LncRNA CASC7與miR-27b-3p在肺結(jié)核外周血單核細胞中的表達及意義

肖歡容 王少鋒 蔡志鋼

肺結(jié)核是我國臨床常見的一種慢性傳染病，其主要病因為結(jié)核分枝桿菌，且已嚴(yán)重威脅人類身體健康，因而尋找肺結(jié)核相關(guān)基因及快速診斷對提高肺結(jié)核治療效果具有重要意義[1]。單核細胞在機體免疫及免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用，并可作為感染防御中的第一道防線，其可通過清除結(jié)核分枝桿菌從而發(fā)揮作用[2]。長鏈非編碼RNA在肺結(jié)核患者中異常表達并可能作為診斷肺結(jié)核的重要輔助標(biāo)志物[3-4]。長鏈非編碼RNA CASC7(LncRNA CASC7)在缺血再灌注損傷大鼠中表達水平降低，上調(diào)其表達可抑制神經(jīng)元細胞凋亡[5]。生物信息學(xué)分析顯示微小RNA-27b-3p(miR-27b-3p)可能是CASC7的靶基因，研究表明miR-27b通過下調(diào)TET2表達而促進ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)及細胞凋亡[6]。但CASC7是否通過調(diào)控miR-27b-3p的表達從而參與肺結(jié)核發(fā)生過程尚未闡明。因此，本研究主要探討CASC7與miR-27b-3p在肺結(jié)核外周血單核細胞中的表達及其意義。

資料與方法

一、一般資料

選取2018年3月至2019年10月本院收治的肺結(jié)核患者120例為研究組，所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會《臨床診療指南:呼吸病學(xué)分冊》相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。經(jīng)痰涂片檢查顯示均為陽性，且肺部無其他細菌、真菌及病毒感染，患者均無合并心、肝、腎等臟器疾病，其中男70例，女50例，年齡48～75歲，平均年齡(59.63±8.59)歲。根據(jù)活動性肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)將肺結(jié)核患者分為非活動性肺結(jié)核組60例、活動性肺結(jié)核組60例[8]，其中活動性肺結(jié)核患者治療方案為2HREZ/4HR。同時選取同期健康體檢者60例為對照組，其中男30例，女30例，年齡50～70歲，平均年齡(60.21±9.25)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并自身免疫性疾?。缓喜⒛[瘤患者。各組研究對象年齡(t=0.416，P=0.678)、性別(=1.125，P=0.289)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者知情且簽署同意書。

二、主要試劑及儀器

Trizol試劑、Lipofectamine2000購自美國Invotrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；miR-27b-3p寡核苷酸模擬物(miR-27b-3p mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、CASC7小分子干擾RNA(si-CASC7)、亂序無意義陰性序列(si-NC)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；pcDNA3.1購自上海索寶生物科技有限公司；熒光素酶報告基因載體及其活性檢測試劑盒購自美國Promega公司；結(jié)核菌強毒株H37Rv與弱毒株H37Ra購自美國ATCC公司；CD14+免疫磁珠購自德國Miltenyi公司；7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；MACS自動磁珠分選儀購自上海秉新生物科技有限公司。

三、方法

1 分離外周血單核細胞

分別抽取所有研究對象外周血5 mL，采用肝素鋰抗凝，應(yīng)用密度梯度離心法分離外周血單核細胞，細胞計數(shù)(1×107個/mL)，加入CD14+免疫磁珠(5 μL)，置于4 ℃冰箱內(nèi)孵育20 min，應(yīng)用MACS自動磁珠分選儀分離CD14+單核細胞。

2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測CASC7與miR-27b-3p的表達水平

采用Trizol法提取單核細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照試劑盒說明書進行qRT-PCR反應(yīng)，用2-ΔΔCt法計算CASC7與miR-27b-3p相對表達量。

3 體外驗證實驗[9]

H37Rv、H37Ra分別感染單核細胞，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育90 min，取出細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，qRT-PCR法檢測CASC7與miR-27b-3p相對表達量。

4 雙熒光素酶報告基因檢測CASC7與miR-27b-3p的靶向關(guān)系

利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點進行突變，將結(jié)合位點與突變位點載入熒光素酶報告基因載體分別構(gòu)建野生型載體WT-CASC7與突變型載體MUT-CASC7，分別將miR-NC、miR-27b-3p mimcs與WT-CASC7、MUT-CASC7共轉(zhuǎn)染至人單核細胞，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，檢測各組熒光素酶活性。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、體外實驗驗證CASC7與miR-27b-3p的表達量

與感染前比較，H37Rv、H37Ra感染后單核細胞中CASC7的表達水平顯著降低(P<0.05)，miR-27b-3p的表達水平顯著升高(P<0.05)(見表1)。

表1 體外實驗驗證CASC7與miR-27b-3p的表達量

二、CASC7靶向調(diào)控miR-27b-3p

LncBase v.2預(yù)測顯示CASC7與miR-27b-3p存在靶向結(jié)合位點(見圖1)。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示miR-27b-3p過表達可明顯抑制野生型載體WT-CASC7的熒光素酶活性(P<0.05)(見表2)。CASC7負(fù)向調(diào)控miR-27b-3p的表達(P<0.05)(見表3)。

