犬和貓腸道菌群研究進(jìn)展

鄭曉蔓，林 琳，唐陸平，劉玉清

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528000)

犬和貓腸道內(nèi)寄居著大量復(fù)雜的微生物群(包括細(xì)菌、真菌、病毒和原生動物等)，構(gòu)成了腸道微生態(tài)系統(tǒng)。腸道微生物的功能包括防御非寄居腸道病原菌，有助于宿主腸道上皮和免疫系統(tǒng)的健康發(fā)育，通過其發(fā)酵和代謝活性為宿主提供營養(yǎng)。大量研究證實，犬和貓腸道疾病的發(fā)生與腸道微生物菌群改變有關(guān)[1-2]。因此，對犬和貓腸道微生物結(jié)構(gòu)組成和腸道微生物如何影響寵物健康的研究是非常必要的。

過去，腸道微生物學(xué)及微生物對宿主健康的影響的知識大多通過傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)獲得。而機(jī)體內(nèi)只有不到1%微生物能在實驗室內(nèi)被培養(yǎng)和研究[3]。由于缺乏合適的研究方法，嚴(yán)重阻礙了腸道微生物研究進(jìn)展。

細(xì)菌基因包含有高度保守的核苷酸堿基序列，根據(jù)細(xì)菌這一特點，通過細(xì)菌16S rRNA 基因的分子生物學(xué)方法能對腸道復(fù)雜微生物及其基因進(jìn)行鑒定和特性描述。近年來隨著高通量DNA測序技術(shù)、代謝組學(xué)技術(shù)及宏基因組學(xué)等新的分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合新的生物信息學(xué)的發(fā)展，為犬和貓腸道微生物的研究提供了極大的便利。論文從犬和貓腸道微生物的分布組成特點、犬和貓腸道共生微生物形成的影響因素以及腸道菌群結(jié)構(gòu)改變與犬和貓急慢性腸病的關(guān)系方面綜述了近年來國內(nèi)外研究取得的進(jìn)展。

1 健康犬和貓腸道微生物組成

1.1 犬和貓腸道微生物菌群的組成

1.1.1 犬腸道細(xì)菌群組成與分布 運用傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)，早期研究報道顯示，健康犬小腸內(nèi)細(xì)菌載量為102CFU/g～105CFU/g，另一些研究則發(fā)現(xiàn)犬小腸內(nèi)細(xì)菌數(shù)量可高達(dá)109CFU/g。犬結(jié)腸內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量顯著高于小腸，數(shù)量為108CFU/g～1011CFU/g[4]。

大多數(shù)犬腸道微生物研究采用16S rRNA基因測序方法檢測分析糞便或結(jié)腸樣本中微生物群組成和分布。研究發(fā)現(xiàn)，在腸道不同樣本采集點(即十二指腸、回腸和糞便)，犬腸道微生物組成也存在差異。細(xì)菌從十二指腸轉(zhuǎn)移到結(jié)腸過程中，細(xì)菌多樣性和細(xì)菌總數(shù)呈普遍增加趨勢。需氧菌和兼性厭氧菌是小腸內(nèi)的優(yōu)勢菌群，而厭氧菌能在大腸內(nèi)良好生長。 運用基于16S rRNA 基因擴(kuò)增-Sanger測序法在6只健康獵犬結(jié)腸微生物菌研究發(fā)現(xiàn)了4種主要的微生物菌群，分別為厚壁菌門(Firmicutes，47.7%)、變形菌門(Proteobacteria，23.3%)、梭桿菌門(Fusobacteria，16.6%)和擬桿菌門 (Bacteroidetes，12.4%)。研究還發(fā)現(xiàn)，從十二指腸至結(jié)腸不同腸道區(qū)域內(nèi)的微生物群組成分布存在差異，梭菌目(Clostridiales)是十二指腸和空腸內(nèi)的優(yōu)勢微生物菌群，而梭桿菌目(Fusobacteriales)和擬桿菌目(Bacteroidales)是回腸和結(jié)腸內(nèi)最豐富的微生物菌群。腸桿菌目(Enterobacteriales)菌類在小腸內(nèi)出現(xiàn)頻率明顯高于結(jié)腸，乳桿菌類(Lactobacillales)在所有腸道內(nèi)都有存在[4]。

