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    長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因3在肺腺癌組織中的表達及其臨床意義

    2021-03-31 07:41:50孫學峰黃同海丁培堃王光鎖
    臨床肺科雜志 2021年4期
    關鍵詞:實驗研究

    孫學峰 黃同海 丁培堃 王光鎖

    臨床中,肺腺癌為非小細胞肺癌的常見類型,其臨床治療主要以手術和化療治療為主,但因其早期癥狀較為隱匿,導致部分患者就診時已為中晚期,往往預后較差[1]。因此,探究肺腺癌的分子生物學機制意義重大。長鏈非編碼RNA(lncRNA)為不編碼蛋白質RNA,其普遍表達于真核細胞中,可在多個層面上調控基因表達[2]。小核仁RNA宿主基因3(SNHG3)為lncRNA的一種,其發(fā)揮重要調控作用[3]。既往研究報道,直腸癌組織中SNHG3呈高表達,其表達量越高,患者預后越差[4],但目前臨床對于SNHG3與肺腺癌的關系研究報道較少。本課題組前期通過lncRNA表達譜芯片發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中LncRNA SNHG3的表達顯著高于癌旁組織,為探討LncRNA SNHG3對肺腺癌的生物學意義,本研究對收治的120例肺腺癌患者進行研究,現(xiàn)將結果報道如下。

    資料與方法

    一、材料

    收集2017年1月至2019年12月于我院就診的120例肺腺癌患者術后癌組織,均經(jīng)手術病理確診,同時收集癌旁組織,距癌組織邊緣≥2 cm,將新鮮組織樣本經(jīng)液氮冷凍,保存于-80 ℃冰箱中待用。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批,患者均知情同意。人肺癌細胞株GLC-82購自上海中喬新舟生物科技有限公司,細胞生長于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,培養(yǎng)箱為37 ℃、5% CO2。

    二、方法

    1 樣本中SNHG3的檢測

    取5 mm3組織樣本,按照RNA試劑盒(生產廠家:美國Invitrogen公司)說明書提取樣本中總RNA,采用紫外分光光度計(生產廠家:美國ABI公司)測得吸光度A260/A280為1.9~2.0。按照逆轉錄試劑盒(生產廠家:美國Invitrogen公司)說明書進行逆轉錄操作,反應體系20 μL,反應條件:16 ℃ 15 min,42 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s。采用7 500型實時定量聚合酶鏈反應儀(生產廠家:美國ABI公司)進行實時定量聚合酶鏈反應,反應體系25 μL,反應條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 15 s,40個循環(huán)。lncRNA SNHG3引物由上海生工生物工程公司合成,以U6為內參。lncRNA SNHG3的相對表達量為2-ΔΔCt值(lncRNA SNHG3)-2-ΔΔCt值(U6)。

    2 小干擾RNA瞬時轉染

    本實驗分為未干擾組和干擾組。未干擾組的GLC-82細胞不進行任何處理;干擾組采用小干擾RNA(siRNA)技術干擾SNHG3的表達,SNHG3 siRNA(si-SNHG3)由上海生物工程公司合成。取GLC-82細胞(對數(shù)生長期)制作單細胞懸液,分別接種于96孔板,置于培養(yǎng)箱內(37 ℃ 5% CO2),當細胞達45%融合時轉染,轉染試劑盒購于美國Signagen公司。配置小干擾RNA復合物,滴加至培養(yǎng)基中并充分混勻,轉染48 h后收集GLC-82細胞。

    3 噻唑藍(MTT)實驗

    GLC-82轉染si-SNHG3后接種于96孔板,每孔200 μL,細胞數(shù)103個,置于培養(yǎng)箱內(37 ℃ 5% CO2),當細胞達75%融合。重新更換培養(yǎng)基后加入20 μL的5% MTT溶液,培養(yǎng)4 h后吸出孔內培養(yǎng)液,再加入150 μL二甲基亞砜,低速震蕩,充分溶解結晶物。采用全自動酶聯(lián)免疫檢測儀(生產廠家:華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司)于490 nm波長處測量吸光度值。

    4 Transwell實驗

    選取轉染后GLC-82細胞,將細胞密度調至4×108/L,取100 μL細胞懸液加入Transwell小室,將500 μL的10%胎牛血清培養(yǎng)基加入下室,置于培養(yǎng)箱內(37 ℃ 5% CO2),經(jīng)固定、染色后,于200倍顯微鏡下隨機取3個視野計數(shù)。

