豬抗沙門氏菌免疫應(yīng)答研究進(jìn)展

趙 歌，胡茂志*，葛浩杰，孟 闖，焦新安，潘志明*

(1.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子(動(dòng)物源)控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009；4.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009)

沙門氏菌(Salmonella)是一種重要的人獸共患病病原菌。流行病學(xué)研究表明，豬源的優(yōu)勢血清型有鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium,STM)和豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis,SCS)，它們污染的豬肉制品是引發(fā)人類沙門氏菌感染的主要來源[1]。沙門氏菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)的存活可誘發(fā)敗血癥，這不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失，而且嚴(yán)重影響人類健康。豬既可用于研究沙門氏菌的致病機(jī)制，也是疫苗研發(fā)的理想模型。據(jù)報(bào)道，在豬抗沙門氏菌感染免疫過程中，細(xì)胞免疫在清除病原體并維持穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[2]。因此，了解豬對沙門氏菌感染的免疫應(yīng)答規(guī)律有助于沙門氏菌病的防控。本文綜述了豬的免疫系統(tǒng)、沙門氏菌感染豬引起的天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答，以期為抗沙門氏菌感染的免疫學(xué)研究提供參考。

1 豬的免疫系統(tǒng)

1.1 豬的免疫系統(tǒng)組成

豬免疫系統(tǒng)主要由免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子組成，具有免疫防御和免疫調(diào)控作用。根據(jù)分化的早晚和功能不同，免疫器官可以分為中樞免疫器官和外周免疫器官。中樞免疫器官包括骨髓和胸腺。骨髓是典型的初級淋巴器官，是淋巴細(xì)胞發(fā)育的場所。胸腺位于胸骨后區(qū)，是研究淋巴細(xì)胞發(fā)育的良好模型，胸腺上皮細(xì)胞負(fù)責(zé)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化。外周免疫器官是成熟淋巴細(xì)胞定居的場所，也是產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要部位之一，包括淋巴結(jié)、脾臟、黏膜相關(guān)淋巴組織等。在機(jī)體組織中，體液通過傳入淋巴管從組織輸送到淋巴結(jié)。豬脾臟對過濾某些細(xì)菌(如肺炎球菌)至關(guān)重要，也是目前醫(yī)學(xué)研究脾臟再生的極佳模型[3]。

免疫細(xì)胞在抗感染過程中發(fā)揮以下重要作用：①在天然免疫過程中，上皮細(xì)胞能夠?qū)Ω鞣N病原體產(chǎn)生反應(yīng)，分泌干擾素(interferon,IFN)和趨化性/炎性細(xì)胞因子，阻止病原體的復(fù)制并參與免疫細(xì)胞的募集和活化；②巨噬細(xì)胞(Macrophage,Mφ)可以呈遞抗原和分泌炎性細(xì)胞因子。豬Mφ一般為CD172a+、CD1+/-、CD4-、CD11R1-、CD14+/-、CD16+、MHCⅡlow、CD80/86low[4]。另外，CD163也可以作為Mφ的標(biāo)志[4]；③樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)分為漿細(xì)胞樣DC(plasmacytiod DC,pDC)和經(jīng)典DC(classical DC,cDC)。不同的DC亞型，其表型不同。豬血液中DC為CD13+和CD14-。淋巴組織中的DC、Mφ和B細(xì)胞的功能和表型存在重疊。④多形核中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)是主要的天然吞噬細(xì)胞。據(jù)報(bào)道，豬鏈球菌2型可以激活豬PMN分泌IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子[5]；⑤血液中自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞約占總淋巴細(xì)胞的1%～24%。根據(jù)NKp46的表達(dá)，可以將豬NK細(xì)胞分為NKp46-、NKp46+和NKp46high3個(gè)亞群。豬NK細(xì)胞在防御病原體感染過程中發(fā)揮重要作用。如在豬異形孢子蟲感染期間，NK細(xì)胞數(shù)量增加[6]。

1.2 與人類和小鼠的差異

與人類相比，豬的免疫系統(tǒng)在組織結(jié)構(gòu)方面主要有3個(gè)特點(diǎn)：淋巴結(jié)倒置、兩種類型的派伊爾氏結(jié)(Peyer's patches,PPs)，以及依賴妊娠母豬乳腺分泌物的被動(dòng)免疫[7]。

與其他哺乳動(dòng)物不同，豬淋巴結(jié)皮質(zhì)和髓質(zhì)呈現(xiàn)倒置分布。即皮質(zhì)區(qū)可以出現(xiàn)在被膜和髓質(zhì)之間的外周區(qū)域，也可以分布在髓質(zhì)區(qū)內(nèi)側(cè)的中央?yún)^(qū)域[8]。

