肺癌患者外周動(dòng)脈血和靜脈血循環(huán)腫瘤細(xì)胞含量的差異及其臨床意義

厲為良 李永華 梁衛(wèi)娟 呂麗輝 高鵬帥 楊玉波

肺癌已經(jīng)成為主要的公共衛(wèi)生問題之一，是當(dāng)今世上死亡率最高的惡性腫瘤[1-2]，盡管在肺癌的診治方面取得了重大進(jìn)展，但肺癌的5年生存率即便是早期(Ⅰa1、Ⅰa2、Ⅰa3期)NSCLC也分別只有96.0%、87.2%和78.7%[3]，可見早期診斷、早期治療以提高肺癌長期生存率仍然任重而道遠(yuǎn)。

CTC檢測是一種新興的液體活檢技術(shù)，在腫瘤的早期診斷、個(gè)體化治療等方面有較廣泛的應(yīng)用。CTC可在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段檢測到,但陽性率在血樣本量為7.5 mL時(shí)也只有30.4%(38/125)～ 52.9% (18/34)[4-5]。CTC的陽性率低的原因除了CTC本身稀少、CTC富集方法不同[6-7]外，血樣本的來源不同可能是問題的關(guān)鍵，即外周動(dòng)脈血的CTC含量可能與外周靜脈的CTC含量不同。鑒于此，本課題組對肺癌患者外周動(dòng)、靜脈血中CTC含量進(jìn)行了對比研究。

資料與方法

一、研究設(shè)計(jì)和病例選擇

本研究選取2018年3月至2019年7月在浙江大學(xué)明州醫(yī)院和寧波東海醫(yī)院經(jīng)病理確診肺癌患者46例進(jìn)行外周動(dòng)、靜脈血CTC的自身對照研究，并獲得其醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有患者均獲得知情同意。根據(jù)相關(guān)的臨床資料、全身計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)和正電子發(fā)射斷層掃描(PET)、腦磁共振成像(MRI)及病理結(jié)果，參照國際肺癌研究協(xié)會(huì)(The International Association for The Study of Lung Cancer，IASLC)的第八版TNM分期建議[8]確定腫瘤分期。

二、研究方法

所有納入研究的患者均同時(shí)在其同側(cè)肢體采取外周動(dòng)脈血(A組)和外周靜脈血(V組)各5 mL,注入統(tǒng)一采用ACD 抗凝的真空采血管內(nèi)，密封后立即顛倒混勻8次，室溫(15～30 ℃)下保存，24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行檢測。采用免疫磁珠陰性富集聯(lián)合免疫熒光原位雜交法(immunofluorescence in situ hybridization, imFISH)對CTC進(jìn)行富集計(jì)數(shù)和鑒定[9](由廣州達(dá)安臨床檢驗(yàn)中心負(fù)責(zé)檢測，檢測血標(biāo)本量為3.2 mL)，從3.2 mL血標(biāo)本量中檢出1個(gè)CTC即確認(rèn)為檢出CTC，以此計(jì)算CTC檢出率；以檢出CTC>=2個(gè)/3.2 mL為CTC陽性的診斷界值，計(jì)算CTC陽性率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、入組病例基線特征

共有46例肺癌納入本研究，其基線特征見表1。

二、CTC檢測結(jié)果

檢測結(jié)果顯示：46例肺癌患者外周動(dòng)脈血(A組)CTC平均含量明顯高于外周靜脈血(V組)的CTC平均含量，兩組對比有顯著性差異(t=2.533，P=0.015)；A組的CTC檢出率(71.7%)明顯高于V組(52.2%)，且有顯著性差異(χ2=8.873，P=0.032)；A組的CTC陽性率(58.7%)明顯高于V組(30.4%)，且有顯著性差異(χ2= 8.435，P=0.040)。(見表2)。