    三、統(tǒng)計學分析

    結 果

    一、組織樣本中l(wèi)ncRNA SNHG3的相對表達量分析

    檢測結果顯示,肺腺癌組織樣本中l(wèi)ncRNA SNHG3的相對表達量(126.83±13.49)明顯高于癌旁組織(69.15±9.43),差異具有統(tǒng)計學意義(t=38.389,P<0.001)。

    二、lncRNA SNHG3的表達與肺腺癌患者臨床特征關系

    發(fā)生淋巴結轉移、臨床分期高、腫瘤直徑≥5 cm的肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3的相對表達量越高(P<0.05)(見表1)。

    表1 lncRNA SNHG3的表達與肺腺癌患者臨床特征關系

    三、干擾SNHG3的表達對肺腺癌細胞抑制情況分析

    利用RNA干擾技術對SNHG3的表達進行干擾,結果提示,轉染siRNA后SNHG3的表達量明顯低于未干擾組(P<0.05)。MTT實驗結果顯示:與對照組比較,肺腺癌GLC-82細胞增殖能力明顯降低(P<0.05)。Transwell實驗結果顯示,與對照組比較,肺腺癌 GLC-82細胞侵襲能力明顯降低(P<0.05)。

    討 論

    肺腺癌為非小細胞肺癌的常見類型,其臨床致死率較高,該病的發(fā)生進展過程中伴隨一系列調控細胞周期、生長、凋亡的基因功能紊亂[5-7]。因此,探究肺腺癌的分子生物學機制對改善患者預后意義重大。有研究報道,包括lncRNAs、微小RNA(miR)、小核仁RNA宿主基因(SNHGs)在內的ncRNAs與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關[8-9]。據(jù)報道,IncRNAs可通過影響腫瘤細胞增殖、遷移、抵抗凋亡、逃避生長抑制因子等方式參與腫瘤的發(fā)生進展[10-11]。最近有研究顯示,SNHGs在肺腺癌組織中表達異常,且與肺腺癌的發(fā)病及患者預后有關[12]。本研究發(fā)現(xiàn),肺腺癌組織樣本中IncRNA SNHG3的相對表達量明顯高于癌旁組織,表明IncRNA SNHG3在肺腺癌組織中呈高表達,可能與肺腺癌的發(fā)病有關。張婷[13]研究報道,SNHG3在肝癌組織中的表達明顯高于正常肝臟組織,且SNHG3高表達的肝癌患者預后較差。以上研究結果提示,SNHG3在惡性腫瘤中表達異常,可能是惡性腫瘤的一個潛在治療靶點。

    有學者研究報道,lncRNA SNHG3在結直腸癌中呈高表達,且與結直腸癌的惡性發(fā)展有關[14]。張子龍等[15]學者研究發(fā)現(xiàn),胃癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3表達顯著上調,且其表達量越高患者生存期越短。通過分析肺腺癌組織中 SNHG3的表達與患者臨床特征的關系,結果提示發(fā)生淋巴結轉移、臨床分期高、腫瘤直徑≥5cm的肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3的相對表達量越高。這說明SNHG3與肺腺癌的發(fā)生進展有關,其可能在肺腺癌中發(fā)揮促癌作用。由于lncRNA SNHG3表達上調能夠促進肺腺癌的惡性轉化,其可能是肺腺癌的潛在生物學標志物。因此,檢測肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3可在一定程度上提示肺腺癌病情發(fā)展程度,在肺腺癌早期診療及預后評估中均具有重要價值。

    基于上述臨床標本研究結果,本研究進行了體外細胞實驗,結果發(fā)現(xiàn),轉染siRNA后SNHG3的表達量明顯低于未干擾組。MTT實驗結果顯示:與對照組比較,肺腺癌GLC-82細胞增殖能力明顯降低。Transwell實驗結果顯示,與對照組比較,肺腺癌 GLC-82細胞侵襲能力明顯降低。上調NBAT3基因的表達可增強肺腺癌 GLC-82細胞的增殖活力,促進細胞侵襲。仝偉兵等[16]學者研究發(fā)現(xiàn),干擾SNHG12的表達,可抑制 HepG2細胞的生長及侵襲,SNHG12參與了肝癌的發(fā)病過程。

    綜上所述,肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3呈高表達,其可能參與了肺腺癌的發(fā)生進展,其在肺腺癌中可能發(fā)揮促癌作用,過表達的lncRNA SNHG3可抑制肺腺癌細胞增殖及侵襲,可能成為肺腺癌潛在的治療靶點。但本研究也存在諸多不足,如細胞實驗深度不夠、缺少FISH實驗證實SNHG3基因的高表達、研究樣本量不夠大等,今后會加大相關樣本量收集,深入探討SNHG3調控肺腺癌發(fā)生進展的機制。

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