陜西泡菜中降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選及其發(fā)酵特性與耐受性研究

熊蝶，袁嵐玉，李媛媛，范鵬飛，馮武

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢，430070)

泡菜是中國(guó)傳承數(shù)千年的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，因其口感酸香脆嫩、鮮香開(kāi)胃而廣受人們喜愛(ài)[1]。隨著泡菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其工業(yè)化程度逐漸提高，產(chǎn)品質(zhì)量也更加穩(wěn)定，但仍然存在許多問(wèn)題[2]。泡菜在制作過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽含量超標(biāo)也是泡菜常見(jiàn)的安全問(wèn)題之一[3]。亞硝酸鹽食用過(guò)量會(huì)對(duì)人體造成危害，一次食用達(dá)到中毒劑量會(huì)造成低氧血癥等急性毒性危害，同時(shí)亞硝酸鹽在體內(nèi)與胺類物質(zhì)結(jié)合生成的亞硝胺作為一種強(qiáng)致癌物，會(huì)增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，因此控制泡菜中亞硝酸鹽的產(chǎn)生尤為重要[4-5]。

乳酸菌是一類細(xì)菌的統(tǒng)稱，它呈革蘭氏陽(yáng)性，一般被認(rèn)為是安全的細(xì)菌，有許多研究表明了乳酸菌降解亞硝酸鹽的性質(zhì)[6]。朱軍莉等[7]從自制發(fā)酵泡菜中分離出1株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，其培養(yǎng)72 h后對(duì)125 mg/L亞硝酸鹽的降解率達(dá)到95.6%。王英等[8]從自制發(fā)酵酸豆角中分離出1株植物乳桿菌，培養(yǎng)48 h后對(duì)200 mg/L亞硝酸鹽的降解率達(dá)到91.64%。同時(shí)乳酸菌能夠發(fā)酵糖產(chǎn)酸，在泡菜發(fā)酵的過(guò)程中占主導(dǎo)地位，因此將具有良好發(fā)酵性質(zhì)的乳酸菌應(yīng)用于泡菜發(fā)酵中，是一種便捷有效降低泡菜中亞硝酸鹽含量并提升泡菜安全性的方法[9]。此外，乳酸菌還被報(bào)道有降低血清膽固醇[10]、緩解乳糖不耐受癥[11]以及提高免疫[12]等益生作用，因此隨泡菜一起進(jìn)入人體的乳酸菌有可能在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用。

本研究主要從陜西家庭自制泡菜中篩選出高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，然后對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行發(fā)酵特性與耐受特性的研究。通過(guò)研究其產(chǎn)酸和降解亞硝酸鹽的能力，以及耐亞硝酸鹽和耐NaCl特性，為開(kāi)發(fā)菌株應(yīng)用于泡菜生產(chǎn)發(fā)酵的潛力提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陜西家庭自制泡菜。

MRS肉湯、MRS瓊脂、乳酸菌成套生化鑒定管，青島海博生物技術(shù)有限公司；硼砂、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鹽酸、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、NaCl、NaNO2，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan GO全波長(zhǎng)讀數(shù)儀，美國(guó)賽默飛世爾公司；UV1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；VD-1320超凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；PHS-3C pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AL204電子天平，上海梅特勒托利多儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的分離與純化

吸取25 mL泡菜汁液到50 mL MRS肉湯中，于37 ℃下增菌培養(yǎng)24 h，然后用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，取合適稀釋度的菌液0.1 mL涂布于含有CaCO3的MRS瓊脂平板上，并于37 ℃下培養(yǎng)48 h。挑取平板上有明顯溶鈣圈且表面濕潤(rùn)的單菌落，于MRS平板上反復(fù)劃線純化，然后對(duì)純化菌株進(jìn)行革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，將革蘭氏陽(yáng)性與過(guò)氧化氫酶陰性菌株進(jìn)行4 ℃斜面保存以及-20 ℃甘油管保存，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選