圖1 CASC7的序列中含有與miR-27b-3p互補的核苷酸序列

表2 雙熒光素酶報告實驗

表3 CASC7靶向調(diào)控miR-27b-3p的表達

三、肺結(jié)核患者外周血單核細胞中CASC7與miR-27b-3p的表達量

與對照組比較，研究組患者外周血單核細胞中CASC7的表達水平顯著降低(P<0.05)，miR-27b-3p的表達水平顯著升高(P<0.05)(見表4)。

表4 肺結(jié)核患者外周血單核細胞中CASC7與miR-27b-3p的表達量

四、活動性肺結(jié)核與非活動性肺結(jié)核患者外周血單核細胞中CASC7與miR-27b-3p的表達量

與非活動性肺結(jié)核組比較，活動性肺結(jié)核組患者外周血單核細胞中CASC7的表達水平顯著降低(P<0.05)，miR-27b-3p的表達水平顯著升高(P<0.05)(見表5)。

表5 活動性肺結(jié)核與非活動性肺結(jié)核患者外周血單核細胞中CASC7與miR-27b-3p的表達量

五、ROC分析CASC7與miR-27b-3p對肺結(jié)核的診斷價值

ROC分析CASC7與miR-27b-3p對肺結(jié)核的診斷價值，結(jié)果顯示CASC7診斷時敏感度為57.50%，特異度為91.67%，AUC面積為0.781，95%CI：0.713-0.839，截斷值為0.85；miR-27b-3p診斷時敏感度為57.50%，特異度為81.67%，AUC面積為0.665，95%CI：0.591～0.733，截斷值為1.08；聯(lián)合檢測時敏感度為96.67%，特異度為60.00%，AUC面積為0.802，95%CI：0.736～0.858，截斷值為0.51(見圖2)。

圖2 ROC分析CASC7與miR-27b-3p對肺結(jié)核的診斷價值

討 論

CASC7可通過調(diào)節(jié)miR-21的表達而抑制心肌缺血再灌注大鼠的心肌細胞凋亡[10]。CASC7通過靶向miR-21而抑制PI3K / AKT信號通路從而增強嚴(yán)重哮喘患者糖皮質(zhì)激素的敏感性[11]。CASC7還可在神經(jīng)母細胞瘤等腫瘤中異常表達，并可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程[12]。本研究結(jié)果顯示肺結(jié)核患者外周血單核細胞中CASC7的表達水平降低，提示CASC7在肺結(jié)核發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。進一步研究顯示活動性肺結(jié)核組患者外周血單核細胞中CASC7的表達水平低于非活動性肺結(jié)核組，提示CASC7水平高低可能用于判斷肺結(jié)核疾病嚴(yán)重程度或疾病進展。同時本研究采用ROC分析CASC7對肺結(jié)核的診斷價值，結(jié)果顯示敏感度與特異度較高，提示CASC7對肺結(jié)核具有一定診斷價值。但單項檢測具有一定假陽性或假陰性，而兩項或多項聯(lián)合檢測可提高診斷效率。

本研究結(jié)果顯示肺結(jié)核患者外周血單核細胞中miR-27b-3p的表達水平升高，進一步分析顯示活動性肺結(jié)核患者外周血單核細胞中miR-27b-3p的表達水平高于非活動性肺結(jié)核患者。miR-27b-3p在急性缺血性卒中患者中表達水平升高，并可能作為診斷急性缺血性卒中的生物標(biāo)志物[13]。miR-27b-3p過表達可減輕心房纖維化[14]。miR-27b-3p通過靶向HIPK2而抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的軟骨細胞凋亡[15]。表明miR-27b-3p在炎癥性疾病中高表達，并可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果提示miR-27b-3p在肺結(jié)核發(fā)生及發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。進一步分析顯示CASC7與miR-27b-3p聯(lián)合檢測可明顯提高敏感度。目前關(guān)于CASC7與miR-27b-3p在肺結(jié)核發(fā)生及發(fā)展過程中作用機制尚未見相關(guān)報道，本研究通過體外實驗證實H37Rv、H37Ra菌株可明顯抑制CASC7的表達及促進miR-27b-3p的表達，分析原因可能是單核細胞在結(jié)核菌感染過程中發(fā)揮重要作用，而肺結(jié)核患者單核細胞中CASC7、miR-27b-3p分子的差異表達，可準(zhǔn)確反映單核細胞感染結(jié)核菌后機體出現(xiàn)免疫應(yīng)答反應(yīng)，因而CASC7、miR-27b-3p可能作為診斷肺結(jié)核的潛在生物標(biāo)記，并可能作為肺結(jié)核靶向治療的潛在靶點。同時本研究采用雙熒光素酶報告實驗與qRT-PCR實驗證實CASC7可靶向結(jié)合miR-27b-3p，并可負(fù)向調(diào)控miR-27b-3p的表達。提示CASC7可能通過負(fù)向調(diào)控miR-27b-3p的表達從而參與肺結(jié)核發(fā)生及發(fā)展過程。(過多的描述了本文的研究結(jié)果，而沒有與以往研究進行機理上或者不同疾病中發(fā)揮作用的對比)回復(fù)：CASC7與miR-27b-3p在肺結(jié)核發(fā)生及發(fā)展過程中作用機制撒尚未見相關(guān)報道。

綜上所述，肺結(jié)核外周血單核細胞中CASC7的表達水平降低，miR-27b-3p的表達水平升高，二者聯(lián)合檢測可提高肺結(jié)核診斷效率，CASC7可能作為肺結(jié)核治療的潛在靶點，但關(guān)于CASC7在肺結(jié)核患者體內(nèi)表達降低是否與細胞凋亡有關(guān)，及其具體作用機制仍需深入探究。