長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因3在肺腺癌組織中的表達及其臨床意義

孫學峰 黃同海 丁培堃 王光鎖

臨床中，肺腺癌為非小細胞肺癌的常見類型，其臨床治療主要以手術和化療治療為主，但因其早期癥狀較為隱匿，導致部分患者就診時已為中晚期，往往預后較差[1]。因此，探究肺腺癌的分子生物學機制意義重大。長鏈非編碼RNA(lncRNA)為不編碼蛋白質RNA，其普遍表達于真核細胞中，可在多個層面上調控基因表達[2]。小核仁RNA宿主基因3(SNHG3)為lncRNA的一種，其發(fā)揮重要調控作用[3]。既往研究報道，直腸癌組織中SNHG3呈高表達，其表達量越高，患者預后越差[4]，但目前臨床對于SNHG3與肺腺癌的關系研究報道較少。本課題組前期通過lncRNA表達譜芯片發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中LncRNA SNHG3的表達顯著高于癌旁組織，為探討LncRNA SNHG3對肺腺癌的生物學意義，本研究對收治的120例肺腺癌患者進行研究，現(xiàn)將結果報道如下。

資料與方法

一、材料

收集2017年1月至2019年12月于我院就診的120例肺腺癌患者術后癌組織，均經(jīng)手術病理確診，同時收集癌旁組織，距癌組織邊緣≥2 cm，將新鮮組織樣本經(jīng)液氮冷凍，保存于-80 ℃冰箱中待用。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批，患者均知情同意。人肺癌細胞株GLC-82購自上海中喬新舟生物科技有限公司，細胞生長于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱為37 ℃、5% CO2。

二、方法

1 樣本中SNHG3的檢測

取5 mm3組織樣本，按照RNA試劑盒(生產廠家：美國Invitrogen公司)說明書提取樣本中總RNA，采用紫外分光光度計(生產廠家：美國ABI公司)測得吸光度A260/A280為1.9～2.0。按照逆轉錄試劑盒(生產廠家：美國Invitrogen公司)說明書進行逆轉錄操作，反應體系20 μL，反應條件：16 ℃ 15 min，42 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s。采用7 500型實時定量聚合酶鏈反應儀(生產廠家：美國ABI公司)進行實時定量聚合酶鏈反應，反應體系25 μL，反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。lncRNA SNHG3引物由上海生工生物工程公司合成，以U6為內參。lncRNA SNHG3的相對表達量為2-ΔΔCt值(lncRNA SNHG3)-2-ΔΔCt值(U6)。

2 小干擾RNA瞬時轉染

本實驗分為未干擾組和干擾組。未干擾組的GLC-82細胞不進行任何處理；干擾組采用小干擾RNA(siRNA)技術干擾SNHG3的表達，SNHG3 siRNA(si-SNHG3)由上海生物工程公司合成。取GLC-82細胞(對數(shù)生長期)制作單細胞懸液，分別接種于96孔板，置于培養(yǎng)箱內(37 ℃ 5% CO2)，當細胞達45%融合時轉染，轉染試劑盒購于美國Signagen公司。配置小干擾RNA復合物，滴加至培養(yǎng)基中并充分混勻，轉染48 h后收集GLC-82細胞。

3 噻唑藍(MTT)實驗

GLC-82轉染si-SNHG3后接種于96孔板，每孔200 μL，細胞數(shù)103個，置于培養(yǎng)箱內(37 ℃ 5% CO2)，當細胞達75%融合。重新更換培養(yǎng)基后加入20 μL的5% MTT溶液，培養(yǎng)4 h后吸出孔內培養(yǎng)液，再加入150 μL二甲基亞砜，低速震蕩，充分溶解結晶物。采用全自動酶聯(lián)免疫檢測儀(生產廠家：華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司)于490 nm波長處測量吸光度值。

4 Transwell實驗

選取轉染后GLC-82細胞，將細胞密度調至4×108/L，取100 μL細胞懸液加入Transwell小室，將500 μL的10%胎牛血清培養(yǎng)基加入下室，置于培養(yǎng)箱內(37 ℃ 5% CO2)，經(jīng)固定、染色后，于200倍顯微鏡下隨機取3個視野計數(shù)。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、組織樣本中l(wèi)ncRNA SNHG3的相對表達量分析

