長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因3在肺腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

孫學(xué)峰 黃同海 丁培堃 王光鎖

臨床中，肺腺癌為非小細(xì)胞肺癌的常見類型，其臨床治療主要以手術(shù)和化療治療為主，但因其早期癥狀較為隱匿，導(dǎo)致部分患者就診時(shí)已為中晚期，往往預(yù)后較差[1]。因此，探究肺腺癌的分子生物學(xué)機(jī)制意義重大。長鏈非編碼RNA(lncRNA)為不編碼蛋白質(zhì)RNA，其普遍表達(dá)于真核細(xì)胞中，可在多個(gè)層面上調(diào)控基因表達(dá)[2]。小核仁RNA宿主基因3(SNHG3)為lncRNA的一種，其發(fā)揮重要調(diào)控作用[3]。既往研究報(bào)道，直腸癌組織中SNHG3呈高表達(dá)，其表達(dá)量越高，患者預(yù)后越差[4]，但目前臨床對(duì)于SNHG3與肺腺癌的關(guān)系研究報(bào)道較少。本課題組前期通過lncRNA表達(dá)譜芯片發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中LncRNA SNHG3的表達(dá)顯著高于癌旁組織，為探討LncRNA SNHG3對(duì)肺腺癌的生物學(xué)意義，本研究對(duì)收治的120例肺腺癌患者進(jìn)行研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

資料與方法

一、材料

收集2017年1月至2019年12月于我院就診的120例肺腺癌患者術(shù)后癌組織，均經(jīng)手術(shù)病理確診，同時(shí)收集癌旁組織，距癌組織邊緣≥2 cm，將新鮮組織樣本經(jīng)液氮冷凍，保存于-80 ℃冰箱中待用。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，患者均知情同意。人肺癌細(xì)胞株GLC-82購自上海中喬新舟生物科技有限公司，細(xì)胞生長于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱為37 ℃、5% CO2。

二、方法

1 樣本中SNHG3的檢測

取5 mm3組織樣本，按照RNA試劑盒(生產(chǎn)廠家：美國Invitrogen公司)說明書提取樣本中總RNA，采用紫外分光光度計(jì)(生產(chǎn)廠家：美國ABI公司)測得吸光度A260/A280為1.9～2.0。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(生產(chǎn)廠家：美國Invitrogen公司)說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：16 ℃ 15 min，42 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s。采用7 500型實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)儀(生產(chǎn)廠家：美國ABI公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)，反應(yīng)體系25 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。lncRNA SNHG3引物由上海生工生物工程公司合成，以U6為內(nèi)參。lncRNA SNHG3的相對(duì)表達(dá)量為2-ΔΔCt值(lncRNA SNHG3)-2-ΔΔCt值(U6)。

2 小干擾RNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

本實(shí)驗(yàn)分為未干擾組和干擾組。未干擾組的GLC-82細(xì)胞不進(jìn)行任何處理；干擾組采用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)干擾SNHG3的表達(dá)，SNHG3 siRNA(si-SNHG3)由上海生物工程公司合成。取GLC-82細(xì)胞(對(duì)數(shù)生長期)制作單細(xì)胞懸液，分別接種于96孔板，置于培養(yǎng)箱內(nèi)(37 ℃ 5% CO2)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)45%融合時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑盒購于美國Signagen公司。配置小干擾RNA復(fù)合物，滴加至培養(yǎng)基中并充分混勻，轉(zhuǎn)染48 h后收集GLC-82細(xì)胞。

3 噻唑藍(lán)(MTT)實(shí)驗(yàn)

GLC-82轉(zhuǎn)染si-SNHG3后接種于96孔板，每孔200 μL，細(xì)胞數(shù)103個(gè)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)(37 ℃ 5% CO2)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)75%融合。重新更換培養(yǎng)基后加入20 μL的5% MTT溶液，培養(yǎng)4 h后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，再加入150 μL二甲基亞砜，低速震蕩，充分溶解結(jié)晶物。采用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測儀(生產(chǎn)廠家：華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司)于490 nm波長處測量吸光度值。

4 Transwell實(shí)驗(yàn)

選取轉(zhuǎn)染后GLC-82細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至4×108/L，取100 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室，將500 μL的10%胎牛血清培養(yǎng)基加入下室，置于培養(yǎng)箱內(nèi)(37 ℃ 5% CO2)，經(jīng)固定、染色后，于200倍顯微鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野計(jì)數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、組織樣本中l(wèi)ncRNA SNHG3的相對(duì)表達(dá)量分析