不同TNM分期肺癌的外周動(dòng)脈血和外周靜脈血CTC陽性率的差異在Ⅰ期最明顯，其外周動(dòng)脈血CTC陽性率(50.0%)明顯高于外周靜脈血(14.3%)，且差異顯著(χ2=8.857，P=0.013)，而其它三期的動(dòng)靜脈血CTC陽性率無明顯差異。(見表3)。

表3 46例肺癌患者TNM分期與外周動(dòng)脈血和外周靜脈血CTC陽性率

討 論

外周靜脈采血是一種簡單、微創(chuàng)的方法，一般患者都能接受CTC檢測。但肺癌CTC的陽性率偏低，尤其在早期肺癌。Tanaka 等[4]用半自動(dòng)系統(tǒng)(Semiautomated system)對125例確診的原發(fā)性肺癌(其中31例有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)檢測其外周靜脈血CTC，檢測樣本量為7.5 mL，檢出率只有30.6%。Allard WJ等[6]報(bào)告用CellSearch系統(tǒng)檢測了964 例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移癌的2183份外周靜脈血標(biāo)本，其CTC陽性率只有36%(診斷界值為CTC>=2個(gè)/7.5mL)。隨著CTC檢測技術(shù)的進(jìn)步，CTC的檢測水平也得到提升。Devriese LA等[7]采用免疫磁珠富集法 (Immunomagnetic bead enrichment)檢測了46例晚期(advanced)非小細(xì)胞肺癌，其檢出率為46%。 最近，Duan等[5]報(bào)告，對34例確診的原發(fā)性肺癌(其中9例為浸潤性癌)采用循環(huán)上皮細(xì)胞采集器(GILUPI Cellcollector)及免疫熒光染色法檢測、鑒定其外周靜脈血CTC，其CTC檢出率可達(dá)52.9%(18/34)。

本研究同時(shí)對外周動(dòng)脈血標(biāo)本和外周靜脈血標(biāo)本進(jìn)行檢測，采用的是免疫磁珠陰性富集聯(lián)合免疫熒光原位雜交法(immunofluorescence in situ hybridization, imFISH)[9]，檢測血標(biāo)本量為3.2mL。所得的外周靜脈血的CTC檢出率(52.2%)與最近的文獻(xiàn)[5]結(jié)果相近。而同一檢測方法所得的外周動(dòng)脈血的CTC檢出率(71.7%)則明顯高于外周靜脈血，也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前述研究報(bào)告[4-7]的結(jié)果。這一結(jié)果提示肺癌CTC在外周動(dòng)、靜脈血中的含量是不同的。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者外周動(dòng)脈血CTC含量(1.98 ± 1.73[個(gè)/3.2mL])明顯高于外周靜脈血CTC含量(1.39 ± 1.86 [個(gè)/3.2mL])(t=2.533，P=0.015)，驗(yàn)證了上述推測，也即檢測外周動(dòng)脈血CTC相比外周靜脈血可獲更高的檢出率。這對于采用液體活檢方法早期診斷肺癌和轉(zhuǎn)歸及療效隨訪可能具有重要意義。實(shí)際上，如果以檢出CTC>=2個(gè)/3.2mL為CTC陽性的診斷界值，本研究結(jié)果顯示，外周動(dòng)脈血的CTC陽性率(58.7%)明顯高于外周靜脈血的CTC陽性率(30.4%)(χ2=8.435，P=0.040)，尤其在早期(Ⅰ期)肺癌更有其優(yōu)勢，外周動(dòng)脈血的CTC陽性率(50.0%)明顯高于外周靜脈血的CTC陽性率(14.3%)(χ2=8.857，P=0.013)，提示檢測外周動(dòng)脈血CTC相比外周靜脈血能獲得更早期的診斷，有利于肺癌的早期診治。

