黃海北部真核微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)及環(huán)境關(guān)聯(lián)

宋 倫,畢相東,付 杰,宋廣軍,吳金浩,劉 印,劉蘇萱（.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院,遼寧省海洋生物資源與生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 60；.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院,天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 0084；.大連海洋大學(xué),遼寧 大連 60）

黃海北部是海水貝類主要增養(yǎng)殖區(qū),但近十多年扇貝、牡蠣、雜色蛤等濾食性貝類普遍出現(xiàn)滯長(zhǎng)、肉質(zhì)偏瘦、死亡率升高等現(xiàn)象,限制了海洋漁業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展.作為濾食性貝類的餌料基礎(chǔ)—海洋微藻,在生理功能、沉降速率和被攝食壓力等方面存有差異,致使微藻粒級(jí)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)影響較大[1].由于濾食性貝類對(duì)餌料微藻具有選擇性策略[2],因此微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響其營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備和健康生長(zhǎng),小粒級(jí)微藻對(duì)質(zhì)量選擇型的貝類影響更大[3].然而微型（2～20μm）和微微型（0.22～2μm）藻類個(gè)體微小、形態(tài)學(xué)鑒定困難,粒級(jí)結(jié)構(gòu)研究較為遲緩.

褐潮的暴發(fā)引起了各界對(duì)小粒徑微藻研究的高度關(guān)注[4-5],高通量測(cè)序分子鑒定技術(shù)的發(fā)展極大地推動(dòng)了小粒徑微藻多樣性的高效檢測(cè),進(jìn)而加速了其對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的影響研究[6-7].然而,有關(guān)微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)算方法亟待優(yōu)化.

目前微藻粒級(jí)測(cè)算技術(shù)主要有葉綠素 a分級(jí)法、電子粒度分析儀法、流式細(xì)胞術(shù)法、顯微測(cè)量粒徑分析法、分子鑒定法等,其中前三種可對(duì)微藻生物量進(jìn)行粗略區(qū)分,無(wú)法獲取各組分種類信息,顯微測(cè)量粒徑分析法無(wú)法觀測(cè)微微型和部分微型藻類,然而該組分在整個(gè)微藻群落中占比較大.研究發(fā)現(xiàn),葉綠素a分級(jí)法、電子粒度分析儀法都會(huì)低估中、小微藻的生物量,而高估＞20μm 小型微藻的貢獻(xiàn)[8].目前常用的葉綠素a分級(jí)法由于大孔徑濾膜截留率較高嚴(yán)重低估了小粒徑微藻的貢獻(xiàn),誤差最高超過(guò)80%[9-10].分子鑒定雖然還存在一些問(wèn)題,但比傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法更為精準(zhǔn)、客觀、高效,可大大提高微微型藻類的檢出率,隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展極大地推動(dòng)了微型藻類的高效檢測(cè)研究,為微藻粒級(jí)研究提供了新思路.

由于不同真核生物中rDNA的拷貝數(shù)差異較大,因此rDNA擴(kuò)增子測(cè)序所獲的序列數(shù)并不能表征環(huán)境樣本中真核微藻的豐度[11].但相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),rDNA序列多態(tài)性與細(xì)胞中 rDNA的拷貝數(shù)成正比[12],而真核微藻細(xì)胞體積（生物量）與rDNA的拷貝數(shù)成正比[13-15],因此,真核微藻分子鑒定獲取的序列數(shù)可表征其生物量大小,用于微藻全粒級(jí)結(jié)構(gòu)研究可行.宋倫[16]采用高通量測(cè)序-分子鑒定分級(jí)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),2018年春季大連長(zhǎng)?？h大長(zhǎng)山島鄰近海域小粒徑微藻（0.22～3μm）粒級(jí)組成主要受總氮影響較大,夏季受總氮、總磷影響顯著,秋季受溶解硅影響顯著,大粒徑微藻（＞20μm）粒級(jí)組成在夏季主要受溶解無(wú)機(jī)磷影響較大,中粒徑微藻（3～20μm）粒級(jí)組成受上述環(huán)境因子影響不顯著.

