GRP78、Derlin-1在肺纖維化大鼠模型中的表達(dá)研究

劉賁 李旭梅 戴曦 袁競 詹倩 王榮麗

特發(fā)性肺纖維化( IPF)是一種常見的慢性進(jìn)行性呼吸系統(tǒng)疾病，以肺泡上皮細(xì)胞損傷、成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞聚集和細(xì)胞外基質(zhì)沉積為特征[1]。病因及病理生理過程復(fù)雜，尚無有效的臨床治療手段。既往研究表明氧化應(yīng)激和過度炎癥反應(yīng)在肺纖維化中起到重要作用[2]，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)與氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡有著緊密關(guān)系,并與炎癥相互關(guān)聯(lián)[3-4]，過度的ERS還會增加肺纖維化的易感性[5]，ERS與肺纖維化似乎有密切聯(lián)系。在ERS級聯(lián)反應(yīng)中，GRP78的表達(dá)上調(diào)被認(rèn)為是ERS和UPR的激活標(biāo)志[6]。持續(xù)的ERS刺激Derlin-1的表達(dá)，參與ERAD緩解ERS，避免細(xì)胞凋亡[7-8]。本研究通過分析Derlin-1和GRP78在肺纖維化動物模型中的的表達(dá)，探討ERS在肺纖維化過程中的作用，尋找新的診療靶點(diǎn)。

資料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動物、藥品、試劑

清潔健康雄性SD大鼠50只，8～10周齡，體質(zhì)量(210±10)g，購于西南醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，常規(guī)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行造模。質(zhì)量濃度20%的百草枯(先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司)；Masson三色染色試劑盒(北京雷根生物科技有限公司)；DERLIN-1抗體(北京布爾森股份有限公司)；GRP78抗體(美國BioWorld公司)；SP試劑盒(邁新公司)；ELISA試劑盒(R&D公司)。

二、模型制備

將50只大鼠隨機(jī)分為染毒組和對照組，染毒組根據(jù)染毒后不同時間隨機(jī)分為Day1、Day7、Day14、Day21共4個亞組，每組均為10只。染毒組通過腹腔注射15 mg/kg劑量百草枯誘導(dǎo)小鼠肺纖維化；對照組腹腔注射等量生理鹽水。通過觀察大鼠食欲不振、反應(yīng)遲緩、斜視、垂發(fā)、身體卷曲、缺乏運(yùn)動和呼吸困難等現(xiàn)象判斷造模是否成功，剔除不符合判定標(biāo)準(zhǔn)或死亡模型后，每組最終有6只大鼠納入研究結(jié)果分析。所有染毒組大鼠分別于染毒后第1、7、14、21天處死；對照組在第1天處死，隨機(jī)抽取6只作為對照。

三、計(jì)算肺系數(shù)

肺系數(shù)常作為監(jiān)測實(shí)驗(yàn)動物肺水腫的指標(biāo)。大鼠處死后稱重，開胸分離雙肺，觀察肺組織病理變化；用濾紙吸干雙肺表面的液體后稱取濕重，按公式(肺系數(shù)=肺濕重(mg)/大鼠體重(g)×100%)計(jì)算肺系數(shù)。

四、肺組織HE染色及Masson染色

分離左肺下葉制作石蠟切片，行常規(guī)HE染色和Masson染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變，參照Szapiel標(biāo)準(zhǔn)[9]評定肺組織炎癥程度和纖維化程度(表1)。

表1 Szapiel等的肺組織病理評分標(biāo)準(zhǔn)

五、免疫組化檢測Derlin-1和GRP78的表達(dá)

在200倍顯微鏡下仔細(xì)觀察制備好的肺組織切片，每張切片隨機(jī)選取5個視野，采用Img-Pro6.0圖像分析系統(tǒng)測量陽性細(xì)胞的平均光密度(OD)值，分析肺組織切片標(biāo)本的Derlin-1、GRP78陽性表達(dá)強(qiáng)度。

六、Elisa檢測肺組織中Derlin-1的表達(dá)水平

分別稱取200mg肺組織/只，用冰凍的生理鹽水漂洗干凈后分別加入2 mL冰凍的生理鹽水，剪碎后制備組織勻漿，低溫離心機(jī)中以3 000 r/min、4℃的條件下離心15分鐘，取上清液，-80℃凍存?zhèn)溆?。按照Elisa試劑盒操作說明書檢測肺組織勻漿樣本中Derlin-1的表達(dá)水平。

七、統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各多組間的比較采用單因素方差分析，以SNK法進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、大鼠染毒后的一般情況

對照組大鼠表現(xiàn)正常。而染毒組大鼠在染毒30分鐘后分別出現(xiàn)不同程度的中毒現(xiàn)象，可觀察到大鼠出現(xiàn)明顯反應(yīng)遲鈍、食欲不振、毛發(fā)蓬松、呼吸急促、鼠尾發(fā)紺、喜蜷縮少動、易捕捉等現(xiàn)象。1天后，染毒組上述癥狀加重，部分大鼠口鼻紫紺甚至死亡。第7天起，染毒組存活下的大鼠出現(xiàn)精神好轉(zhuǎn)、進(jìn)食逐漸增多、體重逐漸上升表現(xiàn)，至第21天大鼠上述急性期癥狀基本消失，但較對照組大鼠生長欠佳。