檢測結果顯示，肺腺癌組織樣本中l(wèi)ncRNA SNHG3的相對表達量(126.83±13.49)明顯高于癌旁組織(69.15±9.43)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=38.389，P<0.001)。

二、lncRNA SNHG3的表達與肺腺癌患者臨床特征關系

發(fā)生淋巴結轉移、臨床分期高、腫瘤直徑≥5 cm的肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3的相對表達量越高(P<0.05)(見表1)。

表1 lncRNA SNHG3的表達與肺腺癌患者臨床特征關系

三、干擾SNHG3的表達對肺腺癌細胞抑制情況分析

利用RNA干擾技術對SNHG3的表達進行干擾，結果提示，轉染siRNA后SNHG3的表達量明顯低于未干擾組(P<0.05)。MTT實驗結果顯示：與對照組比較，肺腺癌GLC-82細胞增殖能力明顯降低(P<0.05)。Transwell實驗結果顯示，與對照組比較，肺腺癌 GLC-82細胞侵襲能力明顯降低(P<0.05)。

討 論

肺腺癌為非小細胞肺癌的常見類型，其臨床致死率較高，該病的發(fā)生進展過程中伴隨一系列調控細胞周期、生長、凋亡的基因功能紊亂[5-7]。因此，探究肺腺癌的分子生物學機制對改善患者預后意義重大。有研究報道，包括lncRNAs、微小RNA(miR)、小核仁RNA宿主基因(SNHGs)在內的ncRNAs與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關[8-9]。據(jù)報道，IncRNAs可通過影響腫瘤細胞增殖、遷移、抵抗凋亡、逃避生長抑制因子等方式參與腫瘤的發(fā)生進展[10-11]。最近有研究顯示，SNHGs在肺腺癌組織中表達異常，且與肺腺癌的發(fā)病及患者預后有關[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織樣本中IncRNA SNHG3的相對表達量明顯高于癌旁組織，表明IncRNA SNHG3在肺腺癌組織中呈高表達，可能與肺腺癌的發(fā)病有關。張婷[13]研究報道，SNHG3在肝癌組織中的表達明顯高于正常肝臟組織，且SNHG3高表達的肝癌患者預后較差。以上研究結果提示，SNHG3在惡性腫瘤中表達異常，可能是惡性腫瘤的一個潛在治療靶點。

有學者研究報道，lncRNA SNHG3在結直腸癌中呈高表達，且與結直腸癌的惡性發(fā)展有關[14]。張子龍等[15]學者研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3表達顯著上調，且其表達量越高患者生存期越短。通過分析肺腺癌組織中 SNHG3的表達與患者臨床特征的關系，結果提示發(fā)生淋巴結轉移、臨床分期高、腫瘤直徑≥5cm的肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3的相對表達量越高。這說明SNHG3與肺腺癌的發(fā)生進展有關，其可能在肺腺癌中發(fā)揮促癌作用。由于lncRNA SNHG3表達上調能夠促進肺腺癌的惡性轉化，其可能是肺腺癌的潛在生物學標志物。因此，檢測肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3可在一定程度上提示肺腺癌病情發(fā)展程度，在肺腺癌早期診療及預后評估中均具有重要價值。

基于上述臨床標本研究結果，本研究進行了體外細胞實驗，結果發(fā)現(xiàn)，轉染siRNA后SNHG3的表達量明顯低于未干擾組。MTT實驗結果顯示：與對照組比較，肺腺癌GLC-82細胞增殖能力明顯降低。Transwell實驗結果顯示，與對照組比較，肺腺癌 GLC-82細胞侵襲能力明顯降低。上調NBAT3基因的表達可增強肺腺癌 GLC-82細胞的增殖活力,促進細胞侵襲。仝偉兵等[16]學者研究發(fā)現(xiàn)，干擾SNHG12的表達，可抑制 HepG2細胞的生長及侵襲，SNHG12參與了肝癌的發(fā)病過程。

綜上所述，肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3呈高表達，其可能參與了肺腺癌的發(fā)生進展，其在肺腺癌中可能發(fā)揮促癌作用，過表達的lncRNA SNHG3可抑制肺腺癌細胞增殖及侵襲，可能成為肺腺癌潛在的治療靶點。但本研究也存在諸多不足，如細胞實驗深度不夠、缺少FISH實驗證實SNHG3基因的高表達、研究樣本量不夠大等，今后會加大相關樣本量收集，深入探討SNHG3調控肺腺癌發(fā)生進展的機制。