運用基于16S rRNA基因測序技術(shù)對健康犬糞便微生物菌群檢測發(fā)現(xiàn)，梭桿菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門(Actinobacteria)和變形菌門是犬糞便中的共顯性菌門[5]。高通量測序技術(shù)對健康犬盲腸微生物菌群研究結(jié)果顯示，犬盲腸微生物菌群中優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、梭桿菌門和變形菌門[5]。

Omatsu T等[6]基于16S rRNA基因條形碼分析技術(shù)對21只健康貴賓犬的糞便微生物多樣性進(jìn)行了分析研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糞便微生物中厚壁菌門、變形菌門和梭桿菌門是優(yōu)勢菌門類群，占糞便微生物總量的93.4%以上。在科水平上，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、擬桿菌科(Bacteroidacea)和毛螺菌科( Lachnospiraceae)是優(yōu)勢微生物菌群。

1.1.2 貓腸道細(xì)菌群組成與分布 與人類和其他哺乳動物相比，雖然貓并不主要通過微生物發(fā)酵獲得能量，但平衡而穩(wěn)定的腸道微生物菌群依然對于維持貓的腸道健康是必不可少的。

大量研究表明，與其他哺乳動物相似，貓腸道內(nèi)優(yōu)勢菌門包括厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門[7]。然而有關(guān)文獻(xiàn)報道的這些菌門類菌群比例在不同品種及個體間差異很大。

基于鳥槍法454-焦磷酸DNA測序技術(shù)的一項研究了評測了健康成年貓糞便微生物組成。結(jié)果顯示，優(yōu)勢菌門包括厚壁菌門( 36%～50%)、 擬桿菌門(24%～36%)和變形菌門(11%～12%)。細(xì)菌是貓糞便中優(yōu)勢微生物，比例為99%，其次真核生物和真菌，分別為1%和0.05%[8]。

研究表明，犬和貓腸道微生物優(yōu)勢菌門與人類和嚙齒動物模型相似，都是厚壁菌門和擬桿菌門。關(guān)鍵的不同之處是犬和貓腸道菌群(糞便或腸道)中的優(yōu)勢梭桿菌門，盡管此菌門類菌不是寄居于腸道內(nèi)最大的菌屬，但它常占10%或更多的序列。

1.2 犬和貓腸道其他微生物群的組成與分布

除細(xì)菌外，犬和貓腸道也是其他微生物包括真菌、病毒和寄生蟲的寄居地，但這些微生物、寄生蟲與宿主和細(xì)菌群相互間的復(fù)雜作用尚不明確。

1.2.1 犬和貓腸道真菌的組成與分布 有研究顯示，犬和貓腸道內(nèi)寄居著許多種真菌類微生物，在犬糞便中發(fā)現(xiàn)了多達(dá)40種不同真菌系統(tǒng)發(fā)育型 。

基于宏基因組測序結(jié)果表明，犬和貓糞便樣本中真菌約占犬和貓糞便樣本微生物的2%。

近年運用高通量測序技術(shù)，通過設(shè)計真菌通用引物對犬和貓腸道內(nèi)微生物中的真菌組成進(jìn)行檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，健康犬糞便中優(yōu)勢真菌類群是子囊菌門(Ascomycota，占測序總量的97.9%)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota，測序總量的1.0%)，并且子囊菌門也是在貓腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)的唯一真菌類群[9]。