然而整個(gè)黃海北部海域微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)在時(shí)空上如何演變,哪些環(huán)境因子對(duì)各粒級(jí)微藻影響顯著,需要進(jìn)一步研究和分析.基于此,本文采用高通量測(cè)序-分子鑒定分級(jí)技術(shù)對(duì)黃海北部微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,以期解析濾食性貝類的供餌力基礎(chǔ)及環(huán)境關(guān)聯(lián).

1 材料與方法

1.1 樣品采集及制備

2019年在黃海北部海域垂岸布設(shè)12個(gè)站位（圖1）,分別于 2019 年 5 月（春）、8 月（夏）、10 月（秋）采集真核微藻分子鑒定樣品.

圖1 采樣站位示意Fig.1 Sampling sites

每個(gè)站位采集表層海水1L,現(xiàn)場(chǎng)用0.22μm微孔濾膜收集全部微藻,然后將濾膜轉(zhuǎn)移至 1.5mL無(wú)菌離心管中,置于-20℃冷凍保存、運(yùn)輸.同期進(jìn)行海水的水深（Dep）、pH、鹽度（Sal）、溶解氧（DO）、懸浮物（SS）、葉綠素 a（Chla）、化學(xué)需氧量（COD）、石油類（Oil）、無(wú)機(jī)氮（DIN）[銨鹽（NH4+）、硝酸鹽（NO3-）、亞硝酸鹽（NO2-）之和]、無(wú)機(jī)磷（DIP）、總氮（TN）、總磷（TP）、硅酸鹽（SiO32-）、重金屬汞（Hg）、鉛（Pb）、銅（Cu）、鋅（Zn）、鎘（Cd）、鉻（Cr）、砷（As）等指標(biāo)的監(jiān)測(cè).調(diào)查、檢測(cè)、質(zhì)量控制方法均參照《海洋調(diào)查規(guī)范》（GB/T 12763-2007）[17]和《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》（GB17378-2007）[18]執(zhí)行.

1.2 微藻基因組DNA提取

采用 CTAB法提取真核微藻宏基因組,將濾膜剪碎置于1.5mL離心管中,加入500μL CTAB裂解液（2% CTAB;100mmol/L Tris-Cl,pH為8.0;1.4mmol/L NaCl;10mmol/L EDTA）和 1μL β-巰基乙醇,5～10μL蛋白酶K,55℃裂解1～1.5h;短暫離心,取出液體置于新離心管中,用酚氯仿抽提2次后,取上清液,加入兩倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇,沉淀 2～3h,保留沉淀,使用75%乙醇清洗沉淀,得到浮游生物基因組 DNA,利用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度及純度,合格后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.3 18S rDNA V4可變區(qū)的PCR擴(kuò)增

該研究應(yīng)用的引物為自行開發(fā)的真核微藻18S rDNA V4區(qū)基因擴(kuò)增引物——V4（F/R）.上游引物為V4-F序列 5'-GCGGTAATTCCAGCTCCAATA-3',下游引物為V4-R序列5'-GATCCCCHWACTTTCG TTCTTGA-3'[19].將引物連接適當(dāng)?shù)慕宇^送往上海生工生物公司進(jìn)行合成.PCR反應(yīng)體系為 50 μL,包括 PCR Buffer 5μL、dNTP Mixture 8μL、上下游引物（10μmol/L）各 2μL、模板 DNA 2μL、Taq DNA 聚合酶2.5U,加適量滅菌水.擴(kuò)增反應(yīng)均在PE 9700型PCR儀（美國(guó)PE公司）上完成,反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min;94℃變性 30s,58℃退火 45s,72℃延伸 45s,共33個(gè)循環(huán);72℃延伸5min.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,將檢測(cè)合格的產(chǎn)物交由諾和致源生物信息科技有限公司,使用 NEB Next? Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina（New England Biolabs）建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit定量（Thermo Scientific）和文庫(kù)檢測(cè),合格后,使用Hiseq2500PE250模式進(jìn)行上機(jī)測(cè)序.