腸黏膜上皮和腸道相關(guān)淋巴組織(gut associated lymphatic tissue,GALT)是抵抗病原體的重要物理和免疫屏障，PPs是其重要的組分之一，沿回腸和空腸段分布，分為回腸PPs(ileum PPs,IPPs)和空腸PPs(jejunum PPs,JPPs)。人類IPPs和JPPs均為多個(gè)分離的濾泡結(jié)構(gòu)，豬和反芻動(dòng)物等的JPPs與人類相似，但I(xiàn)PPs則是沿著回腸的連續(xù)結(jié)構(gòu)。JPPs和IPPs都是啟動(dòng)B 細(xì)胞和提供獲得性免疫應(yīng)答的主要場所，并與腸道微生物菌群密切接觸，但二者在細(xì)胞數(shù)量、基因表達(dá)和與細(xì)胞免疫相關(guān)的受體調(diào)控等方面存在明顯區(qū)別[9]。與JPPs相比，豬IPPs中的B細(xì)胞相對較多，而T細(xì)胞較少。據(jù)報(bào)道，豬IPPs和JPPs中的B細(xì)胞分別約占90%和45%，腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph node,MLN)中的B細(xì)胞約占35%。另外，豬的IPPs和JPPs在免疫相關(guān)基因[10]和受體的表達(dá)方面也存在差異。這種差異可能與它們在小腸的位置不同有關(guān)。此外，GALT的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果揭示，豬JPPs和IPPs之間的免疫組學(xué)存在差異，與JPPs相比，豬IPPs中T細(xì)胞活化信號下調(diào)，而B細(xì)胞受體(B cell receptor,BCR)信號上調(diào)。例如，IPPs中介導(dǎo)T細(xì)胞區(qū)形成的CCR7及其配體CCL21、募集IgA分泌型細(xì)胞(T細(xì)胞依賴型)的CCR10、調(diào)控T細(xì)胞活化的CTLA4的表達(dá)水平較低；參與初始CD4+T細(xì)胞分化的調(diào)控因子的表達(dá)水平較低；轉(zhuǎn)錄因子FOXP3(參與誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化)、GATA3(參與Th2分化)、編碼T-bet的STAT4和TBX21(參與Th1分化)以及編碼Rorγt的RORC(參與Th17分化)等的表達(dá)水平較低，而BCL6(參與濾泡Th細(xì)胞的分化，促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體)高表達(dá)；ICOS(濾泡Th細(xì)胞的表面標(biāo)志)、CCR7-CCL21(介導(dǎo)PPs濾泡的形成)、TNFSF11(參與GALT的發(fā)育)的表達(dá)水平較低。而JPPs中CCR9(促進(jìn)IgA分泌的T細(xì)胞歸巢到小腸)的表達(dá)水平較高。這些數(shù)據(jù)均支持可以用豬的血液替代組織來進(jìn)行相關(guān)功能的研究[9]。

母源抗體可以為新生仔豬提供保護(hù)性被動(dòng)免疫。人類是血絨膜胎盤，母體血液直接與胎兒絨毛膜接觸，胎兒從而獲得被動(dòng)免疫。而豬是上皮絨膜胎盤，妊娠母豬體內(nèi)的抗體不能穿過胎盤，新生仔豬主要通過初乳和乳汁等獲得母源抗體。母源抗體的保護(hù)作用是由體液免疫、被動(dòng)黏膜免疫和細(xì)胞免疫等諸多因素介導(dǎo)的[7]。

2 沙門氏菌誘導(dǎo)的天然免疫

天然免疫在抗腸道病原體和誘導(dǎo)獲得性免疫應(yīng)答方面至關(guān)重要，是機(jī)體抵抗病原微生物感染的重要屏障之一。

豬口服沙門氏菌后，細(xì)菌進(jìn)入腸道，在扁桃體、MLN和PPs中分別引起不同的免疫反應(yīng)。對機(jī)體而言，GALT包括PPs、MLN和散布在上皮細(xì)胞與固有層之間的淋巴細(xì)胞，在腸道局部免疫中扮演著重要角色。沙門氏菌可以逃避豬扁桃體的免疫防御作用，在其中復(fù)制和定殖，并進(jìn)一步感染MLN和PPs。

