擴增獲得基因全長時一般需3對引物。在調(diào)查河南省PDCoV的流行情況時，基于S基因建立特異性RT-PCR，對430份腹瀉樣品進行檢測，陽性率達23.49%(101/430)，表明S基因也可用于PDCoV特異性RT-PCR檢測[17]。另外，也有文獻以O(shè)RF1a基因中編碼nsp2蛋白的基因為靶點進行RT-PCR擴增，但其主要目的在于PDCoV的進化分析。因此，除了檢測PDCoV之外，RT-PCR最大的優(yōu)勢在于結(jié)合測序技術(shù)獲得病原的基因序列，目前幾乎所有已知的基因序列都是通過RT-PCR擴增結(jié)合測序獲得的。

鑒于PDCoV感染引起的臨床癥狀與其他多種病毒導(dǎo)致的癥狀很相似，同時臨床上多見PDCoV與其他病原混合感染的病例，因此研究者紛紛建立了針對PDCoV及其他病毒的雙重及多重RT-PCR。對PDCoVN基因和PEDVM基因各設(shè)計一對特異性引物，建立了二重RT-PCR，在退火溫度56℃下最低能夠檢測100 pg/μL濃度的PDCoV-PEDV混合核酸，且可用于臨床樣本的檢測[18]。有研究建立了N基因的多重RT-PCR同時檢測臨床腹瀉樣本中的PDCoV和TGEV，該方法與單一檢測PDCoV/TGEV的RT-PCR結(jié)果一致，且對PDCoV的檢測下限可達3.14×102拷貝/μL，高于文獻[14-15]建立的單一RT-PCR檢測方法的敏感性[19]。在此基礎(chǔ)上，用3對引物建立同時檢測PDCoV、TGEV和PEDV的三重RT-PCR方法，通過對引物用量和退火溫度的優(yōu)化可以實現(xiàn)臨床樣本的高效檢測，且與單一RT-PCR方法的符合率達100%，大大提高了對多種導(dǎo)致豬腹瀉病原的檢測效率[20]。此外，在二重RT-PCR的基礎(chǔ)上逐步建立了同時檢測6種致豬腹瀉病毒的多重RT-PCR并成功用于臨床檢測，發(fā)現(xiàn)我國豬場2種和3種腸道病毒(PDCoV+ PEDV+PKV)共感染現(xiàn)象較為普遍[3]。相較于單一RT-PCR，二重及多重RT-PCR能同時檢測2種以上的病原，具有簡便且省時的優(yōu)勢，但在引物設(shè)計以及反應(yīng)體系的優(yōu)化方面較為復(fù)雜。盡管RT-PCR操作相對簡單、適用樣本類型廣泛，但敏感性不高且存在一定的假陰性。因此，需要更敏感、更快速高效的方法進行取代。

3.2.2 熒光定量RT-PCR(RT-qPCR) RT-qPCR技術(shù)是從樣品中分離病毒RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR將樣本中微量的病毒基因成倍放大，最后以熒光信號的強弱對RNA進行定性和定量檢測。常用的有基于熒光染料(如SYBR GreenⅠ)和探針染料(如TaqMan)2種RT-qPCR。與RT-PCR方法相比，RT-qPCR具有靈敏性高、特異性強及樣本檢測量大等優(yōu)勢。在PDCoV的檢測應(yīng)用中，以PDCoVM基因建立了SYBR GreenⅠ RT-qPCR，檢測下限低至54拷貝/μL，且與其他常見豬病毒性病原無交叉反應(yīng)[21]。以M基因建立的TaqMan探針qPCR則可檢測低至10拷貝/μL的質(zhì)粒模板，反映出探針qPCR比染料qPCR更靈敏[22]。以N基因建立的熒光RT-qPCR(6.3拷貝/μL)和TaqMan探針qPCR(2.2拷貝/μL)也體現(xiàn)出探針qPCR具有更高的靈敏度[23-24]。對比了基于N基因建立的RT-PCR和SYBR Green RT-qPCR發(fā)現(xiàn)，盡管二者最低均能檢測20拷貝/μL的標準質(zhì)粒，但在臨床應(yīng)用上RT-qPCR的靈敏性顯著優(yōu)于RT-PCR[25]。從擴增靶點上對比發(fā)現(xiàn)，針對N基因的qPCR要比M基因更敏感，這與RT-PCR的結(jié)果一致。