也有研究報道，在犬腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、球囊菌門(球囊菌門)和接合菌門(Zygomycota)真菌類群，納沙酵母菌屬(Nacaseomyces，76.72%) 或假絲酵母屬(Candida，5.2%)是豐度最高的真菌屬類群。而酵母菌屬(Saccharomyces，58.31%)和曲霉菌屬(Aspergillus，11%)是貓腸道內(nèi)豐度最高的兩類真菌屬類群[10]。

還有研究發(fā)現(xiàn)，犬和貓腸黏膜樣本中真菌DNA含量顯著高于腸腔內(nèi)樣本，這提示某些腸道寄居的真菌可能具有黏膜黏附功能。

1.2.2 犬和貓腸道病毒的組成與分布 有關(guān)犬和貓腸道病毒組成部分的研究較少。運用鳥槍測序法對貓糞便中dsDNA病毒序列檢測結(jié)果顯示，僅有一個噬菌體目類病毒,即有尾噬菌體(Caudovirales)[11]。

研究發(fā)現(xiàn)，貓腸道內(nèi)病毒約占腸道微生物序列的0.07%，大部分病毒屬于有尾噬菌體目?？偣灿?8個科和42個屬[10]。

1.2.3 犬和貓腸道古細(xì)菌的組成與分布 研究發(fā)現(xiàn)，貓腸道內(nèi)古生菌占腸道微生物序列的0.77%，由5個菌門[泉古菌門(Crenarchaeota)、廣古菌門(Euryarchaeota)、初古菌門(Korarchaeota)、納古菌門(Nanoarchaeota)和奇古菌門(Thaumarchaeota)]和12個綱組成[10]。

有關(guān)犬和貓腸道微生物組成的研究結(jié)果在不同研究報道間存在顯著差異，這可能是由于試驗方法(如樣本采集及處理、DNA或RNA提取方式、DNA擴(kuò)增操作步驟、引物設(shè)計及測序方法)的不同所致。

目前，雖然基于16S rRNA基因的高通量測序是描述腸道微生物群特性的最有效方法之一，但該法存在難以對總細(xì)菌群中低豐度類菌群進(jìn)行檢測的局限性。因此，檢測犬和貓腸道內(nèi)特異細(xì)菌類群時，應(yīng)聯(lián)合高通量測序和定量PCR等方法來評測這類低豐度菌群。

2 影響犬和貓腸道微生物群組成的因素

研究發(fā)現(xiàn)，許多因素(如年齡、遺傳、日糧結(jié)構(gòu)、個體差異、健康狀態(tài)和生活環(huán)境等)都可能會影響健康犬和貓腸道微生物群的組成與分布[12]。

2.1 年齡對犬和貓腸道微生物群的影響

Alessandri G等[9]為研究年齡相關(guān)犬腸道核心菌群的變化，運用宏基因組學(xué)技術(shù)對4個年齡段犬(0～8月齡幼犬、9月齡～24月齡青年犬、25月齡～96月齡成年犬和大于97月齡老齡犬)糞便樣本中微生物群進(jìn)行了檢測分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，犬腸道核心菌屬包括擬桿菌目(Bacteroidales)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、羅氏菌屬(Roseburia)及梭桿菌屬(Fusobacterium)菌群水平在4個年齡段犬存在顯著差異。成年犬組糞便中梭桿菌屬的相對豐度明顯高于年輕犬組和老齡犬組，分別為28.80%、20.75%、17.58%；老齡犬組羅氏菌屬相對豐度顯著增加；與年輕犬組和成年犬組相比，幼犬糞便中擬桿菌目菌類含量更高。另外，與其他年齡段犬組比，年輕犬糞便中考拉桿菌屬豐度更高。而且，與幼犬組比，成年犬組和老齡犬組犬糞便中雙歧桿菌豐度明顯減少。

Masuoka H等[13]采用細(xì)菌培養(yǎng)和分子生物學(xué)技術(shù)方法調(diào)查了5個不同年齡組(斷奶前、斷奶、年輕、成年和老齡)貓腸道微生物組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，貓腸道微生物存在與年齡相關(guān)的變化，而這種變化特點與人類和犬不同。人類腸道優(yōu)勢菌雙歧桿菌和犬腸道優(yōu)勢菌乳桿菌并不是貓腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌，而腸球菌可能是貓腸道內(nèi)主要乳酸菌。

