基質(zhì)金屬蛋白酶7在炎癥性腸病中的臨床意義*

莊培麗 周 璐 朱瑞齊 王丹丹 張 哲 馮百歲

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(450014)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)主要累及胃腸道，是一種慢性反復(fù)發(fā)作的免疫介導(dǎo)性炎癥性疾病，主要包括兩種疾病類型，即潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn’s disease, CD)，盡管發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但目前認(rèn)為其與腸道屏障完整性、先天性與適應(yīng)性免疫失調(diào)、基因易感性、環(huán)境因素等均有密切的關(guān)聯(lián)[1]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一組蛋白水解酶家族，能夠調(diào)節(jié)膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白等多種細(xì)胞外基質(zhì)成分的更新[2]，同時(shí)可降解或激活多種非基質(zhì)底物，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等促炎細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等，從而促進(jìn)組織重塑、參與傷口愈合，調(diào)節(jié)腸道局部炎癥[3]。MMP-7又名基質(zhì)溶素，是IBD炎癥期間介導(dǎo)組織損傷的重要介質(zhì)[4]，同時(shí)在腸道傷口愈合過程中起有重要的作用[5]，未來可作為潛在的治療靶點(diǎn)。

既往有研究證實(shí)活動(dòng)期UC患者腸道活檢樣本中MMP-7表達(dá)增加[6]，但MMP-7是否與IBD炎癥嚴(yán)重程度有關(guān)尚未明確。本研究通過檢測(cè)IBD患者結(jié)腸組織中MMP-7表達(dá)情況，并分析其與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性，旨在探討結(jié)腸組織MMP-7能否反映IBD炎癥活動(dòng)性，從而為IBD的臨床診斷和治療提供更多可能的方法和策略。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

收集2019年1月—2021年1月于鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診治療的IBD患者結(jié)腸活檢樣本共38例(其中20例UC、18例CD)，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病學(xué)組制定的《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(2018年·北京》)[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并病毒、細(xì)菌、真菌等感染性疾病、嚴(yán)重心肺腎疾病、全身惡性腫瘤、其他自身免疫病以及其他慢性活動(dòng)性疾病的患者。分別采用改良Mayo評(píng)分系統(tǒng)[8]和CDAI評(píng)分系統(tǒng)[9]對(duì)UC、CD患者進(jìn)行評(píng)分，分組情況和入選者的基本情況見表1。各組患者的性別、年齡相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)收集IBD患者結(jié)腸鏡檢查當(dāng)天空腹抽取的肘靜脈血，檢測(cè)血清C反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞(WBC)。選取5例結(jié)腸癌患者距癌灶5 cm以上的癌旁正常組織作為對(duì)照組，由專業(yè)的病理醫(yī)師證實(shí)切緣組織未見癌細(xì)胞浸潤(rùn)，無IBD等消化道疾病、自身免疫病等病史。本研究的所有數(shù)據(jù)收集均經(jīng)過鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

二、主要實(shí)驗(yàn)試劑

表1 各組一般資料比較

抗人MMP-7鼠單克隆抗體[安迪生物科技(上海)有限公司]；鼠/兔通用二抗(徠卡生物系統(tǒng)有限公司)；抗體稀釋液購自基因科技(上海)股份有限公司；檸檬酸鹽緩沖液、磷酸緩沖鹽粉末、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蘇木精染色液、返藍(lán)染色液購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。

三、方法

收集入選者第一次電子結(jié)腸鏡檢查的結(jié)腸標(biāo)本，4%多聚甲醛溶液固定2 h，梯度乙醇脫水、二甲苯浸泡透明，包埋，連續(xù)切片，厚3～5 μm。60 ℃烘箱1 h，依次經(jīng)二甲苯和梯度乙醇溶液脫蠟、水化；檸檬酸鹽緩沖液高溫抗原修復(fù)，3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；加入抗人MMP-7單克隆抗體(稀釋濃度1∶100)，濕盒內(nèi)常溫孵育30 min；滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗；DAB顯色、蘇木精復(fù)染、返藍(lán)液返藍(lán)、梯度乙醇溶液脫水、二甲苯透明，滴加中性樹脂，蓋玻片封片。

病理切片掃描儀400倍鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)視野拍照，使用Image J軟件的IHC Profiler插件自動(dòng)計(jì)算胞質(zhì)內(nèi)染色情況和陽性分?jǐn)?shù)(強(qiáng)陽性區(qū)域的權(quán)重記為4分，陽性為3分，弱陽性為2分，陰性為1分，按此權(quán)重計(jì)算陽性分?jǐn)?shù))，取均值用于定量分析，觀察各組之間MMP-7表達(dá)差異，并分析其與CRP、WBC的相關(guān)性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、MMP-7在結(jié)腸組織中的定位和表達(dá)