1.3.2.1 亞硝酸鹽的測(cè)定

基于GB/T 5009.33—2016中的分光光度法[13]，并結(jié)合茹曉[14]測(cè)定亞硝酸鹽含量的方法進(jìn)行修改。取離心去菌體后發(fā)酵液1 mL，依次加入2.5 mL硼砂、1 mL亞鐵氰化鉀、1 mL乙酸鋅，而后用超純水定容至50 mL，混勻后靜置30 min，用濾紙過(guò)濾得到濾液備用。加入合適量的濾液到50 mL比色管中，加入2 mL對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻后靜置3 min，加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，用超純水定容至50 mL，混勻后靜置15 min，以不添加濾液的零管調(diào)零，于538 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。同時(shí)做各不同添加量濾液對(duì)應(yīng)的試劑空白。按照GB/T 5009.33—2016中的分光光度法測(cè)定并繪制亞硝酸鹽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到亞硝酸鹽含量。亞硝酸鹽降解率按照公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：R表示亞硝酸鹽降解率，%；C0表示培養(yǎng)基中NaNO2初始含量，mg/L；C1表示不同培養(yǎng)時(shí)刻培養(yǎng)基中NaNO2含量，mg/L。

1.3.2.2 降解亞硝酸鹽乳酸菌的初篩

參考郭志華等[15]的方法，對(duì)降解亞硝酸鹽的乳酸菌進(jìn)行初步篩選。將上述純化保存的菌株接種到MRS肉湯中活化2次，并以體積分?jǐn)?shù)為2%的添加量將活化菌液接種于含有150 mg/L NaNO2的10 mL MRS肉湯中，37 ℃下培養(yǎng)48 h。向培養(yǎng)基中加入2 mL對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻后靜置3 min，再加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，混勻后靜置15 min，觀察各菌株培養(yǎng)基的顏色，與添加150 mg/L NaNO2的MRS肉湯以及不添加 NaNO2的MRS培養(yǎng)基進(jìn)行顏色對(duì)比，選出顏色淺的菌株進(jìn)行后續(xù)篩選。

1.3.2.3 降解亞硝酸鹽乳酸菌的復(fù)篩

將初篩中得到的菌株接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中活化2次，然后以體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量接種到含有150 mg/L NaNO2的MRS肉湯中，在37 ℃下培養(yǎng)48 h，并按照1.3.2.1中的方法測(cè)定48 h內(nèi)菌株對(duì)亞硝酸鹽的降解率，篩選出降解亞硝酸鹽效果好的菌株。

1.3.3 菌種鑒定

1.3.3.1 生理生化鑒定

使用乳酸菌成套生化鑒定管測(cè)定菌株的糖發(fā)酵結(jié)果，結(jié)合《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[16]初步判定菌株種類。

1.3.3.2 16S rDNA鑒定

將活化的菌液交于上海生工生物工程有限公司進(jìn)行16S rDNA的測(cè)序，將得到的序列與NCBI中序列進(jìn)行BLAST同源性對(duì)比，并用MEGA 7.0繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，最終確定菌株種屬。

1.3.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將菌株接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中活化2次，并以體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量接種于MRS肉湯中，于37 ℃培養(yǎng)，每2 h測(cè)定OD600nm吸光值。

1.3.5 乳酸菌發(fā)酵特性的測(cè)定

1.3.5.1 產(chǎn)酸能力的測(cè)定

將菌株接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中活化2次，并以體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量接種于MRS肉湯中，于37 ℃培養(yǎng)72 h，在0、4、8、12、24、36、48、60、72 h測(cè)定發(fā)酵液pH值及總酸含量。總酸含量按照GB/T 12456—2008[17]中的酸堿滴定法測(cè)定。

1.3.5.2 降解亞硝酸鹽速率的測(cè)定

將菌株接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中活化2次，并以體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量接種于含有150 mg/L NaNO2的MRS肉湯中，于37 ℃培養(yǎng)48 h，在0、4、8、12、24、36、48、60、72 h測(cè)定發(fā)酵液pH值以及亞硝酸鹽降解率。按照1.3.2中的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 乳酸菌耐受性測(cè)定

