產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素研究進(jìn)展

朱 真，郭 鑫，杜吉革，李啟紅，黃小潔，李倩琳，印春生，陳小云*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100094)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)舊稱魏氏梭菌(C.welchii)或產(chǎn)氣莢膜桿菌(Bacillusperfringens)，1891年，由醫(yī)學(xué)博士Wlliam H.Welch和同事進(jìn)行尸檢時發(fā)現(xiàn)。它是一種重要的人畜共患細(xì)菌性傳染病病原，廣泛存在于土壤、污水、食物等自然環(huán)境以及動物及人類的腸道中。作為條件致病菌，能引起多種動物，包括綿羊、山羊、牛、豬、禽類、犬、家兔、馴鹿、羊駝等壞死性腸炎、腸毒血癥，并能導(dǎo)致人的氣性壞疽和食物中毒。菌體自身不致病，依靠其分泌的外毒素造成機(jī)體損害，主要分泌α、β、ε、ι 4種外毒素，此外還有CPE、NetB、PFO、TpeL等其他毒素，而根據(jù)毒素產(chǎn)生種類的不同，該菌可分為A、B、C、D、E、F、G 7個型[1-2]。其中A型菌主要分泌α毒素，可導(dǎo)致人類氣性壞疽和食物中毒，也可引發(fā)動物氣性壞疽和腸毒血癥；B型菌主要分泌α、β和ε毒素，是羔羊痢疾和其他反芻動物壞死性腸炎的罪魁禍?zhǔn)?；C型菌主要分泌α毒素和β毒素，是綿羊猝狙的病原；D型菌主要分泌α毒素和ε毒素，可引發(fā)動物腸毒血癥；E型菌在各型中較少見，主要分泌α毒素和ι毒素，可致犢牛、羔羊腸毒血癥；F型菌主要分泌CPE毒素，可致人類食物中毒和抗生素相關(guān)性腹瀉；G型菌分泌NetB毒素，主要引起雞壞死性腸炎[2]。所有外毒素中ε毒素毒力最強(qiáng)，對小鼠的LD50可達(dá)100 ng/kg。本文通過致病機(jī)理、病理變化、流行特點以及相關(guān)疫苗研究方面對產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素最新研究進(jìn)展進(jìn)行梳理，以期為產(chǎn)氣莢膜梭菌病的防控提供參考。

1 致病機(jī)理及病理變化

ε毒素主要由B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌，其對小鼠的LD50為100 ng/kg，在該菌所有外毒素中毒力最強(qiáng)，也是繼肉毒梭菌毒素和破傷風(fēng)毒素之后的世界第三大毒力細(xì)菌外毒素，被美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)列為B類生物制劑。該毒素全長296個氨基酸，大小為32.9 ku，以毒素前體的形式分泌于菌體之外[3]。編碼ε毒素的基因位于質(zhì)粒，目前已發(fā)現(xiàn)至少5種質(zhì)粒存在該基因，其中至少2種質(zhì)?？山雍限D(zhuǎn)移，這樣的特征使得毒素基因能在物種內(nèi)水平轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致毒力因子的變化[4]。毒素前體被宿主分泌的胰蛋白酶、糜蛋白酶或梭菌自身分泌的γ蛋白酶作用后，去除N端11個～13個及C端22個～29個氨基酸，不同酶切除氨基酸的數(shù)量略有差異，但都能使的毒素前體活化為成熟毒素。對ε毒素敏感的細(xì)胞不多，大多為腎源細(xì)胞，其中以MDCK細(xì)胞最為敏感，ε毒素可損害其細(xì)胞屏障完整性，通過激活PLC-y1磷酸化導(dǎo)致Ca2+流入[5]。其他敏感的細(xì)胞還包括小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞系(1G11)[6]、豚鼠腹膜巨噬細(xì)胞(GPPM)、高加索人腎平滑肌母細(xì)胞瘤細(xì)胞(G402)、小鼠腎皮質(zhì)收集管細(xì)胞(mpkCCDc14)、人腎小管上皮細(xì)胞(HRTEC)及人腎腺癌細(xì)胞(ACHN)[4]，也有研究發(fā)現(xiàn)ε毒素能引起大鼠甲狀腺上皮細(xì)胞系(FRT細(xì)胞系)死亡[7]。