機(jī)體的天然免疫主要是通過激活免疫相關(guān)受體、天然免疫細(xì)胞和分泌細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)的。在病原體第一次入侵時(shí)，豬上皮細(xì)胞通過模式識(shí)別受體(patern recognition receptor,PRR)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式，分泌IFN和炎性細(xì)胞因子，阻止病原體的復(fù)制，并募集和活化免疫細(xì)胞。豬Mφs、PMNs、DCs和NKs受到募集并到達(dá)炎癥部位，發(fā)揮細(xì)胞免疫功能。如STM感染24 h和48 h后，豬體內(nèi)TLR2和TLR4的表達(dá)上調(diào)[11]。豬Mφs會(huì)產(chǎn)生吲哚胺2-3-二加氧酶(indoleamine 2-3-dioxygenase)，誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和 IL-12等，進(jìn)一步抑制沙門氏菌的存活和增殖[12]。NKs細(xì)胞可殺死靶細(xì)胞，并產(chǎn)生細(xì)胞因子(如IFN-γ)來阻止病原體的傳播。但過多的細(xì)胞因子也可能會(huì)引起敗血癥，從而破壞正常的細(xì)胞功能。研究表明，抗炎細(xì)胞因子和藥物可抑制由沙門氏菌引起的過度炎癥反應(yīng)。如黃芪多糖可通過調(diào)節(jié)TLR4信號通路相關(guān)基因的表達(dá)以降低促炎因子IL-1β和TNF-α的分泌，減少機(jī)體免疫應(yīng)激反應(yīng)[13]。

免疫組織和免疫細(xì)胞表面的相關(guān)蛋白和受體也參與免疫調(diào)節(jié)，并抑制沙門氏菌存活。存在于黏膜組織中的CCL28蛋白和表面活性蛋白D對沙門氏菌具有抗菌活性，為腸道提供免疫保護(hù)[14]。TREM受體在中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上表達(dá)。它可以誘導(dǎo)DCs表達(dá)炎性細(xì)胞因子和黏附分子，促進(jìn)其成熟，參與免疫調(diào)節(jié)。據(jù)報(bào)道，豬口服感染STM 8 h和24 h后，其骨髓細(xì)胞TREM-1的表達(dá)上調(diào)[15]。

3 沙門氏菌誘導(dǎo)的獲得性免疫

獲得性免疫以高度專業(yè)化和系統(tǒng)化的組織方式為機(jī)體提供免疫保護(hù)。由于入侵的沙門氏菌可以通過免疫逃逸和表達(dá)毒力因子提高對宿主細(xì)胞殺菌作用的抵抗力。因此，通過啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答，才能有效殺滅細(xì)菌。

3.1 T細(xì)胞的作用

在脊椎動(dòng)物中，根據(jù)T細(xì)胞受體的類型，可以將T細(xì)胞分為αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞兩個(gè)亞群。αβT細(xì)胞最終分化為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。這些細(xì)胞能夠產(chǎn)生IFN-γ并在炎癥部位介導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。與家禽不同的是，豬具有大量的CD4+CD8+T細(xì)胞，其功能尚不完全清楚，據(jù)報(bào)道，此細(xì)胞群體具有部分記憶細(xì)胞的功能[16]。

當(dāng)沙門氏菌被機(jī)體識(shí)別后，首先激活天然免疫，DCs和B細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)揮抗原呈遞作用來刺激獲得性免疫應(yīng)答。CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分別通過分泌細(xì)胞因子和發(fā)揮細(xì)胞毒活性殺死靶細(xì)胞。此外，與之相關(guān)的信號分子在抗沙門氏菌感染方面也發(fā)揮重要作用。研究表明，TLR信號接頭髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88)促進(jìn)T細(xì)胞增殖和Th1類的細(xì)胞分化[17]。在細(xì)菌被清除之前，CD4+T細(xì)胞對Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的SseJ蛋白具有持續(xù)的免疫作用[18]。CD4+T細(xì)胞也與天然免疫有關(guān)，可與中性粒細(xì)胞協(xié)同作用，因而可以輕度降低肝臟和脾臟中沙門氏菌的載量[19]。Th17細(xì)胞能分泌抗菌肽，參與抗沙門氏菌感染[20]。T細(xì)胞作為獲得性免疫的重要武器，它的成熟、激活、增殖、分化等受到諸多信號通路的嚴(yán)密調(diào)控[21]。研究表明，豬接種SCS活疫苗后，體內(nèi)IFN-γ+CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的Th1類免疫應(yīng)答在抗感染過程中發(fā)揮免疫保護(hù)作用[22]。