1.3.6.1 耐亞硝酸鹽能力的測(cè)定

將菌株接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中活化2次，以體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量接入含有50、100、150、200、250、300 mg/L NaNO2的MRS肉湯中，以不添加NaNO2的肉湯作為對(duì)照，于37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定0和24 h的OD600nm吸光值。

1.3.6.2 耐NaCl能力的測(cè)定

將菌株接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中活化2次，以體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量接入含有20、40、60、80、100、120、140 g/L NaCl的MRS肉湯中，以不添加NaCl的肉湯作為對(duì)照，于37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定0和24 h的OD600nm吸光值。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，用SPSS 23.0進(jìn)行顯著性分析，用Origin 2016繪圖，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解亞硝酸鹽乳酸菌初篩與復(fù)篩結(jié)果

從陜西泡菜中分離出15株有明顯溶鈣圈的菌株，其革蘭氏染色結(jié)果均為陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性，初步判定為乳酸菌，編號(hào)為PC1～PC15。將15株菌接種至MRS肉湯中活化時(shí)，有9株菌生長(zhǎng)渾濁，在含有150 mg/L NaNO2的肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，直接顯色結(jié)果如圖1，其中PC5、PC8、PC10、PC11和PC14的顏色較淺，推測(cè)培養(yǎng)基中殘留的NaNO2含量較少，將此5株菌進(jìn)行復(fù)篩。

5株菌的復(fù)篩結(jié)果如表1所示。培養(yǎng)36 h后，5株菌的亞硝酸鹽降解率均達(dá)到80%以上，其中菌株P(guān)C5和菌株P(guān)C11在培養(yǎng)到12 h時(shí)，其亞硝酸鹽降解率遠(yuǎn)高于其他3株菌。在培養(yǎng)至12 h時(shí)，菌株P(guān)C5的亞硝酸鹽降解率顯著高于菌株P(guān)C11，并且在發(fā)酵過(guò)程中，菌株P(guān)C5的亞硝酸鹽降解率一直高于PC11，因此選擇菌株P(guān)C5作為后續(xù)的研究對(duì)象。

圖1 部分菌株的培養(yǎng)基中NaNO2顯色反應(yīng)結(jié)果Fig.1 Color reaction results of NaNO2 in the culture medium of partial strains

2.2 生化鑒定結(jié)果

圖2顯示了菌株P(guān)C5的革蘭氏染色圖和菌落形態(tài)圖，菌株P(guān)C5為桿狀，其菌落乳白色濕潤(rùn)且凸起。表2顯示了菌株P(guān)C5發(fā)酵糖類的特性，其中菌株P(guān)C5可以發(fā)酵七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖和乳糖等10種糖。在參考《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[16]中關(guān)于部分乳桿菌的部分發(fā)酵特性后，推測(cè)其有可能是植物乳桿菌或敏捷乳桿菌(Lactobacillusagilis)。

表1 五株菌48 h內(nèi)的亞硝酸鹽降解率 單位：%

a-革蘭氏染色結(jié)果;b-菌落形態(tài)圖2 菌株P(guān)C5的菌落形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果Fig.2 Colony morphology and Gram staining result of strain PC5注：革蘭氏染色鏡檢放大倍數(shù)為1 000倍

表2 菌株P(guān)C5糖發(fā)酵反應(yīng)結(jié)果Table 2 Sugar fermentation reaction results of strain PC5

2.3 16S rDNA鑒定

菌株通過(guò)Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，然后用細(xì)菌引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后回收純化后測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用BLAST進(jìn)行對(duì)比，用MEGA 7.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的繪制。如圖3所示，菌株P(guān)C5與植物乳桿菌AMT74419的同源性為100%，綜合生化鑒定結(jié)果，菌株P(guān)C5為植物乳桿菌。

圖3 菌株P(guān)C5的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain PC5

2.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

由圖4可知，菌株P(guān)C5的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期是2～16 h，16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，因此活化時(shí)培養(yǎng)至16 h最優(yōu)。菌株P(guān)C5延滯期短，2 h時(shí)便可進(jìn)入對(duì)數(shù)期，菌量迅速增加，更適宜于培養(yǎng)發(fā)酵。