2.2 日糧結(jié)構(gòu)對犬和貓腸道微生物群的影響

日糧結(jié)構(gòu)也能影響犬的腸道微生物。長時間的禁食導(dǎo)致犬小腸微生物群發(fā)生顯著變化，并且對微生物的代謝功能產(chǎn)生明顯影響。飼喂含纖維日糧也對犬腸道微生物群組成產(chǎn)生影響[14-15]。

近年來，有許多關(guān)于運用高通量DNA測序技術(shù)研究飲食結(jié)構(gòu)對犬和貓腸道微生物群的影響的報道。日糧添加蔗果三糖能促進(jìn)犬糞便微生物內(nèi)乳酸菌增長和增加糞便丁酸的濃度，飼喂低聚果糖日糧能增加犬糞便雙歧桿菌的數(shù)量，對腸道健康起積極促進(jìn)作用[16-17]。

Butowski C F等[18]運用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)研究了3種日糧結(jié)構(gòu)[生肉、生肉加2%纖維(菊粉和纖維素)及商品貓糧]對健康貓腸道微生物群的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，日糧結(jié)構(gòu)對貓腸道31類微生物群分布數(shù)量產(chǎn)生影響。普氏菌屬(Prevotella)是飼喂商品貓糧的貓糞便中優(yōu)勢菌類，梭菌屬(Clostridium)和梭桿菌屬(Fusobacterium)是飼喂生肉貓的糞便中優(yōu)勢微生物群，而普氏菌屬和消化鏈球菌(Peptostreptococcus)是飼喂生肉+纖維日糧貓糞便中的優(yōu)勢微生物群。這一結(jié)果進(jìn)一步表明，不同的日糧結(jié)構(gòu)能影響貓糞便微生物群的組成和代謝。

總之，這些研究表明，與人類相似，日糧攝取能調(diào)節(jié)犬和貓腸道微生物群的組成和活性。然而，需要更多研究關(guān)于日糧結(jié)構(gòu)對犬和貓腸道微生物的影響及健康影響的研究仍需要做更多工作。

2.3 個體因素對犬和貓腸道微生物群的影響

研究表明，每個動物個體擁有獨特的微生物組成譜。Handl S等[11]在屬水平上檢測健康犬和貓糞便微生物群可操作性分類單元(OTUs)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12只犬的已確認(rèn)85個OTUs僅有5個OTUs被檢測到，12只貓的113個OTUs中僅有14個OTUs被檢測到。這一結(jié)果提示腸道微生物組成在犬和貓不同個體間也同樣存在明顯差異。

2.4 遺傳因素對犬和貓腸道微生物群的影響

Hand D 等[19]運用16S rDNA基因擴(kuò)增-454-焦磷酸測序技術(shù)首次研究了許多有親緣關(guān)系(如品種、遺傳)的犬糞便微生物群分布組成特點。結(jié)果顯示，盡管犬群中優(yōu)勢菌屬存在變異性，但與無親緣關(guān)系的犬相比，親緣關(guān)系相近的犬的糞便微生物組成更相似。

2.5 其他因素對犬和貓腸道微生物群的影響

性別、品種等因素也可對犬和貓腸道微生物群組成和分布產(chǎn)生影響。

3 急慢性腸病犬和貓腸道微生物群的變化

與人類研究結(jié)果相似，犬和貓腸道疾病的發(fā)生也與腸道微生物群改變有關(guān)。不但涉及腸道內(nèi)病原菌的入侵，而且腸道微生物參與了宿主腸道內(nèi)許多重要的代謝過程(如膽汁酸代謝和發(fā)酵以及不易消化的碳水化合物和蛋白的利用)[20]。貓的慢性腸病以持續(xù)的腸道疾病癥狀為特征(如嘔吐、腹瀉等)。根據(jù)對不同應(yīng)激源的反應(yīng)，臨床常將犬和貓慢性腸病分為食物反應(yīng)性、抗生素反應(yīng)性或類固醇反應(yīng)性三類。

