異丙酚對膠質瘤U87細胞增殖、侵襲、遷移及JAK2/STAT3通路的影響

蘇 凱，楊彥楠，楊欣剛

膠質瘤亦稱神經(jīng)膠質瘤，是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，年發(fā)病率為4/10萬～5/10萬，具有惡性程度高、治愈率低、預后差等特點[1,2]。目前,手術治療是最直接、有效的治療方式，但患者近5年整體生存率仍低于10%[3]。因此，尋找一種安全有效的方法成為臨床上亟待解決的問題。近年來，保護神經(jīng)元免受損傷和誘導膠質瘤細胞凋亡、抑制腫瘤侵襲能力成為治療膠質瘤的突破口。異丙酚又稱丙泊酚或普魯泊福，是臨床常用的靜脈麻醉藥，具有起效快、蘇醒迅速、分布快、持續(xù)靜注后無蓄積等特點。最新研究證實，異丙酚有一定的神經(jīng)保護作用，可通過抗氧化、抗炎、抗凋亡等不同機制減輕腦缺血再灌注后神經(jīng)元損傷，發(fā)揮器官保護作用[4-6]。Janus激酶2/信號轉導子和轉錄激活子3(janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)信號通路是細胞因子激活相關的信號轉導通路，有研究表明JAK2/STAT3信號通路可參與神經(jīng)元的增殖、生存、分化過程，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂疾病中的炎性反應病理過程，與腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病關系密切[7，8]。但異丙酚能否影響膠質瘤U87細胞增殖、侵襲、遷移及調(diào)控JAK2/STAT3信號通路還尚未研究。本研究擬通過用MTT法、Transwell模型、劃痕實驗和Western blotting法研究異丙酚對膠質瘤U87細胞增殖、侵襲、遷移及JAK2/STAT3通路的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 異丙酚注射液購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Hyclone公司；胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗購自美國Gibico公司；MTT試劑、Transwell板、Matrigel購自美國Sigma公司；兔抗人JAK2、兔抗人STAT3、兔抗人p-JAK2、兔抗人p-STAT3、兔抗人內(nèi)參β-Actin、羊抗兔二抗購自美國Bioworld公司。SC-Y408A光學顯微鏡購自深圳市晨晟光學儀器有限公司；Thermo賽默飛世爾FC酶標儀購自美國ThermoFisher公司；BPH-9042細胞培養(yǎng)箱購自蘇州諾微爾電子科技有限公司；細胞培養(yǎng)接種專用超凈臺購自鄭州安晟科學儀器有限公司；電泳槽和轉膜槽購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 膠質瘤U87細胞購自上海信裕生物工程有限公司；人正常星型膠質細胞HEB購自上海奧陸生物科技有限公司。將膠質瘤U87細胞和人正常星型膠質細胞HEB按常規(guī)培養(yǎng)在含有10%血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2、相對濕度98%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，長至80%時傳代，收集對數(shù)期細胞用于實驗。

1.3 細胞增殖能力檢測 取對數(shù)生長期的膠質瘤U87細胞、人正常星型膠質細胞HEB，用培養(yǎng)液將細胞密度調(diào)整為5×104個/ml，以每孔200 μl接種到96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)過夜后棄培養(yǎng)液，并用PBS清洗3遍，加入濃度為5、10、25、50、100 μM的異丙酚培養(yǎng)液，每組設置6個副孔，同時設置只加0.1%DMSO組，不加異丙酚的對照組。培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，之后加入MTT溶液(5 mg/ml)25 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO溶液，37 ℃，100 r/min震蕩10 min，使用全自動酶標儀測定在490 nm處吸光度(optical density，OD值)。計算不同濃度異丙酚對U87細胞和HEB細胞的生長抑制率。細胞生長抑制率(%)=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。

1.4 細胞侵襲能力檢測 將Matrigel從-20 ℃冰箱中取出，置于4 ℃條件下過夜解凍，用無血清的培養(yǎng)液稀釋至200 μl/ml，之后涂抹到transwell板的濾膜上面(200 μl/cm2)，37 ℃放置3 h，取出后在超凈臺上干燥過夜。取對數(shù)生長期的膠質瘤U87細胞，用無血清的培養(yǎng)液將細胞密度調(diào)整為1×105個/ml，以每孔200 μl接種到transwell上室，下室加入600 μl含10%血清的培養(yǎng)液，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)，待細胞貼壁后更換上室培養(yǎng)液，設置對照組和2、5、10 μM異丙酚組。培養(yǎng)48 h，用棉簽輕輕擦去Matrigel和上室內(nèi)細胞，10%甲醛溶液固定15 min，用蒸餾水清洗3次，0.1%結晶紫染色10 min，蒸餾水清洗3次，每組設置6個副孔。顯微鏡下拍照，隨機選擇6個視野計數(shù)，結果取平均值。用穿過濾膜的細胞數(shù)相對于相應孔中細胞數(shù)比例表示細胞的侵襲能力。

