萬古霉素耐藥腸球菌研究進展

軒慧勇，陳萬昭，夏利寧

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

自20世紀80年代首次報道耐萬古霉素腸球菌(vancomycin-resistantEnterococcus，VRE)以來，腸球菌從“普遍認為安全”的細菌發(fā)展為重要的病原體，并且由于VRE能夠在物體表面長期存在，其傳播越來越難控制[1]。VRE引起的感染常見于各種癌癥、泌尿系統(tǒng)疾病和腦梗死等重癥患者，VRE的感染常與高死亡率相關(guān)，引起的感染主要為腹腔感染和肺部感染，其次為泌尿道感染、皮膚感染和血液感染，嚴重時可導(dǎo)致膿毒血癥，在美國醫(yī)院內(nèi)感染率高達20%～30%[2]。中國VRE感染的病原體中74%為屎腸球菌，而VRE引起血液感染的病原體中20%為糞腸球菌[3]。在巴基斯坦住院的癌癥患者中進行的一項研究表明，VRE菌血癥患者12周的死亡率為63%[1]。

VRE可在健康人和動物的胃腸道中存在，并在合適的條件下進行定植和傳播。定植的重要因素之一是臨床使用抗厭氧菌藥物(包括萬古霉素)進行治療，而這些抗菌藥物的使用會去除機體的定植抗性，為VRE入侵提供條件，進而在胃腸道中建立耐萬古霉素腸球菌種群[4]。有關(guān)VRE致病性的因素尚未完全確定，但諸如腸球菌表面蛋白、聚集物質(zhì)、明膠酶和膠原黏附素分子Acm等因素與VRE在不同組織的定植能力有關(guān)[5]。經(jīng)抗菌藥物治療后，VRE可以在小鼠的胃腸道中定殖，并在使用免疫抑制劑后可以在小鼠模型中傳播[6]。VRE的天然耐藥和通過質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子獲得的耐藥使臨床治療變得困難，需要新型抗菌藥物，細菌素是一種新的治療選擇，既可以作為單獨治療方法，也可以與現(xiàn)有的抗菌藥物協(xié)同作用。

1 VRE的起源

糖肽類抗菌藥物萬古霉素于1955年被分離出，主要用于對青霉素和頭孢菌素類藥物治療無效的細菌性感染[7]。隨著萬古霉素在臨床使用頻率和劑量的增加，1987年VRE在英國倫敦被首次分離出來，隨后在美國的紐約，愛爾蘭、加拿大、日本、比利時和德國等國家，以及包括我國在內(nèi)都有檢出的報道[7]。VRE的出現(xiàn)主要歸因于以下兩方面：20世紀80年代，歐洲地區(qū)長期應(yīng)用阿伏帕星來促進動物生長以及預(yù)防疾病；腸球菌在萬古霉素治療中，自身結(jié)構(gòu)改變，消除了與萬古霉素的結(jié)合靶位。

1.1 VRE的產(chǎn)生原因

通常認為醫(yī)院內(nèi)感染VRE的危險因素包括住院時間的延長、患者年齡較小、暴露在ICU(重癥監(jiān)護病房)和濫用抗菌藥物(如頭孢曲松和萬古霉素等抗厭氧菌的抗菌藥物)[8]。此外，醫(yī)院工作人員也可以傳播VRE，因為即使洗手后，VRE也可以在手指上存活約30 min[8]。

