丹參提取物對(duì)放射性肺損傷大鼠的保護(hù)作用研究

陳巖巖 周淑娟 夏玉朝 薛曉拉

放射性肺損傷(Radiation-induced Lung Injury，RILI)是乳腺癌、肺癌、食管癌等胸部腫瘤放療中最為普遍和嚴(yán)重的并發(fā)癥。當(dāng)胸部照射劑量超過肺組織閾值時(shí)，會(huì)損傷肺組織，初期主要是炎癥發(fā)生，后期遷延加深會(huì)導(dǎo)致纖維化的發(fā)生[1]。放射性肺炎(RP)是RILI的早期表現(xiàn)，在高劑量照射后的3個(gè)月后即可發(fā)生急性RP；放射性肺纖維化(RF)是RILI的晚期表現(xiàn)，通常在數(shù)個(gè)月或數(shù)年后出現(xiàn)，時(shí)間界限不等。目前，急性RP的發(fā)生率高達(dá)5%～30%。RILI嚴(yán)重影響腫瘤靶區(qū)的照射劑量，減低腫瘤局部控制率，對(duì)腫瘤的放療效果影響巨大，輕則導(dǎo)致放療中斷，嚴(yán)重者可引起肺功能衰竭而死亡[2]。RILI是多種因素綜合調(diào)控的的復(fù)雜過程，西醫(yī)治療效果不甚理想。中醫(yī)認(rèn)為RILI從屬“火熱毒邪”、“燥邪”，總結(jié)其病機(jī)總屬為火熱之邪或燥邪損傷血絡(luò)，耗傷氣陰，火熱蘊(yùn)結(jié)，以養(yǎng)陰、活血及清熱解毒為主要方法[3]。臨床研究證實(shí)[4]， 中藥提取物對(duì)放射所導(dǎo)致的肺損傷具有一定的效果，同時(shí)具有保護(hù)肺組織、滋陰清肺的作用，副作用小。丹參是傳統(tǒng)上治療心血管疾病的主要藥物，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其還具備抗菌、抗炎、抗腫瘤、保護(hù)器官等作用[5]。本次研究就丹參提取物(丹參酮和丹酚酸類)對(duì)放射性肺損傷大鼠的作用進(jìn)行研究和觀察，探討其在預(yù)防及控制放射性肺損傷中的作用機(jī)制報(bào)告如下。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)儀器和材料

HM-MD-I放射治療模擬機(jī)、HM-J-16-I中高能雙光子醫(yī)用電子直線加速器購(gòu)自江蘇海明醫(yī)療器械有限公司；電腦半自動(dòng)石蠟切片機(jī)購(gòu)自浙江金華惠友儀器有限公司；ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)；顯微鏡購(gòu)自上海測(cè)維光電技術(shù)有限公司；賽默飛世爾(Thermo Scientific)酶標(biāo)儀、移液器購(gòu)自上海沃元科技有限公司；TG16臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；生理鹽水、二甲苯、多聚甲醛、無水乙醇、10%水合氯醛購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ELISA試劑盒購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司；丙二醛(MDA)測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

共90只無特定病原體(SPF級(jí))8周齡雄性SD大鼠，體重(195±15)g由省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，由專人負(fù)責(zé)管理。實(shí)驗(yàn)室定期消毒，環(huán)境溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%。飼養(yǎng)1周無異常后開始實(shí)驗(yàn)，所有操作均遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

三、方法

1 分組方法和模型制備 將所有實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組，每組各30只。A組為空白對(duì)照組，不進(jìn)行照射；B組為單純照射組；C組為照射加丹參提取物組。B、C組大鼠取仰臥位，10%水合氯醛麻醉，四肢固定，充分暴露胸部進(jìn)行照射，避免其他部位暴露。照射劑量12Gy，照射范圍為大鼠右側(cè)胸部，包括大鼠前肢兩腋窩中點(diǎn)連線至劍突水平。分別在X線照射4周、8周、12周后各取10只大鼠心臟采血后處死、取材。

2 丹參提取物制備 丹參藥材由醫(yī)院中藥房提供，切斷成片狀后使用75%乙醇回流提取丹參，質(zhì)量比為10 ∶1，提取時(shí)間為15 min，重復(fù)提取3次。合并濾液后得到丹參提取液，減壓回收溶劑得到無醇味浸膏，蒸餾水洗滌10次左右后噴霧干燥，獲得丹參提取物。

3 給藥方法 A、B組大鼠按照體質(zhì)量給予生理鹽水灌胃，標(biāo)準(zhǔn)為1.5 mL/200 g，使用適量鹽水將丹參提取物配比為懸浮液，C組以相同標(biāo)準(zhǔn)給予丹參提取物灌胃。連續(xù)灌胃1周后，B、C組給予X線照射。照射后各組繼續(xù)按上述方法灌胃2周，期間觀察大鼠活動(dòng)情況并按周對(duì)大鼠體質(zhì)量進(jìn)行稱重，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整灌胃劑量。