ε毒素分子主要分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3個區(qū)域，結(jié)構(gòu)域Ⅰ的功能十分重要，決定毒素與細(xì)胞受體結(jié)合過程；結(jié)構(gòu)域Ⅱ內(nèi)有膜插入位點，與毒素蛋白質(zhì)的多聚化以及維持細(xì)胞受體結(jié)合穩(wěn)定性有關(guān)；結(jié)構(gòu)域Ⅲ包含C端部分，在細(xì)胞膜穿孔過程中發(fā)揮著重要作用。ε毒素屬于成孔毒素的氣溶素家族，同屬于該家族的還有腐敗梭菌的α毒素等，該家族毒素氨基酸無同源性，但蛋白結(jié)構(gòu)具有相似性。毒素作用的微觀模式主要為ε毒素被酶活化后與受體結(jié)合，定植于細(xì)胞膜上的脂筏，并在該區(qū)域引發(fā)低聚反應(yīng)，形成大小155 ku～220 ku的蛋白復(fù)合物，復(fù)合物進(jìn)一步發(fā)展為七聚體后，在膜的相同位置被組裝，形成孔道。而在這過程中，一種雙β桶狀結(jié)構(gòu)對成孔過程至關(guān)重要[8]，孔形成后可允許離子和分子通過[4]。而其宏觀模式即是致病菌在腸道定植后，直接破壞血管和腸壁，使其滲透性增加，打破機(jī)體液體環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡，引發(fā)反芻動物的腸毒血癥，繼而毒素從腸道進(jìn)入血液循環(huán)，作用于腎、肺和血管內(nèi)皮細(xì)胞，穿過血腦屏障損傷神經(jīng)系統(tǒng)，致突發(fā)死亡[4]。小鼠毒性試驗表明，毒素能在腦、腎、肺、脾、心臟中積累并致多臟器損傷，在腸道中主要結(jié)合于結(jié)腸部位[9]。ε毒素對腦組織的作用十分復(fù)雜，通過作用于內(nèi)皮細(xì)胞管腔表面和淋巴細(xì)胞的受體——髓磷脂和淋巴細(xì)胞蛋白(MAL)介導(dǎo)血腦屏障的通透性[10]，此外，還可攻擊少突膠質(zhì)細(xì)胞，抑制其K+內(nèi)流通道[11]，引起神經(jīng)元永久性損傷[12]，通過滲透至髓鞘脂影響神經(jīng)元傳導(dǎo)的同步性[13]。體外培養(yǎng)試驗表明，ε毒素對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生快速且劑量依賴性的毒性作用[14]。顯微鏡下觀察腦組織，可見血管周圍和內(nèi)部出血、水腫，白質(zhì)壞死，星形膠質(zhì)細(xì)胞和軸突腫脹。

作為分泌ε毒素的B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌，可對反芻動物造成嚴(yán)重健康威脅。B型菌主要引起羔羊痢疾，還可引起犢牛、羔羊、馬駒等動物的腸毒血癥。D型菌則是羊腸毒血癥的主要病原，該病又稱軟腎病或類快疫，2月齡～12月齡的羊多發(fā)，且好發(fā)于春夏之交、秋季牧草結(jié)籽之時，羊只通過攝入被病原芽孢污染的食物或飲水而感染，對大部分羊羔而言，機(jī)體羸弱無法抵御毒素入侵而發(fā)病，對成年羊而言，暴飲暴食或食物成分突然改變，導(dǎo)致消化系統(tǒng)菌群失調(diào)，D型菌在腸道大量繁殖，毒素經(jīng)腸黏膜進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，引發(fā)全身中毒。該病發(fā)病急，通常發(fā)病2 h～4 h內(nèi)即可死亡，臨床特征主要為腹瀉、驚厥等。病理剖檢可見腎泥樣軟化，小腸黏膜充血、出血，胸腔腹腔積液、肺充血和水腫等。組織病理學(xué)損害包括結(jié)腸炎、嗜酸性間質(zhì)性肺水腫、腎小管凝固型壞死、腎間質(zhì)性出血、腦血管和神經(jīng)周圍水腫等。