檢測結(jié)果顯示，肺腺癌組織樣本中l(wèi)ncRNA SNHG3的相對(duì)表達(dá)量(126.83±13.49)明顯高于癌旁組織(69.15±9.43)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=38.389，P<0.001)。

二、lncRNA SNHG3的表達(dá)與肺腺癌患者臨床特征關(guān)系

發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期高、腫瘤直徑≥5 cm的肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3的相對(duì)表達(dá)量越高(P<0.05)(見表1)。

表1 lncRNA SNHG3的表達(dá)與肺腺癌患者臨床特征關(guān)系

三、干擾SNHG3的表達(dá)對(duì)肺腺癌細(xì)胞抑制情況分析

利用RNA干擾技術(shù)對(duì)SNHG3的表達(dá)進(jìn)行干擾，結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染siRNA后SNHG3的表達(dá)量明顯低于未干擾組(P<0.05)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，肺腺癌GLC-82細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，肺腺癌 GLC-82細(xì)胞侵襲能力明顯降低(P<0.05)。

討 論

肺腺癌為非小細(xì)胞肺癌的常見類型，其臨床致死率較高，該病的發(fā)生進(jìn)展過程中伴隨一系列調(diào)控細(xì)胞周期、生長、凋亡的基因功能紊亂[5-7]。因此，探究肺腺癌的分子生物學(xué)機(jī)制對(duì)改善患者預(yù)后意義重大。有研究報(bào)道，包括lncRNAs、微小RNA(miR)、小核仁RNA宿主基因(SNHGs)在內(nèi)的ncRNAs與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[8-9]。據(jù)報(bào)道，IncRNAs可通過影響腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、抵抗凋亡、逃避生長抑制因子等方式參與腫瘤的發(fā)生進(jìn)展[10-11]。最近有研究顯示，SNHGs在肺腺癌組織中表達(dá)異常，且與肺腺癌的發(fā)病及患者預(yù)后有關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織樣本中IncRNA SNHG3的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織，表明IncRNA SNHG3在肺腺癌組織中呈高表達(dá)，可能與肺腺癌的發(fā)病有關(guān)。張婷[13]研究報(bào)道，SNHG3在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于正常肝臟組織，且SNHG3高表達(dá)的肝癌患者預(yù)后較差。以上研究結(jié)果提示，SNHG3在惡性腫瘤中表達(dá)異常，可能是惡性腫瘤的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。

有學(xué)者研究報(bào)道，lncRNA SNHG3在結(jié)直腸癌中呈高表達(dá)，且與結(jié)直腸癌的惡性發(fā)展有關(guān)[14]。張子龍等[15]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3表達(dá)顯著上調(diào)，且其表達(dá)量越高患者生存期越短。通過分析肺腺癌組織中 SNHG3的表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系，結(jié)果提示發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期高、腫瘤直徑≥5cm的肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3的相對(duì)表達(dá)量越高。這說明SNHG3與肺腺癌的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)，其可能在肺腺癌中發(fā)揮促癌作用。由于lncRNA SNHG3表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)肺腺癌的惡性轉(zhuǎn)化，其可能是肺腺癌的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。因此，檢測肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3可在一定程度上提示肺腺癌病情發(fā)展程度，在肺腺癌早期診療及預(yù)后評(píng)估中均具有重要價(jià)值。

基于上述臨床標(biāo)本研究結(jié)果，本研究進(jìn)行了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA后SNHG3的表達(dá)量明顯低于未干擾組。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，肺腺癌GLC-82細(xì)胞增殖能力明顯降低。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，肺腺癌 GLC-82細(xì)胞侵襲能力明顯降低。上調(diào)NBAT3基因的表達(dá)可增強(qiáng)肺腺癌 GLC-82細(xì)胞的增殖活力,促進(jìn)細(xì)胞侵襲。仝偉兵等[16]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，干擾SNHG12的表達(dá)，可抑制 HepG2細(xì)胞的生長及侵襲，SNHG12參與了肝癌的發(fā)病過程。

綜上所述，肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3呈高表達(dá)，其可能參與了肺腺癌的發(fā)生進(jìn)展，其在肺腺癌中可能發(fā)揮促癌作用，過表達(dá)的lncRNA SNHG3可抑制肺腺癌細(xì)胞增殖及侵襲，可能成為肺腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。但本研究也存在諸多不足，如細(xì)胞實(shí)驗(yàn)深度不夠、缺少FISH實(shí)驗(yàn)證實(shí)SNHG3基因的高表達(dá)、研究樣本量不夠大等，今后會(huì)加大相關(guān)樣本量收集，深入探討SNHG3調(diào)控肺腺癌發(fā)生進(jìn)展的機(jī)制。