VRE在食品動物生產(chǎn)中的出現(xiàn)在很大程度上歸因于20世紀90年代中期在歐洲和其他國家/地區(qū)廣泛使用亞治療量阿伏帕星促進動物生長，使畜牧業(yè)成為VRE菌株的重要來源之一。相反，加拿大和美國等其他國家直到2008年從未批準使用阿伏帕星，也未在動物中報道過VRE，故美國VRE的出現(xiàn)主要歸因于臨床環(huán)境[9]。由于VRE很容易在含有阿伏帕星作為食品添加劑的動物腸道內(nèi)定植，最終在人類腸道內(nèi)定植，因此各國農(nóng)業(yè)委員會禁止阿伏帕星用于食品動物中，這些國家和地區(qū)包括1995年的丹麥和挪威，1996年的德國，1997年的歐洲和韓國等，2000年的中國臺灣和新西蘭[9]。但歐洲的最新數(shù)據(jù)顯示，腸球菌一旦產(chǎn)生耐藥后，其耐藥性并不會隨著禁用時間的延長而消失。據(jù)報道，在阿伏帕星被禁10年后，在4%的食品動物源樣本中檢出VRE；在阿伏帕星被禁用15年后，丹麥仍從家禽中檢測到VRE耐藥基因型，并且在47%的糞便樣本中發(fā)現(xiàn)可變抗性表型和多種糞腸球菌克隆株。并且，意大利和德國也在禽肉和豬肉產(chǎn)品以及健康人的糞便樣本中檢出VRE[10]。VRE的持續(xù)存在，一方面歸因于萬古霉素耐藥基因VanA和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB存在于同一個結(jié)合質(zhì)粒上，這兩個基因通過共轉(zhuǎn)染使細菌保持耐藥性，而質(zhì)粒編碼基因是質(zhì)粒生存所必需的自然選擇結(jié)果。另一方面歸因于VRE能夠在體外環(huán)境中長期存活。

此外，伴侶動物也可成為VRE的貯存者[10]。在歐洲禁用阿伏帕星之前，有報道稱狗的VRE攜帶率很高，在隨后的研究中，荷蘭在阿伏帕星禁令執(zhí)行5年后，發(fā)現(xiàn)VRE可以在健康的狗和貓體內(nèi)定殖，并且，從狗身上分離到的VRE分離株與醫(yī)院人獲得性感染VRE菌株親緣關(guān)系相近。而在意大利，波蘭和匈牙利的健康馬匹中也分離出攜帶vanA基因型的VRE菌株。

1.2 VRE定植和傳播的主要因素

目前主要通過小鼠模型研究VRE在體內(nèi)定植前和期間發(fā)生的過程以及在體內(nèi)的傳播，該模型的研究大大增加了人們對VRE與腸道菌群相互作用和抗菌藥物給藥效果的了解。

定植在VRE感染過程中至關(guān)重要，多項研究表明，抗菌藥物的使用對微生物群的組成以及VRE的定殖能力具有深遠的影響。小鼠模型研究顯示[4]，抗厭氧菌抗菌藥物(哌拉西林/他唑巴坦和頭孢西丁等)可促進VRE定植，在同一模型中，抗厭氧菌活性較小的抗菌藥物如頭孢吡肟和氨曲南則不促進VRE的定植。此外，甲硝唑、新霉素、卡那霉素和萬古霉素的聯(lián)合用藥也增加VRE的定植。值得注意的是，哌拉西林/他唑巴坦是一種具有較強抗厭氧作用的抗腸球菌藥物，在哌拉西林/他唑巴坦治療期間，VRE定植被阻止，但在哌拉西林/他唑巴坦停止治療后，VRE可定植，這表明哌拉西林/他唑巴坦能夠在一定程度上防止VRE的定植。一般來說，胃腸道微生物菌群的豐度和多樣性會在抗菌藥物治療過程中降低，雖然當(dāng)停止抗菌藥物治療后，腸道微生物菌群的豐度會增加，但成分有改變。具體來說，抗菌藥物治療后乳桿菌科和擬桿菌門的豐度明顯減少，腸道微生物由大量梭菌和腸球菌組成[6]。減少乳桿菌科和擬桿菌門的抗菌藥物包括甲硝唑、新霉素、卡那霉素、氨芐西林和萬古霉素等，這幾種抗菌藥物治療對乳桿菌科和擬桿菌門的影響較大，給病人服用這些藥物會增加腸道中腸球菌的數(shù)量，從而增加VRE感染和傳播的可能性。在沒有抗菌藥物治療的情況下使用免疫抑制劑不會影響腸道菌群，因此免疫受損患者VRE易感性增加是由于抗菌藥物的使用。