2 流行特點

全世界范圍內(nèi)，產(chǎn)氣莢膜梭菌病對養(yǎng)殖業(yè)造成的危害不容忽視。意大利南部地區(qū)的25個羊群的羔羊產(chǎn)氣莢膜梭菌病調(diào)查中，84%確診為A型、16%為D型，而其中24%的分離株為cpb2毒素基因陽性[15]。在對印度北部的559頭健康牛和123頭腹瀉新生犢牛的調(diào)查中，通過多重PCR，產(chǎn)氣莢膜梭菌病總體發(fā)病率為37.2%[16]。在我國，產(chǎn)氣莢膜梭菌威脅著許多動物的健康，長期以來，嚴(yán)重影響我國養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。從報道來看，豬、牛、羊、兔是常見易感動物，在20世紀(jì)80年代末期和90年代中期我國曾有過疫情暴發(fā)。河南省疫情最早出現(xiàn)在1985年的周口地區(qū)，1988年以后逐漸擴(kuò)散，1993年以前累計發(fā)病27個縣，1994年疫情更為嚴(yán)重，擴(kuò)散到75個縣，發(fā)病牲畜7.56萬頭，死亡6.32萬頭，致死率達(dá)98.67%，到1995年山東、安徽、湖北、湖南、山西、江蘇、四川、貴州等省均有疫情[17]。2011年-2015年，對河南省10個地市以及安徽、陜西等地的13個羊場進(jìn)行調(diào)查，PCR檢測感染率為2.35%(13/553)，主要為A型、C型和D型[18]。2014年-2015年，對廣東、江西、湖北、云南四省33個豬場采集的907個糞便樣本，用快速檢測試劑盒進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，母豬和哺乳仔豬感染嚴(yán)重，母豬感染率達(dá)62%～75%，仔豬感染率達(dá)80%～86%[19]。2019年，黃廣明等從華北、西北和西南3個地區(qū)11個牧場的351頭牛進(jìn)行了糞便樣本采集，結(jié)果顯示，各牧場均存在較嚴(yán)重的產(chǎn)氣莢膜梭菌感染，其中以犢牛和泌乳牛最為嚴(yán)重，重度感染率分別為49.35%和36.64%[20]。對華東部分地區(qū)羊源、水禽源產(chǎn)氣莢膜梭菌病的流行進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在臨床934份肉羊糞樣和20份組織樣以及臨床462份水禽糞樣和87份組織樣中，健康糞樣的陽性檢出率為19.51%，發(fā)病糞樣的陽性檢出率為2.38%，檢測出陽性組織樣均為病死樣；在水禽臨床462份糞樣和87份組織樣中，202份(43.72%)糞樣和3份(3.45%)組織樣檢測出產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性。在其中68株肉羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌中,63.24%(43/68)的毒素基因型為A型(攜帶α毒素)，36.76%(25/68)為D型(攜帶α、ε毒素)；9株水禽源產(chǎn)氣莢膜梭菌均為A型(9/9)。未發(fā)現(xiàn)B(攜帶α、β、ε毒素)、C(攜帶α、β毒素)、E(攜帶α、ι毒素)型[21]。

3 相關(guān)疫苗研究

3.1 傳統(tǒng)類毒素疫苗

產(chǎn)氣莢膜梭菌病由于發(fā)病急、病程短，往往來不及治療動物就暴斃，所以防控該病的方法以疫苗免疫為主。目前，國內(nèi)外均廣泛使用產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素滅活疫苗，我國本土研發(fā)生產(chǎn)的“羊快疫-猝狙-腸毒血癥三聯(lián)滅活疫苗”、“羊快疫-猝狙-羔羊痢疾-腸毒血癥四聯(lián)干粉滅活疫苗”、“梭菌多聯(lián)干粉疫苗”等傳統(tǒng)疫苗使用廣泛。國際上也有成熟的商品化疫苗，如產(chǎn)氣莢膜梭菌C型和D型類毒素疫苗，氣腫疽梭菌-腐敗梭菌-溶血梭菌-諾維梭菌-污泥梭菌-C型D型產(chǎn)氣莢膜梭菌七聯(lián)苗。一針多防，對產(chǎn)氣莢膜梭菌病的預(yù)防起到了較好效果。由于傳統(tǒng)疫苗依賴培養(yǎng)基發(fā)酵毒素，培養(yǎng)基又以天然動物組織為主要成分，使得批間差異較大，同時還存在抗原成分復(fù)雜、甲醛滅活耗時長、生產(chǎn)過程中存在生物安全隱患等缺陷。鑒于此，目前，國內(nèi)外許多專家學(xué)者將目光聚焦在基因工程疫苗研發(fā)上，總體來看，為使毒素減毒脫毒，研究策略也大多以毒素基因突變、串聯(lián)表達(dá)等為主，此外，多種毒素的聯(lián)苗逐漸成為研究趨勢。

