復(fù)方葶藶子湯對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠mPAP、肺血管重構(gòu)的干預(yù)作用

劉愛(ài)平 劉俊 謝蕾 柏正平

摘要：目的觀察探討復(fù)方葶藶子湯對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓（HPH）大鼠平均肺動(dòng)脈壓力（mPAP）的影響，針對(duì)HPH的發(fā)病機(jī)制，探索有效防治方法，為臨床應(yīng)用提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。方法將健康雄性SD大鼠50只，分為正常組、HPH模型組、強(qiáng)的松組、復(fù)方葶藶子湯中、高劑量組，各組10只，分別于每日給藥后放入低氧艙8 h，連續(xù)干預(yù)21 d后根據(jù)改良右心導(dǎo)管術(shù)測(cè)大鼠平均肺動(dòng)脈壓力并記錄，同時(shí)光鏡下觀察大鼠肺動(dòng)脈HE染色及彈力纖維染色并記錄。結(jié)果實(shí)驗(yàn)測(cè)得結(jié)果提示HPH模型組mPAP明顯高于正常組，且高于其他3組。復(fù)方葶藶子湯中、高劑量組大鼠mPAP較西藥強(qiáng)的松組大鼠有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）與HPH模型組相比，復(fù)方葶藶子湯組大鼠肺血管管壁較薄，管腔變寬;與復(fù)方葶藶子湯組相比，強(qiáng)的松組大鼠肺動(dòng)脈管壁增厚，管腔變窄。結(jié)論“飲瘀同治”的復(fù)方葶藶子湯可抑制甚或部分逆轉(zhuǎn)低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠的肺血管重構(gòu)，從而降低低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠的肺動(dòng)脈壓力。

關(guān)鍵詞：復(fù)方葶藶子湯;低氧性肺動(dòng)脈高壓;肺脹

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2021）02-0067-04

低氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary arterial hypertension，HPH）是多種肺系疾病長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作，引起肺血管阻力及肺動(dòng)脈壓力升高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，HPH普通人群患病率約為1%，而65歲以上人群的患病率高達(dá)10%[1]，HPH患病率至少為15/100萬(wàn)[2]，目前針對(duì)HPH的治療藥物不能預(yù)防或逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)展[3]，因此探索新的治療方法顯得十分必要。

中醫(yī)古籍中無(wú)低氧性肺動(dòng)脈高壓的記載，臨床上我們根據(jù)其臨床表現(xiàn)將其歸于“肺脹”范疇，肺脹的病機(jī)多屬“本虛標(biāo)實(shí)、飲瘀互結(jié)”[4]。本虛主要為“陽(yáng)虛”、“氣虛”，常貫穿于病程之中，標(biāo)實(shí)主要為“痰濁”、“水飲”、“瘀血”，其在疾病過(guò)程中是不斷變化發(fā)展的[5]。痰飲之為病，影響廣泛，故有云“百病多因痰作祟”。又如《金匱要略》所述“血不利則為水”，《血證論》所述：“血積日久，亦化為痰水”。表明“痰濁”、“水飲、“瘀血”等病理因素相互影響，互為因果，痰瘀互結(jié)，膠著難解。復(fù)方葶藶子湯是由柏正平主任根據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論和臨床多年實(shí)踐而擬定的經(jīng)驗(yàn)方，其臨床應(yīng)用多年取得了較好的療效。本文實(shí)驗(yàn)觀察大鼠平均肺動(dòng)脈壓（mean Pulmonary artery pressure，mPAP）、及觀察大鼠肺動(dòng)脈HE染色及彈力纖維染色出發(fā)，進(jìn)一步探討“飲瘀同治”的復(fù)方葶藶子湯治療HPH的可能機(jī)制，為復(fù)方葶藶子湯臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)條件健康清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，鼠齡6～8周，體重約（230±20）g，湖南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：N0.43004700042712。動(dòng)物房清潔消毒，控制室溫在20℃～25℃，相對(duì)濕度65%～75%，自由進(jìn)食飲水，分籠飼養(yǎng)，動(dòng)物飲水及飼料每日檢查添加。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品（1）強(qiáng)的松片 規(guī)格：5 mg×100片，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H31020771，上海上藥信誼藥廠有限公司。（2）復(fù)方葶藶子湯的制備：葶藶子10 g，水蛭3 g，黃芩10 g，矮地茶15 g，桂枝10 g，茯苓10 g，白術(shù)10 g，干地龍10 g，甘草5 g，中藥先浸泡30 min，后煎熬45 min，過(guò)濾去渣，藥液濃縮至166 mL，即每mL含2 g生藥。放入冰箱保存?zhèn)溆?。中藥藥材?gòu)自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院。