圖4 菌株P(guān)C5的生長(zhǎng)曲線Fig.4 The growth curve of strain PC5

2.5 乳酸菌發(fā)酵特性的測(cè)定

2.5.1 產(chǎn)酸能力的測(cè)定

由圖5可知，在菌株P(guān)C5發(fā)酵12 h時(shí)，發(fā)酵液pH值已經(jīng)降低至3.96±0.00，發(fā)酵24 h時(shí)，pH值降至3.73±0.01。菌株P(guān)C5發(fā)酵液的滴定總酸在4～24 h內(nèi)迅速積累，在24 h時(shí)已達(dá)到(1.99±0.01)%，發(fā)酵液中總酸的迅速積累使得pH值迅速下降。菌株P(guān)C5發(fā)酵液的滴定總酸和pH值在24 h之后均趨于穩(wěn)定，當(dāng)發(fā)酵至72 h，發(fā)酵液pH值達(dá)到3.72±0.00，滴定總酸為(2.02±0.05)%。菌株P(guān)C5發(fā)酵產(chǎn)酸能將培養(yǎng)基pH值降低至3.72左右，有利于泡菜的發(fā)酵酸化和抑制有害菌。

圖5 菌株P(guān)C5培養(yǎng)過(guò)程中pH值與滴定總酸的變化Fig.5 Changes of pH value and total acid titration during the culture of strain PC5

2.5.2 降解亞硝酸鹽速率的測(cè)定

由圖6可知，在添加150 mg/L NaNO2的MRS肉湯中，菌株P(guān)C5發(fā)酵8 h可降解(49.46±3.65)%的NaNO2，此時(shí)發(fā)酵液的pH值為4.21±0.03。當(dāng)發(fā)酵至12 h時(shí)，菌株P(guān)C5的亞硝酸鹽降解率達(dá)到(83.31±3.96)%，發(fā)酵液pH值降低至3.93±0.01。而發(fā)酵至24 h時(shí)，菌株P(guān)C5亞硝酸鹽降解率可達(dá)(99.37±0.56)%，此時(shí)發(fā)酵液的pH值降低至3.74±0.01，此后pH值趨于穩(wěn)定，NaNO2基本降解完全。在張慶芳等[18]的研究中指出，亞硝酸鹽的降解主要分為2個(gè)階段，在發(fā)酵液pH值高于4.5時(shí)，乳酸菌降解亞硝酸鹽以亞硝酸鹽還原酶降解為主，當(dāng)發(fā)酵液pH值低于4.0時(shí)，主要是酸降解亞硝酸鹽，由此推測(cè)，菌株P(guān)C5降解亞硝酸鹽的方式既有酶降解也有酸降解。

圖6 菌株P(guān)C5培養(yǎng)過(guò)程中pH值與亞硝酸鹽降解率的變化Fig.6 Changes of pH value and nitrite degradation rate during the culture of strain PC5

2.6 乳酸菌耐受性的測(cè)定

2.6.1 耐亞硝酸鹽能力的測(cè)定

由圖7可知，菌株P(guān)C5在含有50和100 mg/L NaNO2的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24 h，OD600nm能達(dá)到0.80以上，與不添加NaNO2時(shí)無(wú)顯著性差異。在NaNO2質(zhì)量濃度為150和200 mg/L時(shí)，菌株P(guān)C5生長(zhǎng)24 h后，OD600nm在0.50～0.70。當(dāng)NaNO2質(zhì)量濃度達(dá)到250和300 mg/L時(shí)，菌株P(guān)C5生長(zhǎng)24 h后OD600nm在0.30～0.50，顯著低于NaNO2質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)菌株P(guān)C5的OD600 nm。乳酸菌在泡菜發(fā)酵過(guò)程中會(huì)面臨亞硝酸鹽含量升高的問(wèn)題，因此作為接種發(fā)酵的乳酸菌需要具備一定程度的亞硝酸鹽耐受能力。由圖7可見(jiàn)，菌株P(guān)C5對(duì)ρ(NaNO2)≤200 mg/L具有較強(qiáng)的耐受能力，對(duì)250～300 mg/L的高質(zhì)量濃度NaNO2具有一定程度的耐受能力，因此PC5具備成為接種發(fā)酵泡菜的潛力。