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

通過(guò)IlluminaHiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行PE250模式測(cè)序,所得原始數(shù)據(jù)使用 FLASH軟件進(jìn)行拼接,參照Qiime軟件質(zhì)量控制流程,將拼接后的序列經(jīng)過(guò)截取、過(guò)濾得到有效數(shù)據(jù).原始序列需經(jīng)過(guò)拼接和質(zhì)量過(guò)濾,為保障數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠,高質(zhì)量數(shù)據(jù)需占到90%以上,為進(jìn)一步分析物種組成多樣性信息,使用 Uparse軟件對(duì)所有樣品的有效序列進(jìn)行聚類分析,以 97%的一致性將序列聚類成為 OTUs種水平[20],剔除浮游動(dòng)物OTUs數(shù)據(jù)后得到微藻注釋信息.

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用 Uparse（http://drive5.com/uparse/）對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類和物種分類,采用RDP Classifier方法與SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.arb-silva.de/,Version 108）對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋[21].根據(jù)相關(guān)研究,不同粒徑的真核微藻序列數(shù)比例更接近于生物量比例[13-16],將各個(gè)站位所獲得的優(yōu)勢(shì)度超過(guò) 0.1%的種類均作為整體優(yōu)勢(shì)種參與粒級(jí)生物量比例統(tǒng)計(jì),參考相關(guān)文獻(xiàn)將篩查出的優(yōu)勢(shì)種粒徑進(jìn)行篩檢分級(jí)[13-15,22-25],根據(jù)各粒徑微藻序列占比統(tǒng)計(jì)其粒級(jí)結(jié)構(gòu),同時(shí)利用序列數(shù)占比和總?cè)~綠素a含量可測(cè)算某種粒級(jí)微藻的葉綠素a濃度,相關(guān)公式:

式中:DBi為某粒級(jí)微藻的葉綠素 a濃度,μg/L;NBi為總?cè)~綠素a濃度,μg/L;DC為某粒級(jí)微藻的序列數(shù);NC為所有微藻的序列數(shù).

物種生物量?jī)?yōu)勢(shì)度（Y）表示微藻群落中某一物種質(zhì)量所占的優(yōu)勢(shì)程度:

式中:nx為第x種微藻種類的OTUs數(shù),N為OTUs總數(shù),fx為第x種微藻種類在各樣品中出現(xiàn)的頻率.

本文的小、中、大粒徑微藻分別代指微微型藻類（0.22～3μm）、微型藻類（3～20μm）及小型藻類（＞20μm）.

對(duì)上述公式計(jì)算、數(shù)據(jù)分析、分布餅圖繪制均通過(guò)WPS Office、SPSS 19.0、ARGIS10.2軟件完成.

2 結(jié)果

2.1 真核微藻各粒級(jí)優(yōu)勢(shì)種演替規(guī)律

黃海北部各粒級(jí)微藻第一優(yōu)勢(shì)種及優(yōu)勢(shì)度見表1,主要真核微藻粒級(jí)名錄見表2（各站位所獲得的序列數(shù)優(yōu)勢(shì)度超過(guò)0.1%的種類）.參與統(tǒng)計(jì)的真核微藻總生物量占總檢出真核微藻生物量的 97%以上,可代表整個(gè)真核微藻群落用于粒級(jí)結(jié)構(gòu)分析.