肺癌患者外周動(dòng)脈血CTC含量明顯高于外周靜脈血CTC含量的原因可能是CTC在循環(huán)系統(tǒng)中的損耗不同。CTC在血液中循環(huán)時(shí)可能會(huì)被隔離、濾過、破壞或清除,也可能會(huì)凋亡，大約只有0.01%的CTC才能形成轉(zhuǎn)移灶[10-11]，這其中毛細(xì)血管網(wǎng)的作用更不能低估。眾所周知，如果肺癌CTC從支氣管靜脈入血，則外周靜脈血樣本中的肺癌CTC要經(jīng)過右心系統(tǒng)、肺動(dòng)脈、肺循環(huán)毛細(xì)血管網(wǎng)、肺靜脈、左心系統(tǒng)、主動(dòng)脈及其分支系統(tǒng)、體循環(huán)毛細(xì)血管網(wǎng)和體靜脈系統(tǒng)，其間要經(jīng)過兩個(gè)毛細(xì)血管網(wǎng)；而外周動(dòng)脈血樣本中的肺癌CTC則避開了體循環(huán)毛細(xì)血管網(wǎng)和體靜脈系統(tǒng)。如果肺癌CTC自肺靜脈入血，則外周靜脈血樣本中的肺癌CTC雖然避開了肺循環(huán)毛細(xì)血管網(wǎng)，但也要經(jīng)過左心系統(tǒng)、主動(dòng)脈及其分支系統(tǒng)、體循環(huán)毛細(xì)血管網(wǎng)和體靜脈系統(tǒng)，其間也要經(jīng)過一個(gè)毛細(xì)血管網(wǎng)；而外周動(dòng)脈血樣本的肺癌CTC則只經(jīng)過左心系統(tǒng)和主動(dòng)脈及其分支，完全避開了肺循環(huán)和體循環(huán)的兩個(gè)毛細(xì)血管網(wǎng)和體靜脈系統(tǒng)。從上可見，外周動(dòng)脈血的肺癌CTC所受的損耗顯然應(yīng)該比外周靜脈血的肺癌CTC少得多。也許，這就是肺癌患者外周動(dòng)脈血CTC含量明顯高于外周靜脈血CTC含量的主要機(jī)理。

鑒于這一機(jī)理，對于肺癌來說，采集肺靜脈血送檢CTC以提高肺癌CTC檢出率和陽性率可能是最有效的方法，因?yàn)槲ㄒ坏姆戊o脈可接受整葉肺的腫瘤細(xì)胞入血，且不需要經(jīng)過漫長的血液循環(huán)和任何毛細(xì)血管網(wǎng)。Reddy等[12]為了證實(shí)早期肺癌CTC的存在，對32例原發(fā)肺癌在肺切除前抽取肺靜脈血檢測CTC，結(jié)果顯示其CTC檢出率達(dá)62.5%(20/32)，且其含量顯著高于外周靜脈血。但是，肺靜脈血標(biāo)本只有在開胸手術(shù)的情況下才能采集，多為一次性。這是一種技術(shù)復(fù)雜、創(chuàng)傷較大、風(fēng)險(xiǎn)較高的非常規(guī)方法。為了診斷早期肺癌而去開胸采集肺靜脈血顯然是不現(xiàn)實(shí)的，它不適用于肺癌的早期診斷篩查和治療后病情轉(zhuǎn)歸的隨訪。而采集外周動(dòng)脈血(如橈動(dòng)脈血、股動(dòng)脈血等)卻要簡單的多，一般患者都能接受，適用于肺癌的早期診斷的多次篩查，也適用于治療后病情轉(zhuǎn)歸的反復(fù)多次隨訪檢測，和采集外周靜脈血一樣，是一種技術(shù)簡單、創(chuàng)傷很小、風(fēng)險(xiǎn)很低、更有效，便于推廣的常規(guī)方法。

綜上所述，肺癌外周靜脈血CTC的稀有性導(dǎo)致其CTC的低檢測率和低陽性率，而外周動(dòng)脈血CTC含量顯著高于外周靜脈血，檢測外周動(dòng)脈血CTC，使其CTC檢出率和陽性率顯著提升，有利于肺癌的早期診斷和肺癌治療后療效觀察及轉(zhuǎn)歸隨訪。