一些對VRE在腸道內(nèi)定殖后的傳播研究結(jié)果顯示，傳播是VRE引起全身感染所必需的過程[6]。研究表明，給小鼠使用由新霉素、甲硝唑和萬古霉素組成的廣譜抗菌藥物配方，然后灌胃VRE可以誘導(dǎo)VRE在胃腸道中定植并擴散到其他組織。而另一項研究則對VRE是否可擴散到肝臟和脾臟等組織進行研究，在這項研究中，除灌服配方抗菌藥物外，還給小鼠灌服環(huán)磷酰胺，在改變微生物菌群同時還可使小鼠免疫受損。研究結(jié)果表明VRE可以傳播到肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)和血液，尚不清楚是否由于免疫受損導(dǎo)致VRE傳播到組織中。但人體回顧性研究結(jié)果顯示，個體免疫功能低下才發(fā)生VRE傳播，一項研究發(fā)現(xiàn)，在216例VRE定植的人類患者中，只有3例發(fā)生血液感染，而發(fā)生血液感染的患者均受到免疫損害。因此，免疫抑制可能是VRE在人類和實驗動物中傳播的必要條件[11]。

2 VRE耐藥機制

2.1 腸球菌對糖肽類藥物的耐藥機制

糖肽類窄譜抗生素萬古霉素是從土壤中東方擬無枝酸菌中分離出來。該抗菌藥物主要通過以下3種方式對細菌殺滅：①抑制細胞壁糖肽的合成；②抑制RNA的生物合成；③改變細菌細胞膜的滲透性，臨床主要用于因長期服用廣譜抗生素所致難辨梭狀桿菌引起的偽膜性結(jié)腸炎或葡萄球菌性腸炎的治療。自VRE首次被報道后，VRE的檢出率逐漸上升，隨著時間的推移VRE有明顯的種間差異，大多數(shù)萬古霉素耐藥株是屎腸球菌[12]。

VRE一般是由于菌株攜帶5個～7個基因構(gòu)成的基因簇介導(dǎo)對萬古霉素耐藥，目前，萬古霉素耐藥基因型被分為vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanF、vanG、vanL和vanM這9種[13]。VanA、VanB、VanD型可產(chǎn)生一組連接酶，該酶導(dǎo)致合成D-丙氨酰-D-乳酸取代正常的細胞壁肽聚糖末端的D-丙氨酰-D-丙氨酸，使萬古霉素不能與其靶位結(jié)合，造成細菌對萬古霉素高水平耐藥[13]。VanCl、VanE、vanG和vanL基因則導(dǎo)致合成D-丙氨酰-D-絲氨酸取代正常細胞壁的結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)對萬古霉素的低水平耐藥。其中vanF基因僅在類芽孢桿菌中檢出，vanA基因僅在耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌中檢出。不同的基因型結(jié)構(gòu)大致相仿，但基因編碼蛋白的氨基酸序列有差異，且基因簇中的基因組成及排序不同，因此同源性在60%～80%之間。常見的耐藥表型主要有vanA、vanB和vanC等3種。

2.2 VRE多藥耐藥的出現(xiàn)

腸球菌對萬古霉素耐藥以及對新型抗菌藥物產(chǎn)生多藥耐藥引起全球關(guān)注，多藥耐藥的出現(xiàn)與人類醫(yī)學(xué)中疾病的發(fā)病率和死亡率高度相關(guān)。而腸球菌可進行耐藥基因的交換和/或?qū)⒛退幓蜣D(zhuǎn)移到其他革蘭氏陽性菌(如葡萄球菌和鏈球菌)的能力使這一問題更加復(fù)雜化。