圖7 菌株P(guān)C5在不同質(zhì)量濃度NaNO2中的生長(zhǎng)情況Fig.7 The growth of strain PC5 under different mass concentrations of NaNO2注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.6.2 耐NaCl能力的測(cè)定

泡菜發(fā)酵時(shí)通常需要加入一定量的食鹽，既能調(diào)節(jié)泡菜風(fēng)味也能抑菌，因此適合發(fā)酵泡菜的乳酸菌應(yīng)該具備一定程度的耐NaCl能力[19]。由圖8可知，在含有0～60 g/L NaCl的培養(yǎng)基中，菌株P(guān)C5培養(yǎng)24 h后均可以生長(zhǎng)，且OD600nm可達(dá)到0.60以上。當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為0和20 g/L時(shí)，菌株P(guān)C5生長(zhǎng)最好，其中20 g/L NaCl更適合PC5的生長(zhǎng)，OD600nm可達(dá)到1.15。當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí)，菌株P(guān)C5的生長(zhǎng)與不添加NaCl無(wú)顯著性差異。而NaCl質(zhì)量濃度增加至60 g/L時(shí)，PC5的OD600nm顯著下降至0.62，但仍然具有一定程度的耐受性，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度增加至80 g/L及以上時(shí)，菌株P(guān)C5幾乎不能生長(zhǎng)。由此可得菌株P(guān)C5對(duì)ρ(NaCl)≤60 g/L有較好的耐受性。

圖8 菌株P(guān)C5在不同質(zhì)量濃度NaCl中的生長(zhǎng)Fig.8 The growth of strain PC5 in different mass concentrations of NaCl

3 結(jié)論與討論

乳酸菌在傳統(tǒng)泡菜發(fā)酵過(guò)程中占主導(dǎo)地位，因此泡菜中有豐富的乳酸菌資源[20]。在泡菜發(fā)酵過(guò)程中，雜菌生長(zhǎng)會(huì)將蔬菜中的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，而接種乳酸菌發(fā)酵泡菜能迅速降低發(fā)酵泡菜的pH值，即抑制雜菌生長(zhǎng)以及硝酸鹽的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)亞硝酸鹽的降解，因此篩選產(chǎn)酸能力和降解亞硝酸鹽能力強(qiáng)的乳酸菌有利于接種發(fā)酵泡菜的研究[21]。

在本研究中，從陜西家庭自制泡菜中分離出了1株植物乳桿菌PC5，它具有較強(qiáng)的降解亞硝酸鹽能力，在含有150 mg/L NaNO2的培養(yǎng)基中發(fā)酵24 h能將pH值降低至3.74±0.01，同時(shí)亞硝酸鹽降解率達(dá)到(99.37±0.56)%。在發(fā)酵8 h時(shí)，菌株P(guān)C5的亞硝酸鹽降解率達(dá)到(49.46±3.65)%，推測(cè)菌株P(guān)C5可能存在酶降解與酸降解2種亞硝酸鹽降解方式。

泡菜中添加的食鹽以及產(chǎn)生的亞硝酸鹽都會(huì)對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生威脅，因此接種發(fā)酵泡菜的乳酸菌需要對(duì)食鹽與亞硝酸鹽具備一定耐受能力。菌株P(guān)C5在含有0～40 g/L NaCl的環(huán)境條件下生長(zhǎng)良好，對(duì)60 g/L NaCl具有較好耐受能力。對(duì)0～200 mg/L NaNO2，菌株P(guān)C5具有較好的耐受性，OD600nm能達(dá)到0.5以上。菌株P(guān)C5生長(zhǎng)延滯期短，產(chǎn)酸快且降解亞硝酸鹽能力強(qiáng)，同時(shí)具有較好的亞硝酸鹽和NaCl耐受能力，在提升泡菜品質(zhì)與安全性方面有較大應(yīng)用潛力，為開(kāi)發(fā)益生菌制劑提供基礎(chǔ)。