1.3主要實(shí)驗(yàn)試劑蘇木素染色液（廣州市秀威貿(mào)易有限公司，BC-DL-066-50mL）;間苯二酚染液套裝（武漢谷歌生物科技有限公司，G1054）。

1.4主要實(shí)驗(yàn)儀器測(cè)氧儀（上海嘉華公司，CY-12CB）;低氧艙（自制）;MP100多導(dǎo)電生理儀（美國(guó)BIOPAC公司，BioNomadix）;正置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司，Eclipse Ci-E/L/S）;成像系統(tǒng)（日本Nikon公司，DS-U3）;顯微鏡（常州恒隆儀器有限公司，OPTEC CCD TP510 200×）;電子天平（上海精密科學(xué)儀器 JA1003N）;實(shí)驗(yàn)室PH計(jì)（瑞士METTLER TOLEDO，S20），酶標(biāo)儀（德朗Diatek公司，DR-200Bs）。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組健康清潔級(jí)雄性SD大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分組，分為正常組、HPH模型組、強(qiáng)的松組、復(fù)方葶藶子湯中、高劑量組，各組10只，大鼠自由進(jìn)食飲水。

1.5.2給藥（1）正常組：大鼠于正常環(huán)境中活動(dòng)及進(jìn)食，每日生理鹽水（1mL/100g）灌胃，飼養(yǎng)21 d。（2）HPH模型組：大鼠根據(jù)彭公永等[6-7]方法進(jìn)行造模，將大鼠置于常壓低氧艙內(nèi)，設(shè)置并調(diào)控艙內(nèi)氧濃度，向艙內(nèi)輸入氮?dú)?，調(diào)控艙內(nèi)氧濃度為（10±0.5）%，每日缺氧8 h，低氧干預(yù)持續(xù)21 d。每日予生理鹽水（1 mL/100 g）灌胃30 min后放入低氧艙。（3）強(qiáng)的松組：本實(shí)驗(yàn)選用強(qiáng)的松片作為西藥對(duì)照組，每日放入低氧艙前30 min灌胃;強(qiáng)的松片，5 mg/片，人最高用量為60 mg/d，大鼠用藥劑量按體表面積折算相當(dāng)于人臨床用藥等效劑量為7.8 mg/d，實(shí)驗(yàn)時(shí)使用2倍等效劑量15.6 mg/kg，用3mL蒸餾水配制[8]。其余同HPH模型組。（4）復(fù)方葶藶子湯中劑量組：根據(jù)大鼠表面積換算選定10 g/kg·d藥液為中劑量組，每日放入低氧艙前30 min灌胃。余同HPH模型組。（5）復(fù)方葶藶子湯高劑量組：根據(jù)大鼠表面積換算選定20 g/kg.d藥液為高劑量組，每日放入低氧艙前30 min灌胃。余同HPH模型組。

1.5.3一般情況觀察及肺動(dòng)脈壓力測(cè)定（1）觀察一般情況：造模期間，每日對(duì)大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)狀況、呼吸、口鼻分泌物、進(jìn)食等情況進(jìn)行觀察并及時(shí)記錄，期間對(duì)死亡大鼠作相應(yīng)處理和記錄。（2）肺動(dòng)脈壓力測(cè)定：大鼠末次給藥后根據(jù)孫波[9]及黃曉穎等[10]插入導(dǎo)管法測(cè)定mPAP。首先大鼠稱重，腹腔注射10%水合氯醛麻醉（2～4 L/kg），肝素（50u/mL）抗凝，仰臥位固定，剪除頸部鼠毛并消毒，暴露分離右側(cè)頸外靜脈，以醫(yī)用眼科剪于靜脈中上1/3處斜行剪開頸外靜脈，作“V”形切口，以鑷子稍提起近心端切口邊緣，插入測(cè)壓導(dǎo)管。導(dǎo)管插入時(shí)保持導(dǎo)管弧向上。經(jīng)右心房及右心室送到肺動(dòng)脈，待肺動(dòng)脈壓力波形穩(wěn)定后用生理記錄儀記錄mPAP。

1.5.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理、取材及標(biāo)本制備

1.5.4.1蘇木素-依紅（hematoxylin-eosin，HE）染色測(cè)壓結(jié)束后處死大鼠，剖取肺臟。以生理鹽水漂洗肺組織，剪下右肺，取肺動(dòng)脈行HE染色;待光鏡下觀察。