VRE的出現(xiàn)給傳染病的防控帶來巨大隱憂。新型抗菌藥物如利奈唑胺、達托霉素和替加環(huán)素等逐漸應(yīng)用于臨床上代替萬古霉素的治療，使萬古霉素成為“最后一線藥物”，但目前這些新型抗菌藥物也出現(xiàn)敏感性降低或消失的臨床分離株。抑菌劑利奈唑胺于2000年獲得批準并被廣泛使用，耐藥性的出現(xiàn)與其在VRE以及萬古霉素易感腸球菌的治療有關(guān)。耐利奈唑胺腸球菌盡管在腸球菌中的檢出率低至不足1%，但由于產(chǎn)生耐藥性發(fā)展速度極快受到廣泛關(guān)注[14]。對惡唑烷酮抗菌藥物的耐藥性(或敏感性降低)主要是通過獲得氯霉素-氟苯尼考耐藥基因(cfr)或染色體點突變(23S rRNA或核糖體蛋白)介導(dǎo)的，此外，2015年在動物源和人源中檢測到的新型耐藥基因optrA也可介導(dǎo)對惡唑烷酮類的耐藥。cfr基因的獲取通常是通過可移動元件進行耐藥傳播并降低VRE對多種抗菌藥物的敏感性(氯霉素類、林可霉素類、惡唑烷酮類、截短側(cè)耳素類和鏈陽霉素A類)[15]。而德國的一項最新研究顯示，在屎腸球菌移動元件和/或染色體DNA上檢測到cfr(B)變異基因，與艱難梭狀芽孢桿菌的cfr相似基因具有99.9%的相同序列[14]。

目前，對替加環(huán)素耐藥腸球菌的耐藥機制尚不清楚，通過對替加環(huán)素耐藥腸球菌進行基因組分析，發(fā)現(xiàn)耐藥性的決定因素主要由外排泵基因tet(L)和核糖體保護蛋白tet(M)所介導(dǎo)[9]。最近德國的一項研究發(fā)現(xiàn)Tn1549vanB基因型耐藥性的傳播，主要歸因于vanB基因在腸球菌分離株染色體片段之間的交換，對多重耐藥性病原體傳播提供理論支撐[16]。

3 VRE在人-畜間的傳播

養(yǎng)殖場是耐藥菌/耐藥基因產(chǎn)生的主要場所之一，現(xiàn)有研究表明，食源性致病菌耐藥性日益加重，雖然不能證明人與動物之間相同的VRE型是由于人們食用動物性食品引起的，但是，通過使用不同的分子分型技術(shù)研究的結(jié)果表明，食源性耐藥菌和/或耐藥基因可沿著食物鏈“動物-環(huán)境-食品-人”傳播，動物和人中VRE菌株之間存在很強的相關(guān)性[17]。如美國禽源彎曲菌耐藥性研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)禽業(yè)使用恩諾沙星引起彎曲菌對喹諾酮類藥物耐藥，導(dǎo)致人感染彎曲菌后使用喹諾酮類藥物治療失敗率增高[17]；由于阿伏帕星的使用，導(dǎo)致歐洲養(yǎng)殖業(yè)中VRE的出現(xiàn)，在阿伏帕星被禁止使用于養(yǎng)殖業(yè)后，歐洲VRE檢出率降低；2000年-2002年丹麥豬源慶大霉素耐藥糞腸球菌的檢出率從2%增加到6%，與此對應(yīng)的是，丹麥北部地區(qū)引起心內(nèi)膜炎感染的耐慶大霉素糞腸球菌也增加相同比例，此外，體外試驗表明，來源于動物的VRE可在人類腸道內(nèi)定植。以上事例說明動物性食品源耐藥腸球菌可通過“生產(chǎn)-儲存-運輸-銷售-消費”中的多個環(huán)節(jié)進入食品鏈，進而傳播給人類[18]。

我國養(yǎng)殖場源腸球菌對臨床常用抗菌藥物耐藥性嚴重，耐藥菌通過多種途徑污染食品，進而引發(fā)食物中毒事件，而耐藥腸球菌則會導(dǎo)致疾病治愈時間延長，并提升感染率和病死率，給疾病治療造成負擔(dān)[18]。腸球菌中一些菌種長期作為發(fā)酵劑和人畜腸道菌群調(diào)節(jié)劑用于飼料、食品和藥品生產(chǎn)，如果這些工業(yè)用菌株獲得耐藥性，將加劇細菌耐藥性的傳播和危害。