在對(duì)照組、緩解期UC和緩解期CD結(jié)腸組織中，MMP-7僅在細(xì)胞質(zhì)中少量表達(dá)，染色強(qiáng)度較弱，而活動(dòng)期IBD患者結(jié)腸組織中可見大量陽性區(qū)域，染色可呈黃棕色或深棕色，主要集中于活動(dòng)性炎癥區(qū)域的上皮細(xì)胞中，在少量炎性細(xì)胞中也可見到部分染色(圖1)。與對(duì)照組相比，活動(dòng)期UC組和重度CD組MMP-7表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05)。隨著嚴(yán)重程度的增加，MMP-7表達(dá)呈逐漸上調(diào)的趨勢(shì)，重度UC組和重度CD組組織中MMP-7表達(dá)與相應(yīng)緩解期組相比均明顯上調(diào)(P<0.05)，而相同嚴(yán)重程度的UC與CD患者之間MMP-7表達(dá)未見明顯差異(P>0.05；表2、圖2)。

表2 不同組別患者結(jié)腸組織中MMP-7表達(dá)

二、MMP-7表達(dá)與患者一般情況的關(guān)系

不同性別、年齡以及是否使用抗TNF-α制劑的IBD患者之間MMP-7表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；表3、圖3)。

三、MMP-7表達(dá)與CRP、WBC的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析提示活動(dòng)期IBD患者M(jìn)MP-7表達(dá)與CRP、WBC呈中度正相關(guān)(r=0.816，P<0.001；r=0.527，P<0.001；圖4)。

圖3 不同性別、年齡、治療方法的IBD患者結(jié)腸組織中MMP-7表達(dá)

圖4 活動(dòng)期IBD患者M(jìn)MP-7表達(dá)與CRP、WBC的相關(guān)性

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

表3 不同年齡、性別、治療方法的IBD患者結(jié)腸組織中MMP-7表達(dá)

討 論

IBD是一種以復(fù)發(fā)與緩解交替為主要特征的腸道炎性疾病，具有高度異質(zhì)性，根據(jù)累及部位、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查等的不同，分為UC和CD[10]。近年隨著現(xiàn)代人飲食結(jié)構(gòu)和生活環(huán)境的改變，IBD的發(fā)病率和流行率逐年增高。MMPs是腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的核心，參與調(diào)節(jié)腸上皮屏障、組織重塑、傷口修復(fù)等過程[11-12]，其中MMP-7是MMPs家族中最重要的酶之一。Rath等[13]證實(shí)了UC患者結(jié)腸活檢組織炎癥細(xì)胞中MMP-7基因表達(dá)顯著上調(diào)，提示其在結(jié)腸炎相關(guān)的炎癥變化中起重要作用。本研究采用免組化染色法分析38例IBD患者和5例癌旁對(duì)照組的結(jié)腸組織中MMP-7表達(dá)和定位情況，結(jié)果顯示對(duì)照組和緩解期患者的組織中僅在細(xì)胞質(zhì)中可見少量MMP-7表達(dá)，而在活動(dòng)期IBD患者組織中表達(dá)顯著增高，且隨著嚴(yán)重程度的升高而呈升高趨勢(shì)，提示MMP-7表達(dá)與嚴(yán)重程度和活動(dòng)性相關(guān)。相關(guān)性分析還發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期IBD患者組織中MMP-7表達(dá)與CRP、WBC呈顯著正相關(guān)，提示MMP-7表達(dá)在一定程度上可反映腸道炎癥程度，可能是IBD炎癥活動(dòng)性的重要指標(biāo)。

TNF-α是一種參與促炎過程的細(xì)胞因子，其水平在IBD患者血液和結(jié)腸組織中均有升高，抗TNF-α生物制劑(如英夫利昔單抗、阿達(dá)木單抗等)已成為常規(guī)治療無效的中重度活動(dòng)性IBD患者的主要治療手段[14]。M?kitalo等[15]發(fā)現(xiàn)兒童IBD患者接受英夫利昔單抗治療后可實(shí)現(xiàn)臨床和組織學(xué)緩解，且MMP-7水平可降低甚至恢復(fù)至正常表達(dá)水平。本研究結(jié)果顯示，MMP-7表達(dá)與患者性別、年齡、有無抗TNF-α制劑治療均無關(guān)。但鑒于本回顧性研究的樣本量較少，同時(shí)僅局限于結(jié)腸組織中MMP-7表達(dá)差異，未能進(jìn)行血清、尿液樣本中MMP-7的檢測(cè)，且不同患者M(jìn)MP-7水平可能存在個(gè)體化差異，因此MMP-7表達(dá)與抗TNF-α制劑治療無關(guān)的結(jié)論還不夠嚴(yán)謹(jǐn)。下一步應(yīng)完善研究方案，盡量使用同一患者抗TNF-α制劑治療前后的結(jié)腸組織，或設(shè)計(jì)前瞻性試驗(yàn)干預(yù)治療方案以嚴(yán)格對(duì)比，從而明確抗TNF-α制劑對(duì)MMP-7表達(dá)的影響。

總之，MMP-7表達(dá)與IBD的活動(dòng)性和嚴(yán)重程度有一定相關(guān)性，與性別、年齡、有無抗TNF-α制劑治療無關(guān)。MMP-7在一定程度上可反映腸道炎癥程度，可能是IBD炎癥活動(dòng)的重要指標(biāo)。但結(jié)論需行進(jìn)一步研究證實(shí)。