目前,國內(nèi)外產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗檢驗標(biāo)準(zhǔn)不太一致?！吨袊F藥典》規(guī)定的檢驗方法為免疫攻毒法和血清中和法，免疫攻毒法是對免疫疫苗的家兔或本動物進(jìn)行攻毒(免疫接種后14 d～21 d)，免疫組3/4保護(hù)，對照組2/2死亡即判合格。血清中和法是對家兔或本動物免疫接種14 d～21 d后采血，將血清與毒素中和后注射小鼠，根據(jù)小鼠是否死亡來測定中和效價，B型、C型和D型毒素分別至少中和1、1和3 MLD判為合格[22]。國際上效力檢驗通常采用產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素標(biāo)準(zhǔn)品來衡量，疫苗間隔20 d～28 d進(jìn)行兩次免疫，二免后14 d采血，測定動物混合血清的抗體效價，其中美國標(biāo)準(zhǔn)為β抗毒素≥10 IU/mL、ε抗毒素≥2 IU /mL，而英國標(biāo)準(zhǔn)略有不同，當(dāng)其β抗毒素≥10 IU/mL、ε抗毒素≥5 IU/mL時判為合格[23]。

3.2 ε毒素減毒突變體

由于傳統(tǒng)類毒素疫苗的制備工藝對動物組織依賴程度較大，發(fā)酵培養(yǎng)基原料包括牛肉、豬胃、肝臟等新鮮動物組織，生產(chǎn)過程復(fù)雜且批間差異大、抗原成分復(fù)雜，免疫劑量大，不僅增加生產(chǎn)成本還容易導(dǎo)致免疫動物的局部反應(yīng)，為解決這一困擾，研發(fā)一種經(jīng)濟(jì)、有效且動物免疫副反應(yīng)小的疫苗——ε毒素減毒突變體成為研究熱門。與產(chǎn)氣莢膜梭菌其他毒素相比，α和β毒素能通過免疫C端蛋白即可刺激機(jī)體產(chǎn)生有效免疫保護(hù)力，而ε毒素鮮有類似報道，也缺乏明確的具有免疫原性但無毒力的片段，所以通過對個別位點進(jìn)行突變而獲得ε毒素?zé)o毒突變體成為未來疫苗研制的方向。

為使ε毒素減毒，世界各地學(xué)者對毒素蛋白實施基因位點突變、重組等措施進(jìn)行了許多嘗試。通過研究發(fā)現(xiàn)，第29、30、36、196、199位點與細(xì)胞結(jié)合有關(guān)[24-26]，第71位點酪氨酸(71Y)被證實與毒素活性相關(guān)，缺失Y71的重組毒素在MDCK細(xì)胞上未顯示毒性[27]。已證明，將106位點組氨酸突變?yōu)楦彼?H106P)，重組蛋白被證實無毒，免疫小鼠后，可抵抗100 LD50～ 1 000 LD50攻毒量[25,28]，但該重組蛋白可溶性表達(dá)量非常低[25]，若需要工業(yè)化生產(chǎn)會增加純化的難度，從而限制了其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。而將H106P重組序列連于干酪乳酸桿菌，小鼠口服后能相應(yīng)地產(chǎn)生黏膜、體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，保護(hù)其抵抗200 LD50攻毒量[29]，相比于針劑免疫，這種口服干酪乳桿菌的方式，不僅簡便易行，可減少動物應(yīng)激，而且干酪乳桿菌作為一種益生菌，不僅能起到免疫調(diào)理作用，還能有效刺激黏膜免疫應(yīng)答。但該方法因僅突變ε毒素蛋白的一個氨基酸，若在活載體培養(yǎng)或動物口服過程中發(fā)生回復(fù)突變，則可能迅速致死動物，存在較大的生物安全風(fēng)險。Y196E-C(將196位點酪氨酸突變?yōu)楣劝彼岷笈c毒素C端連接)和F199E同樣是兩次成功的無毒突變嘗試，小鼠經(jīng)過3次免疫接種后均能保護(hù)其在100 LD50毒素攻毒下存活[28,30]，而F199E毒力下降的原因是突變導(dǎo)致其與受體結(jié)合能力的下降[31]。為更大程度降低由單一氨基酸位點改變帶來的毒力返強(qiáng)風(fēng)險，許多研究在多位點突變上進(jìn)行了許多嘗試。雙氨基酸突變體Y30A-Y196A顯示其對MDCK細(xì)胞和小鼠的毒性降低，但對一種被改造過的CHO細(xì)胞(可表達(dá)ε毒素假定受體MAL)而言，毒性并未降低。相比而言，Y30A-Y196A-A168F減毒效果更好，不僅對MDCK細(xì)胞毒性降低3倍以上，還對上述CHO細(xì)胞毒性降低至少200倍，免疫兔和綿羊進(jìn)行后，均產(chǎn)生了維持1年以上的高水平抗ε毒素中和抗體[32]。H106P-F199E、Y30A-H106P-Y196A以及連入Th細(xì)胞表位序列的Y30A-H106P-Y196A對MDCK細(xì)胞和小鼠(6.25 mg/kg)喪失毒力，家兔二次免疫后可產(chǎn)生400～4 000 小鼠MLD血清抗體效價，且攻毒試驗完全保護(hù)[33-35]。