4 VRE流行現(xiàn)狀

2018年，有報道瑞士伯爾尼州醫(yī)院內(nèi)ST796 VRE菌株的暴發(fā)，由該克隆型屎腸球菌導(dǎo)致的血液感染已在澳大利亞和新西蘭出現(xiàn)[19]。ST796 VRE分離株不僅顯示出對萬古霉素的耐藥性，還對氨芐西林、左氧氟沙星和慶大霉素有很高的耐藥性。瑞士暴發(fā)的分離株(ST796)與澳大利亞分離株的同源性達97%以上，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)ST796型菌株由ST555進化而來，由此推斷院內(nèi)屎腸球菌型別變遷可能受醫(yī)院的環(huán)境影響[20]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇的使用頻率和時間延長，屎腸球菌對乙醇耐受性增加，進一步表明菌株在選擇壓力下有一定的適應(yīng)性[21]。對患者和環(huán)境中的VRE研究發(fā)現(xiàn)，69.2%患者樣本為PFGE-A型，84.6%環(huán)境樣本為PFGE-E型，22.2%的PFGE-A型患者樣本和81.2%的PFGE-E型環(huán)境樣本明膠酶E(增加生物膜生成)陽性，溶血素激活物陰性[22]。在加強手消毒后，VRE陽性率有所下降，由此可見感染預(yù)防控制策略的實施對于控制VRE暴發(fā)和減少傳播至關(guān)重要。對108例耐萬古霉素血流感染患者定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，利奈唑胺(600 mg/12 h)和大劑量達托霉素(≥9 mg/kg)比常規(guī)劑量(6 mg/kg～9 mg/kg)達托霉素治療組能更快的清除VRE[23]。

研究顯示，2014年-2016年[24]，北京協(xié)和醫(yī)院VRE檢出率為1.3%～3.0%，耐萬古霉素屎腸球菌的檢出率為3.6%～4.9%。由此可見，在耐萬古霉素腸球菌中，屎腸球菌更為常見，其中CC17是攜帶vanA基因的主要ST型。2012年我國研究報道，96株耐萬古霉素屎腸球菌和5株耐萬古霉素糞腸球菌均以攜帶vanA耐藥基因為主，僅1株屎腸球菌為ST362(CC362)，其余都屬于與CC17相關(guān)的ST型。76株VRE(69株屎腸球菌、7株糞腸球菌)均攜帶vanA耐藥基因，MLST型別均屬CC17[25]。2007年-2015年天津地區(qū)醫(yī)院內(nèi)人群鼻拭子、手拭子樣本中，VRE定植率(0.1%)低于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(0.9%)和革蘭氏陰性桿菌(8.8%)[26]。VRE感染死亡率(64.6%)明顯高于萬古霉素敏感腸球菌(39.4%)，并且分離出VRE菌株患者抗菌藥物花費約為分離出敏感株患者的2倍[27]。因此，有效降低VRE感染頗為重要。

5 VRE治療的局限和新型治療方法

VRE是胃腸道共生菌，在胃腸道定植是VRE感染的第一步，流行病學(xué)研究表明，由于腸球菌的固有耐藥以及對新抗菌藥物可迅速產(chǎn)生耐藥，而臨床有效的治療方法很少，故VRE在腸道的持續(xù)定植和引發(fā)的感染對人和動物的健康及經(jīng)濟產(chǎn)生嚴重影響。目前認為有效治療VRE引起感染的藥物有喹奴普丁/達福普丁、替考拉寧、奧利萬星、利奈唑胺和達托霉素等[26]。這些抗菌藥物中的一部分只被批準作為治療皮膚相關(guān)感染的藥物，有些還處于開發(fā)的試驗階段。VRE耐藥形勢日益嚴重，耐藥機制復(fù)雜，但新抗菌藥物的研發(fā)速度緩慢，因此，尋求新型的抗菌藥物替代物成為研究者們關(guān)注的重點。