4 樣本采集和檢測(cè)方法 10%水合氯醛麻醉后心臟穿刺取血5 mL。血液樣本置于肝素抗凝管內(nèi)，3 000 r/min離心分離15 min，取上清液低溫保存，待全部取材后同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)血清學(xué)指標(biāo)[6]：白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子β(TGF-β1)。開胸后清除胸肋骨，使胸腔完全暴露，迅速摘取肺組織，取右上肺組織，0.9%生理鹽水沖洗干凈，10%甲醛溶液固24 h，石蠟包埋，常規(guī)切片后HE染色觀察病理改變。采用ELISA法檢測(cè)S0D含量，硫代巴比妥酸化學(xué)比色法測(cè)定MDA含量。右肺系數(shù)=肺濕重(mg)/體質(zhì)量(g)×100%，肺系數(shù)越高表示肺纖維化程度越高。采用熒光定量PCR檢測(cè)NF-κB水平，提取肺組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。2-△△cT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，引物序列如下： NF-κB p65上游：5′-AACAACACAGACCCAGGAGT-3′，下游：5′-CTGTCACCAGGCGAGTTATAG-3′Ⅲ。

四、觀察指標(biāo)

① 血清學(xué)指標(biāo)：IL-6、TNF-α、TGF-β1；② 大鼠血清SOD活性變化；③ 大鼠右肺系數(shù)；④ 大鼠肺組織MDA含量；⑤ 大鼠肺組織NF-κB p65表達(dá)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、血清學(xué)指標(biāo)變化比較

B組和C組大鼠照射4周、8周、12周后血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平均明顯高于A組(P<0.05)；C組血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平均明顯低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

表1 各組IL-6、TNF-α、TGF-β1表達(dá)變化比較

二、肺組織SOD活性變化比較

B組和C組大鼠照射4周、8周、12周后肺組織SOD活力與A組相較有明顯下降(P<0.05)；C組大鼠各期肺組織SOD活力明顯高于B組(P<0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠肺組織SOD活性變化比較

三、肺組織MDA含量比較

B組和C組大鼠照射4周、8周、12周后肺組織MDA含量與A組相較有明顯提高(P<0.05)；C組大鼠各期肺組織MDA含量明顯低于B組(P<0.05)(見表3)。

表3 各組大鼠肺組織MDA含量比較

四、右肺系數(shù)比較

4周、8周后，與B組比較，C組大鼠右肺系數(shù)比B組有明顯下降(P<0.05)；12周后3組大鼠右肺系數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表4)。

表4 各組大鼠右肺系數(shù)比較

五、肺組織NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量比較

B組和C組大鼠照射4周、8周、12周后肺組織NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量與A組相較有明顯提高(P<0.05)；C組大鼠各期肺組織NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量明顯低于B組(P<0.05)(見表5)。

表5 各組大鼠肺組織NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量比較

討 論

惡性腫瘤的發(fā)病率不斷上升導(dǎo)致越來越多的患者進(jìn)行放射治療，因此帶來的RILI對(duì)患者的健康和生活質(zhì)量的嚴(yán)重影響逐漸獲得重視。關(guān)于RILI的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，其發(fā)生與多種細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α、TGF-β1等密切相關(guān)，因此“細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)”學(xué)說是當(dāng)前比較認(rèn)可的一種學(xué)說。RILI可分為早期RP和晚期RF，晚期RF一旦形成會(huì)造成不可逆的損傷，嚴(yán)重影響患者健康，威脅患者生命。由此可見，預(yù)防和放射前提前用藥干預(yù)比后續(xù)治療效果更佳。

多種研究顯示[7-8]，RILI的發(fā)生是炎性細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，多種細(xì)胞因子共同作用而導(dǎo)致，對(duì)于細(xì)胞IL-6、TNF-α、TGF-β1等多種細(xì)胞因子的研究能夠較好的體現(xiàn)放射性肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展的過程。因此對(duì)于IL-6、TNF-α、TGF-β1的監(jiān)測(cè)對(duì)于RILI具有很好的預(yù)測(cè)作用。西醫(yī)對(duì)于RILI的治療一般給予吸氧、止咳、平喘等對(duì)癥治療，急性期癥狀嚴(yán)重者給予腎上腺皮質(zhì)激素治療，但未能取得很好的治療效果，且無法發(fā)揮預(yù)防作用。在中醫(yī)理論中，RILI應(yīng)屬于肺痿、喘證的范疇，整體表現(xiàn)為骨髓抑制、免疫功能下降、肺組織纖維化，局部表現(xiàn)為喘息、咳嗽、呼吸困難等癥狀[9]。研究證實(shí)[10]，中醫(yī)藥對(duì)于相關(guān)致炎和致纖維化因子的表達(dá)有明顯抑制作用，可減輕放射性肺損傷急性期的炎癥反應(yīng)，延緩放射性肺損傷纖維化的進(jìn)展。本文主要針對(duì)丹參提取物對(duì)放射性肺損傷大鼠的保護(hù)作用展開研究。