1.5 細胞遷移能力檢測 取對數(shù)生長期的膠質瘤U87細胞，用培養(yǎng)液將細胞密度調(diào)整為5×104個/ml，以每孔2 ml接種到6孔板，置于培養(yǎng)箱中，待細胞單層平鋪70%～80% 時，用無菌的200 μl槍頭垂直于孔底，均勻劃出細胞劃痕，之后用PBS清洗除去細胞碎片，加入經(jīng)處理過的無血清培養(yǎng)液。實驗組加入含終濃度分別為2、5、10 μM異丙酚的培養(yǎng)液，對照組培養(yǎng)液不經(jīng)任何處理，每組設置6個副孔，48 h后用倒置顯微鏡觀察細胞的遷移程度并拍照，遷移能力按下式計算：遷移能力(%)=(初始兩側距離-觀察時兩側距離)/初始兩側距離×100%。

1.6 Western blot檢測 蛋白印跡法(western blotting，WB)測定膠質瘤U87細胞JAK2和STAT3表達情況，設置對照組和實驗組(2、5、10 μM異丙酚分別作用U87細胞48 h)。用細胞裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA法測定各組細胞蛋白含量，每組設置六個副孔。每個點樣孔加入50 μg蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離目標蛋白,根據(jù)目標蛋白大小：JAK2(130 ku)，p-JAK2(125 ku)，STAT3(86 ku)，p-STAT3(92 ku)剪切大小適當?shù)哪z。將凝膠上的蛋白以濕轉法轉至PVDF膜上，使用5%的脫脂奶粉封閉膜上結合位點1 h。加入兔抗人JAK2(1∶1000)、兔抗人STAT3(1∶1000)、兔抗人p-JAK2(1∶1000)、兔抗人p-STAT3(1∶1000)、兔抗人內(nèi)參β-Actin(1∶1000)4 ℃孵育過夜，用PBS清洗3次，每次10 min，加入羊抗兔二抗(1∶1000)，25℃孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min，用顯色劑ECL顯色、曝光。用凝膠成像設備觀察。

2 結 果

2.1 生長抑制作用 MTT法測定不同濃度異丙酚處理48 h后，與對照組相比，5、10、25、50、100 μM異丙酚均能顯著抑制膠質瘤U87細胞增殖，并具有濃度依賴性，異丙酚對膠質瘤U87細胞作用48 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)為45.06 μM。與人正常星型膠質細胞HEB組相比，同濃度下異丙酚對膠質瘤U87細胞抑制率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

表1 不同濃度異丙酚作用48 h后對U87細胞和HEB細胞生長抑制率

2.2 體外侵襲和遷移能力的影響 與對照組相比，膠質瘤U87細胞經(jīng)2、5、10 μM異丙酚處理48 h后，通過Matrigel到達濾膜底層的細胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著異丙酚濃度的增大，其侵襲能力也隨著降低。與對照組相比，膠質瘤U87細胞經(jīng)2、5、10 μM異丙酚處理48 h后，遷移能力分別降低(19.69±2.67)%、(41.41±3.28)%、(59.75±2.91)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

表2 不同濃度異丙酚對U87細胞體外侵襲和遷移能力的影響

2.3 JAK2/STAT3通路的影響 與對照組相比，經(jīng)2、5、10 μM異丙酚處理48 h后的膠質瘤U87細胞中JAK2、STAT3蛋白表達水平無明顯變化，JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)。

圖1 不同濃度異丙酚對U87細胞JAK2和STAT3表達水平的影響

3 討 論

目前，膠質瘤是預后最差的惡性腫瘤之一，放化療耐受、浸潤生長、復發(fā)是患者死亡的主要原因[9]。如何能有效抑制膠質瘤侵襲、遷移和復發(fā)成為當前的研究熱點之一，研究表明多種信號通路分子參與膠質瘤細胞的生長、增殖、遷移、侵襲過程，促進膠質瘤細胞與胞外基質相互作用，可以分泌基質降解酶，導致正常腦組織局部降解，形成侵襲生長[10，11]。