許多革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌產(chǎn)生的細菌素，是一種天然的、具有抗菌活性的物質(zhì)，且一株菌可產(chǎn)生多種細菌素，而同一種細菌素也可由不同菌株產(chǎn)生[28]，因此細菌素具有替代抗菌藥物潛力。細菌素是小分子多肽，由長短不同的氨基酸組成，并且具有抑菌活性，是細菌在代謝過程中通過核糖體合成。最近通過抗性突變體的基因組測序逐漸闡明細菌素的作用機制[29]，而了解細菌素是如何發(fā)揮抗菌作用是進一步研究細菌素在體內(nèi)治療感染的關(guān)鍵。

細菌素與傳統(tǒng)抗菌藥物相比，其特點和優(yōu)勢在于：①抗生素由非核糖體合成，細菌素由核糖體合成，抗生素可以殺死很多細菌，但是細菌素的抑菌譜不一樣，相對來說它有一定的特異性。②細菌素是由基因編碼、核糖體合成的一類胞外分泌蛋白，大多數(shù)細菌素是蛋白類抗菌活性物質(zhì)，為靶向靶細胞中的特定成分[30]，因此對那些已經(jīng)對抗生素產(chǎn)生耐藥性的致病菌依然具有殺菌作用。在鼠模型中研究結(jié)果顯示[31]，使用不同的細菌素可治療其他耐藥細菌引起的感染(如MRSA)。Galvin等報道，由乳酸乳球菌亞種產(chǎn)生的廣譜細菌素Lacticin 3147對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)、VRE、耐青霉素的肺炎球菌都具有抑殺作用[32]。③細菌素在不同的酸性和堿性條件下穩(wěn)定性很強，因此易于儲存，在進入腸道、消化道中又能夠被蛋白酶降解，對人和動物非常安全。④細菌素能夠在動物體內(nèi)發(fā)揮作用(抑制病原菌的生長)，但細菌素在發(fā)揮作用的同時又不會影響腸道內(nèi)正常的菌群平衡。大多數(shù)細菌都能產(chǎn)生細菌素，因此，細菌素作為大規(guī)模的天然儲備是細菌素全面取代抗生素的一個得天獨厚的有利條件，需要對更多的細菌素進行深入的研究，從而將細菌素運用于相關(guān)的治療選擇中。

目前，人們已經(jīng)將細菌素作為天然食品防腐劑或食品中添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)[33]。細菌素在畜牧業(yè)中作為飼料添加劑應(yīng)用，在藥品、化妝品以及動物保健中也有應(yīng)用。細菌素具有廣闊的前景，需要深入的研究使細菌素得到充分應(yīng)用。

6 展望

腸球菌作為機會性致病菌，隨著住院時間的延長以及抗菌藥物治療的不合理和不當(dāng)使用，導(dǎo)致VRE的出現(xiàn)，因其傳播迅速，而選擇治療藥物的局限，并且伴隨高發(fā)病率和高死亡率，逐漸成為全球最重要的醫(yī)院內(nèi)感染菌之一，先前認為的抗生素空白和所謂的后抗生素時代似乎已經(jīng)來臨。全球范圍內(nèi)都需要有新的抗菌藥物來對抗細菌耐藥性，盡管細菌素目前尚未被充分利用，但它們在治療方面具有巨大潛力，應(yīng)通過深入了解它們的作用方式以增加其用途。

有關(guān)VRE的研究數(shù)據(jù)較少，在耐藥和傳播機制等方面的研究有待完善。VRE檢出率不斷升高，同時耐藥機制復(fù)雜化，傳播機制不明。因此，應(yīng)對VRE進行長期的流行病學(xué)監(jiān)測，限制萬古霉素和頭孢菌素等廣譜抗生素的使用，建立本地VRE數(shù)據(jù)庫，防止VRE的發(fā)生和蔓延。