1.5.4.2彈力纖維染色（1）肺動(dòng)脈石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。（2）酸化高錳酸鉀（高錳酸鉀：硫酸=1∶1混合）氧化5 min，水洗后，用草酸溶液漂白1～2min。（3）流水沖洗2min。（4）切片放入裝有間苯二酚品紅染色液中加蓋浸染染色，室溫下3～4 h，流水沖洗。（5）鹽酸酒精分化至無(wú)染液脫下，彈力纖維清晰的紫紅色，背景近乎無(wú)色。（6）將飽和苦味酸與酸性品紅9∶1混合成VG染液，切片水甩干，染3 min，快速水洗，正丁醇透明。（7）透明，封片處理;（8）顯微鏡圖像采集分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法各分組所得計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，各組間比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大鼠一般情況（1）正常組大鼠精神好，毛發(fā)光澤、活動(dòng)度高，進(jìn)食正常，反應(yīng)敏捷，實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)死亡。（2）HPH模型組、強(qiáng)的松組、復(fù)方葶藶子湯中、高劑量組大鼠在低氧環(huán)境中出現(xiàn)不同程度的精神欠佳，毛發(fā)雜亂，呼吸急促，口鼻分泌物增加，昏昏欲睡，少動(dòng)少食。其中HPH模型組大鼠死亡3只;強(qiáng)的松組大鼠死亡3只;復(fù)方葶藶子湯中劑量組大鼠死亡3只、復(fù)方葶藶子湯高劑量組大鼠死亡2只;大鼠死亡原因考慮如下：①灌胃操作存在失誤，導(dǎo)致誤入肺組織而死。②低氧狀態(tài)下肺部炎癥及呼吸困難而致死亡。③個(gè)別大鼠體質(zhì)弱，對(duì)實(shí)驗(yàn)藥物不耐受。④踩踏。⑤其他。

2.2大鼠mPAP的變化造模結(jié)束后測(cè)得大鼠mPAP的情況，（1）與正常組大鼠mPAP相比，HPH模型組、強(qiáng)的松組、復(fù)方葶藶子湯中、高劑量組大鼠mPAP均增高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;結(jié)合造模組大鼠的一般情況，可表明低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠的造模是成功的。（2）與HPH模型組相比，其余4組大鼠mPAP均降低，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;其中強(qiáng)的松組大鼠mPAP較復(fù)方葶藶子湯中、高劑量組增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），中劑量組大鼠mPAP較復(fù)方葶藶子湯高劑量組增高，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（見表1）

2.3大鼠肺血管組織學(xué)改變光鏡下觀察大鼠肺動(dòng)脈HE染色及彈力纖維染色發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠肺小動(dòng)脈管壁薄且均勻，管腔大且通暢，內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性較好;HPH模型組大鼠肺小動(dòng)脈管壁明顯增厚，管腔狹窄明顯，內(nèi)皮細(xì)胞的連續(xù)性破壞，管腔內(nèi)見彈力纖維增生及受損，血管結(jié)構(gòu)變化較明顯（見圖1B及圖2）。與HPH模型組相比，強(qiáng)的松組大鼠肺小動(dòng)脈管壁稍薄，管腔略有增寬;復(fù)方葶藶子湯中、高劑量組大鼠的肺小動(dòng)脈管壁薄，管腔增寬。結(jié)合彈力纖維染色，復(fù)方葶藶子湯高劑量組大鼠肺小動(dòng)脈形態(tài)幾乎恢復(fù)至正常組的狀態(tài)，我們可認(rèn)為肺小動(dòng)脈重構(gòu)得到抑制甚或部分逆轉(zhuǎn)。（見圖1、圖2）

3討論

現(xiàn)階段研究認(rèn)為，低氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制主要因缺氧而致肺血管異常收縮、肺血管阻力增加引起肺小動(dòng)脈痙攣、收縮，肺阻力增加，肺血管重構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致肺血流動(dòng)力學(xué)的改變。中醫(yī)古籍中無(wú)低氧性肺動(dòng)脈高壓的記載，臨床上根據(jù)其臨床表現(xiàn)將其歸于“肺脹”范疇，肺脹的病機(jī)多屬“本虛標(biāo)實(shí)、飲瘀互結(jié)”。本虛主要為“陽(yáng)虛”、“氣虛”，常貫穿于病程之中，標(biāo)實(shí)主要為“痰濁”、“水飲”、“瘀血”，其在疾病過(guò)程中是不斷變化發(fā)展的。痰飲之為病，影響廣泛，故有云“百病多因痰作祟”。又如《金匱要略》所述“血不利則為水”，《血證論》所述“血積日久，亦化為痰水”。表明“痰濁”、“水飲、“瘀血”等病理因素相互影響，互為因果，痰瘀互結(jié)，膠著難解。而陽(yáng)虛又可致水泛，導(dǎo)致水飲凌心，從而出現(xiàn)一系列癥狀。