丹參是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，味苦，微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰之功?，F(xiàn)代中醫(yī)藥研究表明，丹參具有抗炎、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、減輕細(xì)胞凋亡、促進(jìn)組織修復(fù)與再生，抗纖維化等作用。脂溶性的二萜醌類化合物以及水溶性的酚類成分是丹參主要化學(xué)成分。丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮及其異構(gòu)體為脂溶性成分，原兒茶醛、丹參素、迭香酸、丹參酚酸等為水溶性成分。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在抗纖維化作用方面，丹參對(duì)雞胚絨毛尿囊膜及轉(zhuǎn)基因斑馬魚新生血管的活性具有很好的抑制作用，并且對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能有很好的調(diào)節(jié)作用。對(duì)丹參提取物的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B增加了血清清除自由基(SOD)能力，降低了脂質(zhì)過氧化副產(chǎn)物(MDA)水平[9]。SOD具有清除機(jī)體內(nèi)過多的超氧負(fù)離子自由基的能力，檢測(cè)組織中SOD的活力水平能夠了解機(jī)體組織對(duì)氧化物、自由基等的清除能力。機(jī)體內(nèi)MDA的含量可間接反映體內(nèi)S0D活力，反映體內(nèi)脂質(zhì)氧化程度，了解機(jī)體氧化一抗氧化系統(tǒng)能力。本次研究結(jié)果顯示，C組SOD活性水平明顯高于B組，MDA含量明顯低于B組(P<0.05)，與其他學(xué)者研究結(jié)果基本一致[11]。IL-6是具有代表性的炎性因子，具有增強(qiáng)NK細(xì)胞活性、誘導(dǎo)急性期反應(yīng)分子并刺激肝細(xì)胞的作用；TNF-α是一種強(qiáng)力促炎性反應(yīng)細(xì)胞因子，作為體內(nèi)細(xì)胞因子調(diào)解啟動(dòng)因子在刺激炎性細(xì)胞趨化反應(yīng)、改變血管內(nèi)皮通透性等方面發(fā)揮強(qiáng)大的局部作用；TGF-β1由多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，能使正常的成纖維細(xì)胞的表型發(fā)生轉(zhuǎn)化，現(xiàn)已成為RILI防治的新靶點(diǎn)，多種研究均表明干預(yù)TGF-β1信號(hào)通路能夠減輕RILI的發(fā)生，降低血清中TGF-β1的水平對(duì)于RILI的防治具有重要作用[12]。本次研究結(jié)果表明，C組血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平均明顯低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示丹參提取物能夠有效減輕炎性反應(yīng)、抑制纖維化。NF-κB 作為核轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展過程中具有十分重要的調(diào)控作用，能夠經(jīng)由降低 NF-κB的轉(zhuǎn)錄來對(duì)肺損傷以及肺纖維化產(chǎn)生抑制作用[13]。本次研究結(jié)果顯示，C組大鼠各期肺組織NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量明顯低于B組(P<0.05)，提示丹參有效降低NF-κB p65的轉(zhuǎn)錄，為RILI患者提供保護(hù)。通過對(duì)各組大鼠不同階段右肺系數(shù)的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，丹參提取物能夠降低實(shí)驗(yàn)大鼠右肺指數(shù)，從而降低肺部病理損傷，最終發(fā)揮抗纖維化的作用。

通過上述研究總結(jié)，丹參提取物對(duì)RILI的機(jī)理主要有：①保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，改善血液循環(huán)，降低血管通透性，抑制血小板聚集，減輕肺水腫和纖維化的發(fā)生；②抑制TNF-α、TGF-β1等表達(dá)，減輕炎癥及纖維化病變；③增強(qiáng)抗氧化和清除自由基作用，降低射線引起的過氧化損傷，抑制成纖維細(xì)胞增殖。但是丹參酮類化合物具有脂溶性高、半衰期短和生物利用度低等缺點(diǎn)[14]，臨床應(yīng)用受到限制。

綜上所述，丹參提取物對(duì)RILI具有良好的保護(hù)作用，能夠顯著降低血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平，提高血清SOD活性水平，降低肺組織織MDA含量、NF-κB p65表達(dá)和右肺系數(shù)，減少相關(guān)炎癥的發(fā)生，預(yù)防肺纖維化。