將除去N端氨基酸的ε毒素基因在大腸埃希氏菌中表達(dá)，重組蛋白分別以50、100、200 μg對兔進(jìn)行二次免疫，血清抗體效價分別達(dá)10、30、40 IU/mL[36]。LTB和ε毒素線性表位(40-62)重組融合蛋白免疫小鼠后，體內(nèi)和體外試驗均具有ε毒素中和活性[37]。有研究人員研制的一種α、β、ε毒素基因工程三價疫苗，成功實現(xiàn)減毒，且分別在兔、牛、綿羊和山羊上進(jìn)行間隔28 d的二次免疫，3種成分毒素的血清中和抗體效價均能達(dá)到美國和歐洲藥典的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，其中兔、牛、綿羊和山羊ε毒素血清中和效價分別能達(dá)到25、12.74、7.66、8.91 IU/mL[38]。產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素與產(chǎn)氣莢膜梭菌ε和腐敗梭菌共表達(dá)產(chǎn)物混合而成的三聯(lián)滅活疫苗，通過免疫家兔2次，測得血清中和效價分別為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌8 MLD、D型菌45 MLD、腐敗梭菌1.5 MLD，且攻毒試驗全部保護(hù)[39]。針對ε毒素的合成肽疫苗亦被證實有效，將肽段偶聯(lián)至部分還原的破傷風(fēng)類毒素(TT)，免疫接種小鼠后的血清能在體外中和致死劑量的ε毒素[40]。除了注射免疫接種，通過口服表達(dá)重組毒素的乳酸菌也能達(dá)到預(yù)期的免疫保護(hù)效果。將產(chǎn)氣莢膜梭菌α-β2-ε在大腸埃希氏菌中串聯(lián)表達(dá)而制成的基因工程亞單位多價苗，免疫接種小鼠后可產(chǎn)生較高水平的血清抗體，針對A、B、C和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌的免疫保護(hù)率分別為100%、100%、90%、100%[41]。在干酪乳桿菌中成功融合表達(dá)的α-β2-ε-β1重組毒素，α、β2、ε分別進(jìn)行了單點氨基酸突變，經(jīng)小鼠口服免疫3次后，能分別抵御產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒A型菌2 MLD和B型菌3MLD的攻毒劑量[42]。

4 結(jié)語

當(dāng)前，產(chǎn)氣莢膜梭菌病的防控形勢依然嚴(yán)峻，而疫苗是預(yù)防該病的重要手段。鑒于傳統(tǒng)疫苗缺陷較多，產(chǎn)氣莢膜梭菌基因工程亞單位疫苗成為現(xiàn)今的研究熱點。由于ε毒素毒力強(qiáng)勁，在相關(guān)聯(lián)苗的研制中往往成為不可或缺的組分?？上驳氖?，近些年的研究中誕生了許多兼具免疫原性和無毒性的優(yōu)秀重組蛋白，這將是未來潛在的制苗株，這將有助于我國產(chǎn)氣莢膜梭菌防控水平登上新臺階。