復(fù)方葶藶子湯是由恩師柏正平根據(jù)以上中醫(yī)基礎(chǔ)理論和臨床多年實(shí)踐而擬定的經(jīng)驗(yàn)方，由葶藶子、水蛭、黃芩、矮地茶、桂枝、茯苓、白術(shù)、干地龍、甘草組成。該方中葶藶子瀉肺逐水、止咳平喘，為君;其可宣通肺部壅滯，加強(qiáng)肺氣的宣發(fā)肅降之能，使水濕得以布散周身并下輸于腎及膀胱，達(dá)到瀉肺逐水之效;水蛭活血逐瘀，為臣，助其藥效直達(dá)病所，并助葶藶子宣肺行氣;黃芩清肺化痰、止咳平喘;茯苓、白術(shù)、桂枝共奏溫脾化飲之效，脾陽(yáng)得溫，脾氣得升，則痰飲得化，故絕其“生痰之源”。矮地茶長(zhǎng)于化痰止咳，兼能平喘、利濕、活血化瘀;血液得行，瘀血得通，血利則水消氣順，故諸癥自除。地龍具有通絡(luò)平喘，利尿之效;甘草健胃和中，調(diào)和諸藥;方中諸藥使“痰飲”、“瘀血”等病理產(chǎn)物無(wú)所遁形，分利而出。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肺動(dòng)脈壓力增高是痰、飲、瘀相互作用的結(jié)果。故我們采取“飲瘀同治”之法，飲去則痰無(wú)生化之源，瘀行則肺絡(luò)通暢，共奏瀉肺逐飲、祛瘀通絡(luò)、溫陽(yáng)化氣之效。

實(shí)驗(yàn)觀察到大鼠低氧1周后，造模組大鼠開始出現(xiàn)不同程度的精神欠佳，毛發(fā)雜亂，呼吸稍促，口鼻分泌物增加，少動(dòng)少食，其中以HPH模型組更為明顯，表明在常壓低氧的情況下大鼠的一般情況及進(jìn)食受到影響。與此同時(shí)復(fù)方葶藶子湯組大鼠精神稍好，活動(dòng)較多，進(jìn)食較HPH模型組大鼠增加。表明“飲瘀同治”的復(fù)方葶藶子湯能改善其癥狀。

感染、缺氧等因素導(dǎo)致肺血管收縮，肺阻力增加，肺血管重構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致肺血流動(dòng)力學(xué)的改變。實(shí)驗(yàn)測(cè)得結(jié)果提示HPH模型組mPAP明顯高于正常組，且高于其他三組。復(fù)方葶藶子湯中、高劑量組大鼠mPAP較西藥強(qiáng)的松組大鼠有所降低，說(shuō)明復(fù)方葶藶子湯組與強(qiáng)的松組比較，其降低肺動(dòng)脈壓力的療效較好，其中復(fù)方葶藶子湯高劑量組大鼠mPAP低于復(fù)方葶藶子湯中劑量組。表明復(fù)方葶藶子湯預(yù)防或治療本病需達(dá)一定劑量。復(fù)方葶藶子湯復(fù)方湯劑的成分較為復(fù)雜，藥味不單一，結(jié)合本方藥物組成及中藥現(xiàn)代藥理研究，“飲瘀同治”的復(fù)方葶藶子湯可能是通過(guò)多方面、多靶點(diǎn)減輕肺小動(dòng)脈收縮、痙攣，擴(kuò)張肺血管，改善肺血管阻力，增加肺血管順應(yīng)性而降低肺動(dòng)脈壓力。

低氧性肺動(dòng)脈高壓的肺血管重構(gòu)是以血管壁增厚為主要結(jié)構(gòu)的改變，尤以中膜平滑肌增厚為主。我們從HE染色及彈力纖維染色觀察到正常組大鼠肺血管管壁薄，管腔大，內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性較好;而HPH模型組大鼠肺血管管壁明顯增厚，管腔明顯變窄甚或閉塞，內(nèi)皮細(xì)胞的連續(xù)性被破壞，彈力纖維受損或增生，肺血管結(jié)構(gòu)改變。與HPH模型組相比，中藥組大鼠肺血管管壁較薄，管腔變寬;與中藥組相比，強(qiáng)的松組大鼠肺動(dòng)脈管壁增厚，管腔變窄。表明“飲瘀同治”的復(fù)方葶藶子湯可抑制甚或部分逆轉(zhuǎn)低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠的肺血管重構(gòu)。

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（收稿日期：2020-09-09）