除了上述針對PDCoV的單一RT-qPCR外，多個研究團隊還建立了針對PDCoV在內(nèi)的雙重及多重RT-qPCR，可滿足2種及以上病原的同時檢測。能同時檢測PDCoV和PEDV的SYBR GreenⅠ雙重熒光RT-qPCR，其檢測下限分別為22.6拷貝/μL和99.6拷貝/μL，在臨床樣品的檢測中與單重RT-qPCR的檢出率一致，且能夠高效地檢測2種病毒混合感染的樣品[26]。針對PDCoV和PEDV建立的SYBR GreenⅠ雙重熒光RT-qPCR，其在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出比普通RT-PCR更高的靈敏性[27]。建立的同時檢測TGEV、PEDV和PRoV的三重TaqMan探針RT-qPCR，比普通RT-PCR表現(xiàn)出更高的檢出率，可實現(xiàn)臨床上2～4種病原混合感染的檢測[28]。用PDCoVORF1b基因建立的同時檢測PEDV、PDCoV、PToV和SADS-CoV的四重TaqMan探針RT-qPCR，同樣可應(yīng)用到臨床樣品的檢測[4]。由此可見，雙重及多重RT-qPCR在診斷臨床混合感染樣品及監(jiān)測引起豬腹瀉的常見病原中具有較大的優(yōu)勢，但在引物設(shè)計、探針合成方面較為嚴苛。

3.2.3 等溫擴增技術(shù) 盡管上述經(jīng)典的PCR方法具有靈敏度高、特異性強、檢測速度快和樣本適應(yīng)性廣等優(yōu)點，但反應(yīng)過程都需要經(jīng)歷變性、退火和延伸3個步驟的多次循環(huán)，對PCR設(shè)備的精密度要求高，而且整個反應(yīng)需要數(shù)小時，不適用于現(xiàn)場快速檢測的要求，因此等溫擴增技術(shù)便應(yīng)用而生。常見的等溫擴增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、重組酶聚合酶擴增技術(shù)(recombinase polymerase amplification，RPA)、滾環(huán)擴增技術(shù)(rolling circle amplification，RCA)、依賴解旋酶等溫擴增技術(shù)(helicase-dependent amplification，HDA)和單引物等溫擴增技術(shù)(single primer isothermal amplification，SPIA)等。目前針對PDCoV檢測所建立的等溫擴增技術(shù)主要有LAMP和RPA。

LAMP技術(shù)針對模板上靶基因的6個不同區(qū)域位置，設(shè)計4條～6條自發(fā)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的引物，利用鏈置換DNA聚合酶Bst在恒溫(60℃～65℃)條件下30 min～60 min合成無限拓展的之字形的長鏈DNA，反應(yīng)過程中產(chǎn)生的大量焦磷酸離子與鎂離子形成了難溶于水的焦磷酸鎂沉淀，可實現(xiàn)肉眼判別檢測結(jié)果。以PDCoVN基因設(shè)計4條特異性引物并建立的RT-LAMP方法，在63℃下70 min即可得到最佳反應(yīng)結(jié)果[15]。同時其靈敏度可達10拷貝，是普通RT-PCR靈敏性的100倍，并在臨床樣本的檢測中表現(xiàn)出更高的靈敏度。此外，他們在反應(yīng)產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ熒光染料，在紫外線照射下即可判定結(jié)果。用N基因建立的RT-LAMP方法，其在反應(yīng)體系中加入羥基萘酚藍，使反應(yīng)產(chǎn)物呈天藍色，而陰性對照為紫色，無需進行凝膠電泳檢測，提高了檢測效率，在實際樣本檢測中具有更高的靈敏性[27]。因此，基于RT-LAMP技術(shù)的檢測方法具有靈敏度高、擴增速度快以及無需變溫等優(yōu)勢，但也存在引物設(shè)計復(fù)雜、產(chǎn)物不均一以及容易出現(xiàn)假陽性等弊端。近年來，隨著病原檢測要求的不斷提升以及即時檢測(point-of-care testing，POCT)的需求，LAMP與TaqMan探針、微控流技術(shù)相結(jié)合，同時研發(fā)便攜式LAMP檢測儀，使得基于LAMP病原檢測技術(shù)具有更廣闊的應(yīng)用前景。

RPA是一種依賴于重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶在常溫條件下5 min～20 min即可完成的等溫擴增技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于各類病原微生物的檢測中。在PDCoV的檢測中，建立的針對N基因的RPA方法檢測下限為102拷貝/μL，在38℃下15 min即可完成檢測，且比RT-PCR在臨床樣本的檢測中具有更高的靈敏度[29]。建立的N基因重組酶聚合酶擴增結(jié)合側(cè)流層析試紙條(LFD-RPA)的檢測方法，檢測下限為102拷貝/μL，可在20 min內(nèi)完成樣品檢測，不僅大大縮短了檢測的時間，而且結(jié)合側(cè)流層析試紙條完全實現(xiàn)了肉眼檢測[30]。因此，基于RPA反應(yīng)操作簡單、結(jié)果可視化以及靈敏度高等優(yōu)勢，該法將成為未來動物病原檢測可視化的重要技術(shù)手段。同時RPA反應(yīng)所需的試劑已經(jīng)商品化，結(jié)合一些公司開發(fā)的便攜式檢測儀器，完全可以滿足現(xiàn)場可視化快速檢測的需求。