表1 各粒級(jí)微藻第一優(yōu)勢(shì)種及優(yōu)勢(shì)度Table 1 The first dominant species and dominant degree of microalgae in each grain size

表2 主要微藻粒級(jí)名錄Table 2 The granulation of dominant species of microalgae

其中,小粒級(jí)微藻春季細(xì)小微胞藻、融合微胞藻、曼吉尼刺囊甲藻在小粒級(jí)微藻群落中生物量?jī)?yōu)勢(shì)度較高,分別為 0.183、0.159、0.111;夏季細(xì)小微胞藻、金牛微球藻、青綠藻生物量?jī)?yōu)勢(shì)度較高,分別為0.290、0.229、0.121;秋季金牛微球藻、曼吉尼刺囊甲藻、細(xì)小微胞藻生物量?jī)?yōu)勢(shì)度較高,分別為0.488、0.156、0.120.綜合來(lái)看細(xì)小微胞藻和金牛微球藻在小粒級(jí)微藻群落中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì),春夏秋季演替規(guī)律由細(xì)小微胞藻占優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)為金牛微球藻控制生態(tài)位.由于小粒級(jí)微藻粒徑較小,細(xì)胞中 rDNA的拷貝數(shù)較少,推測(cè)其數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)度在整個(gè)微藻群落中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì).

中粒級(jí)微藻春季劇毒卡爾藻和三葉原甲藻在中粒級(jí)微藻群落中生物量占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì),優(yōu)勢(shì)度分別為0.429、0.141;夏季劇毒卡爾藻、蟲黃甲藻、三葉原甲藻生物量?jī)?yōu)勢(shì)度較高,分別為0.450、0.132、0.095;秋季劇毒卡爾藻和三葉原甲藻生物量?jī)?yōu)勢(shì)度較高,分別為0.619、0.106.綜合來(lái)看各季節(jié)劇毒卡爾藻在中粒級(jí)微藻群落中一直占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì).

大粒級(jí)微藻春季柔弱幾內(nèi)亞藻、北極多甲藻、矮小短棘藻、中肋海鏈藻、微型裸甲藻在大粒級(jí)微藻群落中生物量?jī)?yōu)勢(shì)度較高,分別為0.330、0.181、0.120、0.119、0.105;夏季平野亞歷山大藻和紅色赤潮藻生物量?jī)?yōu)勢(shì)度較高,分別為0.574、0.103;秋季多紋膝溝藻生物量占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì),優(yōu)勢(shì)度為0.882.大粒級(jí)微藻優(yōu)勢(shì)種在各季節(jié)演替較大,分別由不同種類占據(jù)主要生態(tài)位.

綜合整個(gè)真核微藻種群優(yōu)勢(shì)分析,春季由中粒徑的劇毒卡爾藻占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì),占比 21.3%,其他微藻占比均小于 7%;夏季由大粒徑的平野亞歷山大藻占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì),占比23.6%,其他微藻占比均小于11%;秋季由大粒徑的多紋膝溝藻占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì),占比高達(dá)56.6%,其他微藻占比均小于 11%.由此可見,雖然整個(gè)微藻群落由大粒級(jí)微藻控制生態(tài)位,但都是有毒的甲藻,對(duì)黃海北部增養(yǎng)殖的貝類貝毒累積風(fēng)險(xiǎn)較高.

2.2 真核微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)特征

真核微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示,春季小粒級(jí)微藻組成分布在 27%～54%,平均（39±6）%,中粒級(jí)微藻組成分布在25%～67%,平均51±8%,大粒級(jí)微藻組成分布在 6%～22%,平均（11±2）%（圖 2a）.

夏季小粒級(jí)微藻組成分布在 8%～72%,平均（40±18）%,中粒級(jí)微藻組成分布在 2%～64%,平均（24±14）%,大粒級(jí)微藻組成分布在 8%～84%,平均（36±26）%,各站位分布差異比較大（圖2b）.

秋季小粒級(jí)微藻組成分布在 1%～89%,平均（26±19）%,中粒級(jí)微藻組成分布在 1%～34%,平均（13±7）%,大粒級(jí)微藻組成分布在 9%～99%,平均（62±18）%,各站位分布差異比較大（圖2c）.