3.1 急慢性腸病犬腸道微生物群的變化

3.1.1 犬急慢性腹瀉與腸道微生物群的變化 腸道環(huán)境的短期改變(如急性腹瀉)能影響腸道微生物的組成。研究表明，健康犬的糞便微生物菌群明顯不同于腹瀉犬。急性腹瀉患犬腸道微生物多樣性減少，擬桿菌門和糞桿菌屬菌群數(shù)量減少，梭菌屬菌群數(shù)量增加 。同時與健康犬相比，腹瀉犬糞便中丙酸濃度減少，并且轉(zhuǎn)座酶功能基因和甲基受體趨化蛋白水平降低[21]。

腹瀉犬糞便產(chǎn)氣莢膜梭菌、屎腸球菌和糞腸球菌微生物群數(shù)量增加。運用熒光原位雜交技術(shù)對慢性腹瀉患犬糞便優(yōu)勢微生物菌群的檢測結(jié)果表明，與健康犬相比，腹瀉犬糞便擬桿菌屬菌群豐度顯著增加，而乳桿菌-腸球菌微生物群數(shù)量明顯減少[20]。

Minamoto Y等[22]基于Illumina高通量測序技術(shù)和實時定量PCR技術(shù)檢測了健康犬和慢性腸病犬的糞便微生物群的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性腸病犬存在明顯的菌群失調(diào)，腸道細(xì)菌多樣性和豐度菌減少，菌群失調(diào)指數(shù)明顯高于健康犬。

3.1.2 犬炎癥性腸病(IBD)與腸道微生物群的變化 炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)屬于慢性腸病的一種，主要顯示腸道內(nèi)炎癥，不明原因的腸道癥狀，對各種治療藥物不敏感。IBD病理發(fā)生過程尚不明確，但腸道菌群失調(diào)、腸道內(nèi)炎性免疫反應(yīng)和遺傳傾向等因素可能與IBD的發(fā)生有關(guān)。

大量研究表明，IBD犬小腸和糞便微生物菌群發(fā)生明顯改變[23]。Cassmann E等[24]借助內(nèi)窺鏡組織活檢技術(shù)采集慢性腸病和健康犬回腸和結(jié)腸黏膜組織，運用熒光原位雜交技術(shù)調(diào)查了犬慢性腸病時回腸和結(jié)腸黏膜微生物群的組成和黏膜組織結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康犬相比，慢性腸病犬包含有更多的黏膜微生物群，主要由球形梭菌、直腸真桿菌、擬桿菌屬、腸桿菌科及大腸埃希氏菌。黏膜與結(jié)腸黏膜細(xì)菌總量增加與犬IBD臨床癥狀表現(xiàn)的嚴(yán)重程度有關(guān)(P<0.05)。結(jié)果提示，犬慢性腸病的病理發(fā)生與不同的回腸和結(jié)腸黏膜微生物群有關(guān)。

近年來，DNA測序技術(shù)已運用于腸病犬和貓腸道微生物變化的調(diào)查研究中。

Omori M 等[25]運用16S rRNA 基因高通量測序技術(shù)對IBD患犬、腸淋巴瘤患犬及健康犬腸道微生物進(jìn)行了比較研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康犬相比，腸淋巴瘤患犬糞便優(yōu)桿菌科類(Eubacteriaceae)菌群豐度顯著增加；IBD患犬糞便中帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)和卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)菌群比例顯著高于健康犬。這些結(jié)果提示，腸道微生物群失調(diào)與犬腸淋巴瘤及犬IBD相關(guān)。