3.2.4 其他病原核酸檢測技術(shù) 近年來，隨著納米技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的不斷滲透，納米顆粒輔助聚合酶鏈反應(yīng)(nanoPCR)為病原檢測提供了新手段，對疾病的防控起到積極的作用。nanoPCR主要利用納米顆粒導(dǎo)熱快，易與DNA分子、DNA聚合酶進行結(jié)合特點，能夠顯著提高PCR反應(yīng)的效率和靈敏度。以PDCoVM基因建立的特異性的nanoPCR，該方法比常規(guī)RT-PCR的靈敏性更高，可用于臨床樣本的檢測。盡管nanoPCR具有特異性強、敏感性高等優(yōu)點，但其必須在實驗室進行，對設(shè)備要求高且其作用機制尚未完全清楚，尚處于實驗室研究階段。

基因芯片技術(shù)是基于堿基互補配對與寡核苷酸探針相結(jié)合的一項快速、特異、靈敏及高通量的自動化基因檢測技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于藥物開發(fā)、疾病診斷、基因突變、基因表達等方面?，F(xiàn)今基因芯片已經(jīng)從傳統(tǒng)的熒光探針掃描芯片發(fā)展到可視化基因芯片技術(shù)，推動了基因芯片技術(shù)在病原檢測方面的應(yīng)用。鑒于當前豬病復(fù)雜多樣，多存在混合感染的現(xiàn)象，用C3y熒光標記建立同時檢測PDCoV、PEDV、TGEV和PRoV等4種腹瀉病毒的基因芯片[31]，針對PDCoV分別設(shè)計基于M和N基因引物，大大提高了檢測的特異性和敏感性，同時該芯片可在4℃下保存60 d，完全可以滿足高通量樣本檢測的需求。

4 展望

與PEDV相比，盡管PDCoV對仔豬及母豬的致病性相對較輕，然而臨床樣本中多見其與其他病原混合感染或繼發(fā)感染，加之該病毒在臨床感染所引起的癥狀與其他多種病原十分相似，使得該病的診斷和防控難度增大?？焖佟⒏咝?、靈敏的PDCoV檢測技術(shù)，能夠及時發(fā)現(xiàn)病毒并對豬群進行早期預(yù)防，同時為疫情提供準確的流行病學(xué)信息?；谂R床需求，目前已經(jīng)建立了多種PDCoV檢測方法，然而每一種方法各有優(yōu)缺點，單一的技術(shù)不能解決臨床樣本檢測中的所有問題。病毒分離技術(shù)耗時費力，不便于快速檢測，僅適合實驗室病原學(xué)的研究；PCR技術(shù)設(shè)備依賴性強，需要專業(yè)人員操作且具有一定的檢測下限，同時操作過程中易交叉污染，存在假陽性或假陰性的結(jié)果；等溫擴增技術(shù)的引物設(shè)計復(fù)雜，樣本容易交叉污染且結(jié)果判斷不夠客觀；基因芯片技術(shù)的成本高且耗時相對較長，對于臨床樣本的檢測實用性不強。一些免疫學(xué)的手段雖能檢測病毒的抗體或者抗原，但不適合早期診斷，且多數(shù)限于實驗室操作。目前對于PDCoV的檢測多采用RT-PCR和RT-qPCR技術(shù)，無法實現(xiàn)即時性檢測(POCT)。因此，未來開發(fā)新型的PDCoV檢測技術(shù)應(yīng)以快速、靈敏、高效的POCT為主。等溫擴增技術(shù)與可視化技術(shù)相結(jié)合被認為是實現(xiàn)POCT的曙光，從電化學(xué)、試紙條、化學(xué)發(fā)光、數(shù)字化以及納米技術(shù)等方向出發(fā)，能夠解決等溫擴增中的技術(shù)難點，開發(fā)出具有快速確診、低成本、高敏感性和非專業(yè)人員操作的檢測技術(shù)。同時在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過不同技術(shù)和學(xué)科之間交叉融合推動新型技術(shù)的研發(fā)，才能滿足養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的需求，并為豬腹瀉性疾病防控提供技術(shù)支撐。