圖2 春、夏、秋季真核微藻粒級(jí)組分Fig.2 Size fractions of eukaryotic microalgae in spring,summer and autumn

整體而言,黃海北部春季真核微藻以中、小粒級(jí)為主,各站位粒級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)比較均衡,整體生物量較高（圖3a）,小、中、大粒級(jí)微藻比例為39:51:11;夏季以小、大粒級(jí)為主,各站位粒級(jí)結(jié)構(gòu)波動(dòng)較大,整體生物量較低,小粒級(jí)微藻主要分布在近岸海域,大粒級(jí)微藻主要分布在離岸海域（圖 3b）,小、中、大粒級(jí)微藻比例為 40:24:36;秋季除鴨綠江口附近海域以小粒級(jí)微藻為主外,其他區(qū)域主要以大粒級(jí)為主,各站位粒級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)比較均衡,整體生物量有所回升（圖 3c）,小、中、大粒級(jí)微藻比例為26:13:62.

圖3 春、夏、秋季真核微藻粒級(jí)生物量分布Fig.3 Distribution of size biomass of eukaryotic microalgae in spring、summer and autumn

2.3 真核微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)與環(huán)境因素關(guān)聯(lián)

春、夏、秋季黃海北部真核微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)系數(shù)見表 3.其中,春季與小粒級(jí)微藻生物量顯著正相關(guān)的環(huán)境因素有懸浮物和活性硅酸鹽,顯著負(fù)相關(guān)的有水深、重金屬汞、鹽度、砷,其中與水深、重金屬汞相關(guān)極顯著;與中粒級(jí)微藻生物量顯著正相關(guān)的環(huán)境因素有懸浮物、活性硅酸鹽、化學(xué)需氧量、硝酸鹽、無(wú)機(jī)氮,其中與懸浮物、活性硅酸鹽相關(guān)極顯著,顯著負(fù)相關(guān)的有水深、鹽度、重金屬汞、鎘,其中與前三項(xiàng)因子相關(guān)極顯著;與大粒級(jí)微藻生物量顯著負(fù)相關(guān)的環(huán)境因素有水深、重金屬汞,達(dá)到極顯著水平,無(wú)顯著正相關(guān)環(huán)境因子.

表3 微藻粒級(jí)組成與環(huán)境因子相關(guān)性Table 3 Correlation between microalgae particle size structure and environmental factors

夏季與小粒級(jí)微藻生物量顯著正相關(guān)的環(huán)境因素有石油類、亞硝酸鹽、無(wú)機(jī)氮、活性硅酸鹽、總氮、總磷、活性磷酸鹽、重金屬銅,其中與石油類、亞硝酸鹽、無(wú)機(jī)氮、活性硅酸鹽、總氮相關(guān)極顯著,顯著負(fù)相關(guān)的有水深、pH值、鹽度、重金屬鉛,其中與水深、pH值、鹽度相關(guān)極顯著;與中粒級(jí)微藻生物量顯著正相關(guān)的環(huán)境因素有溶解氧、石油類、亞硝酸鹽、無(wú)機(jī)氮、總氮、活性硅酸鹽和重金屬鋅、銅,其中與溶解氧、石油類、亞硝酸鹽、無(wú)機(jī)氮、總氮相關(guān)極顯著,顯著負(fù)相關(guān)的有水深、pH值、鹽度和重金屬鉛,其中與前三項(xiàng)因子相關(guān)極顯著;與大粒級(jí)微藻生物量顯著正相關(guān)的環(huán)境因素有亞硝酸鹽、無(wú)機(jī)氮、總氮、石油類,其中與亞硝酸鹽相關(guān)極顯著,無(wú)顯著負(fù)相關(guān)環(huán)境因子.