Blake A B 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺外分泌功能不全(exocrine pancreatic insufficiency，EPI)犬和慢性腸炎(chronic enteropathy，CE)犬糞乳酸含量顯著增加，而糞便中次級膽汁酸的濃度顯著減少。與健康犬相比，胰腺外分泌功能不全EPI犬存在明顯的腸道微生物群失調(diào)，糞便大腸埃希氏菌、乳桿菌及雙歧桿菌菌群的豐度增加，梭桿菌屬和梭菌屬(Clostridiumhiranonis)類菌群的豐度降低，菌群失調(diào)指數(shù)增高。這些代謝產(chǎn)物的變化提示微生物群失調(diào)患犬的腸道功能發(fā)生了改變，進(jìn)一步證明了腸道微生物在犬和貓健康和腸道疾病發(fā)生中的重要作用。

而CE患犬同樣也發(fā)生菌群失調(diào)，菌群失調(diào)指數(shù)明顯高于健康犬。

近年來，有大量關(guān)于人類腸道疾病的宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)研究報道，而有關(guān)犬和貓腸道疾病的宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)研究報道較少。已發(fā)現(xiàn)，IBD病人的功能基因變化(包括氧化應(yīng)激通路的改變和氨基酸生物合成減少)比系統(tǒng)發(fā)育的變化更一致。最近研究發(fā)現(xiàn)，慢性腸道疾病犬和貓也有相似的功能基因變化[27]。

3.2 急慢性腸病貓腸道微生物群的變化

Suchodolski J S等[28]通過16S rRNA基因測序?qū)】岛透篂a貓糞便微生物進(jìn)行了檢測對比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腹瀉患貓糞便中伯克氏菌目(Burkholderiales)、腸桿菌科 (Enterobacteriaceae)及鏈球菌屬和柯林斯氏菌屬(Collinsella)的菌群數(shù)量顯著增加；相反，健康貓糞便中彎曲桿菌目(Campylobacterales)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、巨單胞菌屬(Megamonas)、螺桿菌屬(Helicobacter)、羅氏菌屬(Roseburia)菌群數(shù)量顯著增加。慢性腹瀉貓糞便中擬桿菌門類菌群豐度降低，急性腹瀉貓糞便丹毒絲菌綱(Erysipelotrichi)和乳桿菌屬類菌群豐度降低。結(jié)果提示，健康貓與腹瀉貓糞便微生物組存在顯著差異。

將來應(yīng)對腹瀉貓腸道微生物變化與糞便中微生物代謝產(chǎn)物濃度變化之間是否相關(guān)聯(lián)進(jìn)行更深入的研究。

研究犬和貓腸道微生物組成和代謝變化特點規(guī)律，對于發(fā)現(xiàn)新特異性急慢性腸道疾病生物標(biāo)志物和新治療藥物的開發(fā)具有重要意義。

4 展望

總之，對犬和貓腸道微生物菌群的研究中取得了許多重要進(jìn)展。已經(jīng)證實了腸道菌群在犬和貓急慢性腸道疾病中所起的重要作用，并且最近研究提示腸道微生物群在犬和貓腸道外疾病的病理發(fā)生中也起關(guān)鍵作用。但目前的研究主要聚焦于腸道菌群及腸道微生物組學(xué)研究，而對腸道其他微生物如真菌、病毒的研究較少，而對腸道微生物的代謝組學(xué)研究較少，今后需要加強(qiáng)這一領(lǐng)域的研究。通過發(fā)酵反應(yīng)，腸道微生物能產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物(如乳酸等)，需要更多研究來闡明這些細(xì)菌代謝物對犬和貓健康的影響。研究犬和貓腸道微生物組成和代謝變化特點規(guī)律，對于進(jìn)一步完善和更好地理解腸道微生物與宿主相互之間的復(fù)雜作用機(jī)制，以及利用這些信息改善日糧、發(fā)現(xiàn)新特異性急慢性腸道疾病生物標(biāo)志物和開展靶向性疾病治療具有重要意義。