二、肺大體形態(tài)觀察及肺系數(shù)評定

對照組大鼠的肺組織光滑紅潤，質(zhì)地柔軟，富有彈性。Day1組肺組織可見輕度水脹、充血；Day7組較Day1組出現(xiàn)肺淤血，水腫加重；Day14組肺組織水腫淤血明顯，肺局灶性實(shí)變，彈性下降；Day21組大鼠肺組織實(shí)變面積較大，體積明顯縮小，顏色蒼白，質(zhì)地堅(jiān)硬。

肺系數(shù)分析結(jié)果顯示：單因素方差分析組間比較F值為98.416，P<0.001。兩兩比較時，Day1、Day7、Day14組大鼠的肺系數(shù)均高于對照組(P<0.05)，Day7組最高，Day14組較Day7組開始出現(xiàn)下降，組間比較均為P<0.05；而Day21組肺系數(shù)與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.561，P>0.05)(見表2)。

表2 大鼠肺系數(shù)評定

三、肺組織HE染色病理表現(xiàn)及炎癥評分

對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，無充血、水腫、炎性滲出；Day1組可見毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，伴少量炎癥細(xì)胞浸潤；Day7組部分支氣管上皮細(xì)胞脫落，血管明顯充血，肺泡炎癥反應(yīng)明顯，腔內(nèi)可見水腫液，間隔增厚；Day14組部分肺泡塌陷，結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)增厚，炎性細(xì)胞浸潤減少，伴有較多成纖維細(xì)胞增生；Day21組肺組織炎癥反應(yīng)消失，結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺泡間隔增寬、管腔縮小，大量纖維細(xì)胞增生。結(jié)果見表3，圖1。單因素方差分析組間比較F值為147.469，P<0.001。

圖1 大鼠肺組織HE染色(×100)

表3 肺泡炎癥程度評分

四、肺組織Masson染色及肺纖維化評分

正常對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，周圍僅有少量藍(lán)染的生理性膠原纖維；Day1組肺組織可見藍(lán)染的膠原纖維增多；Day7組部分肺組織被纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞所替代，可見少許藍(lán)染膠原沉積；Day14組膠原纖維增生，藍(lán)染面積增大，肺間質(zhì)呈纖維性增生；Day21組藍(lán)染膠原沉積明顯。評分顯示染毒組肺纖維化評分均高于對照組，且隨染毒時間延長評分越來越高，除Day1組，Day7、Day14和Day21組與對照組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中Day14組較Day7組評分明顯升高(P<0.05)，而Day14組與Day21組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，單因素方差分析組間比較F值為206.982，P<0.001(見表4、圖2)。

圖2 大鼠肺組織Masson染色(×100)

表4 肺纖維化程度評分

五、免疫組化觀察肺組織中Derlin-1、GRP78表達(dá)水平

顯微鏡下肺組織細(xì)胞核呈藍(lán)色，Derlin-1陽性表達(dá)為棕黃色顆粒。免疫組化結(jié)果顯示Derlin-1、GRP78表達(dá)部位相似，均主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿中。分析Derlin-1陽性表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，染毒組的Derlin-1表達(dá)均高于對照組(P<0.05)，于Day14組表達(dá)最高，與Day7組相比較(P<0.05)；Day21組有所下降，Day1組、Day7與Day21組兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，單因素方差分析組間比較F值為12.692，P<0.001(見表5、圖3)。分析GRP78陽性表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，染毒組的GRP78表達(dá)均高于正常對照組(P<0.05)，于Day7組表達(dá)最高，Day14、Day21組較Day7組有所下降，各組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，單因素方差分析組間比較F值為303.541，P<0.001(見表6、圖4)。

圖3 大鼠肺組織免疫組化檢測Derlin-1表達(dá)(×100)

圖4 大鼠肺組織免疫組化檢測GRP78表達(dá)(×100)

表5 大鼠Derlin-1表達(dá)水平

表6 大鼠GRP78表達(dá)水平

六、肺組織勻漿中Derlin-1的表達(dá)

通過ELisa法檢測肺組織勻漿中Derlin-1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示Derlin-1隨染毒時間緩慢升高，于Day14組表達(dá)最高，Day21組較Day14組表達(dá)降低，各組間兩兩相互比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，單因素方差分析組間比較F值為552.184，P<0.001。該結(jié)果與免疫組化觀察結(jié)果趨勢一致(見表7)。