在抗感染過程中，γδT細(xì)胞可充當(dāng)抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cells,APCs)，參與黏膜免疫，并可能與天然免疫和獲得性免疫密切相關(guān)。目前在豬的研究中，γδT細(xì)胞的分布部位及其比例、亞群、受體表達(dá)和在抗感染方面的作用已有比較豐富的數(shù)據(jù)資料。與反芻動(dòng)物和雞等相似，豬具有豐富的在胸腺內(nèi)發(fā)育成熟的γδT細(xì)胞，其在血液中分布較高(約18%～47%)，約占總淋巴細(xì)胞的85%[23]。根據(jù)其CD2和CD8表達(dá)的差異，豬γδT細(xì)胞可分為CD2-CD8-、CD2+CD8-和CD2+CD8+細(xì)胞3個(gè)亞群。不同亞群有不同的歸巢特征和細(xì)胞毒活性。許多γδT細(xì)胞表達(dá)CD25和MHCⅡ類分子，并且抗原刺激后，CD25+、CD11b+、SWC1+、SWC7+γδT細(xì)胞的數(shù)量增加。此外，選擇性抑制劑AR-A014418具有免疫調(diào)節(jié)功能，可以抑制γδT細(xì)胞的凋亡，并能增強(qiáng)其體外增殖和殺傷活性[24]。研究表明，在豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染過程中，小腸上皮內(nèi)CD8+γδT細(xì)胞參與細(xì)菌清除[25]。

3.2 B細(xì)胞的作用

根據(jù)表型和功能的差異，B細(xì)胞分為B1和B2細(xì)胞。B1細(xì)胞又分為B1a或B1b細(xì)胞，B2細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)分為邊緣區(qū)B(MZ-B)和濾泡B(FOB)細(xì)胞[26]。與B1細(xì)胞在天然免疫中起作用不同，B2細(xì)胞執(zhí)行獲得性體液免疫功能。

成熟的初始B細(xì)胞能識(shí)別抗原、活化、增殖并分化成漿細(xì)胞，通過合成和分泌抗體而發(fā)揮清除病原體的作用[27]。關(guān)于豬B細(xì)胞的相關(guān)研究，主要包括B細(xì)胞發(fā)育途徑、與小鼠B細(xì)胞的異同點(diǎn)、促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化的細(xì)胞因子以及在抗感染中的免疫功能等方面。在B細(xì)胞的發(fā)育途徑中，IgH/IgLκ/IgL λ重排的各自順序可能在不同物種中以不同且獨(dú)立的方式進(jìn)化。在小鼠和人，IgH和IgL重排順序?yàn)镮gH→IgLκ→IgLλ。而豬的模式為IgLκ→IgLλ→IgH→IgLκ→IgLλ[28]。研究表明，豬CD5+B細(xì)胞與小鼠B1細(xì)胞的組織分布相似，但功能不同[29]。細(xì)胞因子是對病原體和其他調(diào)節(jié)或介導(dǎo)免疫反應(yīng)(如炎癥等)的抗原產(chǎn)生反應(yīng)的蛋白質(zhì)。例如，IL-4、IL-5、IL-13和IL-21是B細(xì)胞生長因子，可刺激B細(xì)胞分化[30]。細(xì)胞因子可刺激B細(xì)胞中抗體亞型的轉(zhuǎn)換，有利于輔助性T細(xì)胞的分化以及吞噬細(xì)胞殺傷作用的激活[31]。B細(xì)胞不僅可以產(chǎn)生特異性抗體來殺滅細(xì)菌，同時(shí)也可以作為APCs參與CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。當(dāng)同種抗原再一次刺激時(shí)，可迅速啟動(dòng)免疫記憶并激活效應(yīng)B細(xì)胞快速分泌特異性抗體殺滅病原體，以維持機(jī)體健康。如果B細(xì)胞缺陷或者B細(xì)胞功能受損，會(huì)嚴(yán)重影響機(jī)體的抗感染免疫防御，包括抗原呈遞作用、Th1記憶細(xì)胞的活化以及T細(xì)胞的功能。據(jù)報(bào)道，B細(xì)胞缺陷型小鼠(Igh-6-/-或Igμ-/-)的抗感染能力的缺失和免疫血清補(bǔ)充后小鼠免疫力的重建都證明B細(xì)胞在二次感染中的作用[32]。

綜上所述，從豬源疫病的防控到人類疾病的研究，豬都是較好的動(dòng)物模型。因此，了解豬的免疫系統(tǒng)及其對病原菌感染的免疫應(yīng)答，將有助于對疾病的致病機(jī)理和免疫防控的研究。