異丙酚是一種對細胞免疫功能無損傷的靜脈麻醉藥，具有脂溶性高、清除迅速的特點。研究表明異丙酚能夠增強T淋巴細胞的活性，經(jīng)異丙酚處理后的腫瘤細胞，其增殖、侵襲、遷移能力明顯受到抑制[12]。異丙酚能夠顯著上調(diào)miR-218的表達水平，下調(diào)MMP-2蛋白表達水平，抑制人膠質瘤U373細胞增殖和侵襲，促進細胞凋亡[13]。張永強等[14]研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚可通過下調(diào)MMP-2蛋白表達水平來抑制肺癌癌細胞的增殖、侵襲，具有潛在的臨床應用價值。文獻[15]發(fā)現(xiàn)，異丙酚同樣可調(diào)節(jié)其他信號通路作用于癌細胞，可能通過阻止P13K/AKt信號通路的激活，抑制人肝癌細胞的侵襲能力。閔娜等[16]發(fā)現(xiàn)，異丙酚能夠抑制人肝癌細胞增殖、侵襲能力，可能是通過阻止Wnt/β-catenin信號通路的激活而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)，膠質瘤U87細胞與不同濃度異丙酚共同孵育48 h后，與對照組相比，5、10、25、50、100 μM異丙酚均能明顯抑制膠質瘤U87細胞增殖，半數(shù)抑制濃度(IC50)為45.06 μM，與人正常星型膠質HEB細胞組相比，同濃度下異丙酚對U87細胞抑制率顯著升高，說明異丙酚在5～100 μM濃度范圍內(nèi)能夠抑制膠質瘤U87細胞增殖，且對人正常星膠質HEB細胞無毒性。

本研究MTT實驗顯示，10 μM異丙酚作用48 h后對膠質瘤U87細胞抑制率為(17.31±2.08)%，細胞活力超過80%，為防止細胞活力過低導致Transwell侵襲實驗和細胞劃痕實驗出現(xiàn)假陽性結果，后續(xù)選取異丙酚濃度2、5、10 μM進行實驗。本研究體外侵襲實驗表明，與對照組相比，膠質瘤U87細胞經(jīng)2、5、10 μM異丙酚處理48 h后，能夠通過Matrigel到達濾膜底層的細胞數(shù)明顯減少，說明10 μM異丙酚能夠抑制腦膠質瘤U87細胞體外侵襲能力。進一步遷移實驗表明，與對照組相比，膠質瘤U87細胞遷移能力明顯降低，說明10 μM異丙酚能夠抑制膠質瘤U87細胞體外遷移能力。異丙酚能夠抑制膠質瘤U87細胞增殖、侵襲、遷移，但具體通過何種細胞信號通路進行調(diào)控還待進一步研究。

JAK/STAT信號通路分別由JAK蛋白家族和STAT蛋白家族組成，是體內(nèi)重要的細胞信號傳導途徑，可在細胞增殖、分化、凋亡、炎性反應等病理過程中發(fā)揮重要作用，研究表明，JAK2/STAT3信號通路與腦缺血再灌注損傷炎性反應相關[17]。脊髓神經(jīng)受損會大量分泌IL-6，同時激活JAK2/STAT3信號通路，引起促炎因子、NO、誘導型活性氧簇釋放。郭佳培等[18]研究表明，青蒿素能夠阻斷JAK2/STAT3激活誘導肝癌細胞凋亡，進而發(fā)揮抗腫瘤作用，隨后胡兵等[19]研究發(fā)現(xiàn)阻斷JAK2/STAT3信號通路激活可抑制鼻咽癌細胞的侵襲、遷移能力。本研究結果顯示，與對照組相比，經(jīng)2、5、10 μM異丙酚處理48 h后的膠質瘤U87細胞中JAK2蛋白磷酸化水平、STAT3蛋白磷酸化水平均明顯下調(diào)，呈濃度依賴效應，說明經(jīng)異丙酚處理可能抑制膠質瘤U87細胞JAK2蛋白、STAT3蛋白磷酸化，從而阻斷JAK2/STAT3信號通路激活。

綜上所述，異丙酚可能通過阻斷JAK2/STAT3信號通路激活，進而抑制膠質瘤U87細胞增殖、侵襲、遷移。但異丙酚與JAK2/STAT3信號通路作用機制有待進一步研究。