秋季與小粒級(jí)微藻生物量顯著正相關(guān)的環(huán)境因素有重金屬汞、砷,其中與重金屬汞相關(guān)極顯著,顯著負(fù)相關(guān)的有水深、pH值、鹽度;與中粒級(jí)微藻生物量顯著正相關(guān)的環(huán)境因素有溶解氧、懸浮物、亞硝酸鹽、氨氮、無(wú)機(jī)氮、總氮、活性硅酸鹽、化學(xué)需氧量和重金屬鋅、銅,其中除了化學(xué)需氧量和重金屬銅,與其他因子相關(guān)極顯著,與砷極顯著負(fù)相關(guān);與大粒級(jí)微藻生物量顯著正相關(guān)的環(huán)境因素有懸浮物、化學(xué)需氧量、石油類、亞硝酸鹽、活性硅酸鹽、無(wú)機(jī)氮、總氮、溶解氧和重金屬銅,其中與懸浮物、化學(xué)需氧量、石油類、亞硝酸鹽、活性硅酸鹽相關(guān)極顯著,無(wú)顯著負(fù)相關(guān)環(huán)境因子.

總體來(lái)看,水深、pH值、鹽度、無(wú)機(jī)氮、總氮、活性硅酸鹽及部分重金屬與真核微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)演變顯著相關(guān),直接影響不同粒級(jí)微藻的時(shí)空變動(dòng).

3 討論

3.1 真核微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)特征分析

本海域相關(guān)研究主要集中在長(zhǎng)海縣海域,2018年大長(zhǎng)山島臨近海域小粒徑真核微藻生物量組成春季為86%,夏季為52%,秋季為20%[16].本研究2019年長(zhǎng)?？h海域小粒徑真核微藻生物量組成春季為38%,夏季為 72%,秋季為 39%.出現(xiàn)的差異主要是春季優(yōu)勢(shì)種發(fā)生演替,2018年春季優(yōu)勢(shì)種為抑食金球藻,生物量占41%,2019年春季優(yōu)勢(shì)種為細(xì)小微胞藻,生物量占18%,而抑食金球藻生物量?jī)H占9%.夏、秋季優(yōu)勢(shì)種 2個(gè)年度均為細(xì)小微胞藻和金牛微球藻.吳文廣利用葉綠素a分級(jí)法發(fā)現(xiàn)2015年該海域秋季小粒徑（＜2μm）微藻生物量占 2%,中粒徑（2～20μm）占 65%,大粒徑（＞20μm）占 33%[3].由于葉綠素 a 分級(jí)法測(cè)算微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)誤差較大,可能會(huì)嚴(yán)重低估小粒徑微藻的生物量組成[9,16],但也不排除調(diào)查時(shí)優(yōu)勢(shì)種演替及環(huán)境因子不同而造成的差異.

當(dāng)然,利用測(cè)序所得的序列數(shù)比例表征生物量占比也存在偏差,但該方法與葉綠素 a分級(jí)法相比更接近實(shí)際,如在褐潮暴發(fā)微微型藻類占優(yōu)勢(shì)的區(qū)域葉綠素a分級(jí)法卻顯示微型藻類組成較高[24-26].

3.2 敏感微藻分布與貝類養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)分析

濾食性貝類主要攝食餌料微藻,而微藻營(yíng)養(yǎng)（粒徑大小）及毒性直接影響貝類生長(zhǎng)與品質(zhì)安全.本研究在黃海北部海域共發(fā)現(xiàn) 16種潛在褐潮微藻（＜3 μm 小粒徑微藻）,其中金牛微球藻和抑食金球藻曾在渤海海域引發(fā)褐潮[19],并且這 2種褐潮微藻均會(huì)影響貝類攝食[25-26],濾食性貝類增養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)較高[27].長(zhǎng)?？h是我國(guó)蝦夷扇貝主產(chǎn)區(qū),近些年出現(xiàn)的大規(guī)模死亡現(xiàn)象可能與該海域餌料微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變有關(guān)[16],關(guān)于微藻粒級(jí)小型化機(jī)制有待于進(jìn)一步研究.另外,本研究海域雖然大粒徑真核微藻在個(gè)別站位優(yōu)勢(shì)度較高,尤其在秋季占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),但主要優(yōu)勢(shì)種均為有毒甲藻,如亞歷山大藻含有麻痹性貝毒,多紋膝溝藻和紅色赤潮藻含有溶血毒素,具刺膝溝藻含有蝦夷扇貝毒素,以及中粒徑優(yōu)勢(shì)種劇毒卡爾藻,嚴(yán)重影響著增養(yǎng)殖貝類的食用安全[28].