表7 大鼠肺組織勻漿中Derlin-1表達(dá)水平

討 論

肺纖維化是以成纖維細(xì)胞增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)聚集并伴炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的一大類肺疾病的終末期改變。該疾病的發(fā)生發(fā)展過程尚不完全明確，現(xiàn)認(rèn)為與細(xì)菌、病毒感染，藥物，自身免疫性疾病，煙草及粉塵接觸，以及環(huán)境污染有一定的關(guān)系[10]。近年來發(fā)病人數(shù)逐年增加，臨床治療手段以糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及抗纖維化藥物為主，但療效不盡人意，造成了沉重的公共衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，急需新的治療靶點(diǎn)。真核細(xì)胞為應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)及其異常聚集，啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激級聯(lián)反應(yīng)，折疊蛋白反應(yīng)(UPR)、整合應(yīng)激反應(yīng)(ISR)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解(ERAD)被激活，其目的是阻止蛋白質(zhì)翻譯，改善蛋白質(zhì)折疊，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，避免因未折疊或錯誤折疊蛋白的積累而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11-12]。既往多項(xiàng)研究表明通過抑制ERS能夠緩解炎癥，抑制細(xì)胞凋亡，減少組織損傷，在哮喘、ARDS、COPD等呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。近年來許多研究發(fā)現(xiàn)ERS與肺纖維化也有密切關(guān)系[13-14]，本文通過百草枯染毒復(fù)制肺纖維化動物模型，觀察GRP78和Derlin-1的表達(dá)以探尋內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肺纖維化的關(guān)系。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的分子伴侶蛋白，當(dāng)發(fā)生ERS時，其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的3種跨膜蛋白解離并主動與未折疊或錯誤折疊蛋白結(jié)合，GRP78的上調(diào)標(biāo)志著ER stress的啟動[15]。實(shí)驗(yàn)中我們用免疫組化的方法檢測肺組織中GRP78表達(dá)，結(jié)果顯示，GRP78于染毒1天后表達(dá)明顯升高，在染毒第7天達(dá)到最高后開始下降，第21天較第14天明顯下降(P<0.001)，仍高于對照組，各組數(shù)據(jù)相比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此我們認(rèn)為染毒大鼠肺組織內(nèi)確實(shí)發(fā)生了ERS。早期機(jī)體啟動ER stress，GRP78于染毒早期升高，促進(jìn)錯誤折疊及未折疊蛋白的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解，減少細(xì)胞損傷；后面GRP78的表達(dá)開始降低，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷已不可逆，無法恢復(fù)正常功能時則啟動凋亡信號通路，清除受損肺泡上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞增殖，膠原沉積，最終導(dǎo)致肺纖維的形成。免疫組化結(jié)果顯示Derlin-1主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中，免疫組化、ELISA兩種方法檢測Derlin-1的表達(dá)均顯示，染毒組中Derlin-1的表達(dá)隨時間先升高后降低，Day14組表達(dá)最高，Day21組有所下降但仍高于Day1、Day7組，各組數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上表明百草枯中毒后誘導(dǎo)了肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生ERS。且為應(yīng)對持續(xù)存在或過強(qiáng)的ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，作為一種保護(hù)性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白Derlin-1在染毒早期升高，阻止過強(qiáng)的ER相關(guān)性凋亡的出現(xiàn)。隨時間延長，Derlin-1的表達(dá)有所下降，可能系已出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的肺損傷，ERS啟動的凋亡作用超過了其保護(hù)性作用，ERS持續(xù)性發(fā)展，進(jìn)一步促進(jìn)了肺纖維化的形成，并最終發(fā)展成為不可逆性的肺間質(zhì)纖維化。實(shí)驗(yàn)通過對各組病理組織進(jìn)行肺泡炎和肺纖維化的程度的評分，對肺系數(shù)進(jìn)行測定，結(jié)果對照顯示早期示以急性肺泡炎反應(yīng)為主，后期則出現(xiàn)肺間質(zhì)的纖維化，近年來也有越來越多的研究表明炎癥反應(yīng)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有著緊密聯(lián)系[16]，而持續(xù)的炎癥反應(yīng)和異常修復(fù)，也是肺纖維化的誘因[17]，故內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和肺纖維化之間也有某種聯(lián)系。

目前認(rèn)為百草枯在體內(nèi)誘導(dǎo)急性氧化還原反應(yīng)，不但導(dǎo)致直接損傷，還使得活性氧物質(zhì)(ROS)過度激活，調(diào)節(jié)肺內(nèi)不同的促炎介質(zhì)促進(jìn)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)前纖維化因子的產(chǎn)生，形成肺損傷，最終導(dǎo)致肺纖維化[18]。我們通過本研究，在百草枯染毒大鼠肺組織細(xì)胞中觀察到GRP78和Derlin-1的表達(dá)水平在早期上升，證實(shí)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了肺纖維化的病理過程，其規(guī)律性變化亦驗(yàn)證了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肺纖維化的形成關(guān)系密切。該研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示肺纖維化的分子機(jī)制，以為尋求新的診治靶點(diǎn)提供了可靠的基礎(chǔ)研究依據(jù)。