3.3 微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)的環(huán)境影響因素

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),大長(zhǎng)山島海域與微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)演替相關(guān)的環(huán)境因子主要為總氮、總磷、活性硅酸鹽等[16],本研究也發(fā)現(xiàn)這幾種因子與微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)演替顯著相關(guān).還有研究發(fā)現(xiàn)無(wú)機(jī)氮是影響秋季獐子島海域微藻生長(zhǎng)和群落結(jié)構(gòu)的主要因子,而硅酸鹽可能成為影響大粒徑微藻（＞20μm）生長(zhǎng)的重要因子[3],與本研究結(jié)論也基本一致.雖然各研究時(shí)期粒級(jí)結(jié)構(gòu)不盡相同,但與環(huán)境因子關(guān)聯(lián)結(jié)果總體一致.

由于調(diào)查海域站位間距較大,水深、pH值、鹽度等有所差異,對(duì)中、小粒級(jí)微藻分布影響顯著,但都是負(fù)向影響.已有研究表明,一般自養(yǎng)微藻都喜好無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽[28-29],氮、磷、硅都是微藻生長(zhǎng)必須元素[30],本研究海域無(wú)機(jī)氮、總氮、活性硅酸鹽對(duì)微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)也都是正向影響,部分重金屬作為微量元素,適量范圍內(nèi)可刺激微藻生長(zhǎng),但超量則起到抑制作用,比如本研究中重金屬汞春季抑制微藻生長(zhǎng),到了秋季則促進(jìn)小粒級(jí)微藻生長(zhǎng),適量銅、鋅可促進(jìn)微藻生長(zhǎng),過(guò)量鉛、鎘、砷可抑制微藻生長(zhǎng),適量石油類也可促進(jìn)微藻快速生長(zhǎng)[31-36].

本研究與微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)演替極顯著相關(guān)的環(huán)境因子對(duì)各站位各季節(jié)微藻群落結(jié)構(gòu)影響較大,各環(huán)境因子之間也相互耦合關(guān)聯(lián),水深較淺區(qū)域,營(yíng)養(yǎng)鹽和重金屬含量相對(duì)較高,反之亦然.本研究海域水深較淺海域,小粒級(jí)微藻含量較高,除受環(huán)境因子的上行效應(yīng)影響之外,貝類及浮游動(dòng)物大量攝食的下行效應(yīng)也會(huì)影響微藻的粒級(jí)結(jié)構(gòu)[2].黃海北部海域主要增養(yǎng)殖對(duì)象為雜色蛤、扇貝、牡蠣等濾食性貝類,對(duì)天然餌料微藻需求量較大.雖然鴨綠江、大洋河等每年攜帶陸源氮磷等營(yíng)養(yǎng)鹽入海,但隨著入海河流污染整治,氮磷消減力度加大,海域無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽已呈下降趨勢(shì),對(duì)微藻生物量及粒級(jí)結(jié)構(gòu)影響較大.

4 結(jié)論

4.1 黃海北部真核微藻春季以中（51%）、小粒級(jí)（39%）為主,夏季以小（40%）、大粒級(jí)（36%）為主,秋季以大粒級(jí)（62%）為主.

4.2 小粒徑微藻中金牛微球藻和抑食金球藻曾在渤海引發(fā)褐潮,潛在威脅貝類養(yǎng)殖業(yè).另外有毒甲藻在該海域中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì),中粒徑的劇毒卡爾藻在春夏秋季優(yōu)勢(shì)明顯,優(yōu)勢(shì)度在 0.4以上,貝毒累積風(fēng)險(xiǎn)較高.

4.3 水深、pH值、鹽度、無(wú)機(jī)氮、總氮、活性硅酸鹽及部分重金屬等環(huán)境因素對(duì)黃海北部真核微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)影響較大.