利用納米孔測序鑒定蓖麻蠶病害

陳大嵩，黃 鴻，吳 華，李健雄，戴建青

(廣東省科學(xué)院動物研究所，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣州 510260)

蓖麻蠶Samiaricini，又叫惠利蠶、木薯蠶，大蠶蛾科Saturniidae樗蠶屬的馴養(yǎng)絹絲與食用的非滯育經(jīng)濟型昆蟲。原產(chǎn)于印度東北部的阿薩姆邦，由寬帶樗蠶Samiacanningi馴化而來(Peigler & Calhoun, 2013)。我國自1951年，由中國科學(xué)院實驗生物研究所朱洗教授引進飼養(yǎng)蓖麻蠶。蓖麻蠶繭殼奶白色，可用于生產(chǎn)絹紡原料，為全世界僅次于家蠶與柞蠶的第三大絹絲昆蟲，其蠶絲質(zhì)量僅次于家蠶BombyxmoriLinnaeus并優(yōu)于柞蠶AnthereapernyiGuerin-Meneville (van Beeketal., 2000)，蠶絲可設(shè)計成優(yōu)良的生物材料與細胞支撐介質(zhì)(Paletal., 2013)，其熟蠶與蛹亦是優(yōu)質(zhì)昆蟲食品(Longvahetal., 2011)，蠶蛹油脂可提煉優(yōu)質(zhì)健康的食用油(王衛(wèi)飛等, 2018)，卵可繁殖多種寄生蜂(莫現(xiàn)會等, 2016)。蓖麻蠶即可室內(nèi)飼養(yǎng)亦可放養(yǎng)，除家蠶外，為僅有的幾種可以在室內(nèi)大量圈養(yǎng)的絹絲昆蟲。蓖麻蠶的寄主植物相較家蠶與柞蠶更廣，一般以大戟科的蓖麻與木薯做飼料大量飼養(yǎng)，替代寄主包括大戟科的烏桕Sapiumsebiferum(L.)Roxb.、夾竹桃科的雞蛋花Plumeriarubra、苦木科的臭椿Ajugalupulina、馬?？岂R桑CoriarianepalensisWall.、蕓香科吳茱萸Euodiaruticarpa、菊科的蒲公英TaraxacummongolicumHand.-Mazz.和萵苣LactucasativaL. var. angustanaIrish.等。以蓖麻-蓖麻蠶與木薯-蓖麻蠶的形式進行栽培-養(yǎng)殖的聯(lián)合增加了蓖麻與木薯的產(chǎn)值，是帶動蓖麻與木薯種植業(yè)的重要因素之一。

蓖麻蠶生產(chǎn)上可能遭受侵害的毀滅性病害包括蓖麻蠶微粒子病(劉士賢等, 1964；謝偉東, 1989)、膿病(葉育昌, 1982；李敏棠等, 1985)、軟化病等(吳汝章, 1987)，甚至同時感染多個疾病。此外，被污染的蠶室、蠶具、蠶卵很易殘留病原，且隨著累代對病原物的不停積累，蠶病會呈現(xiàn)愈發(fā)嚴(yán)重的趨勢并且病原物亦愈發(fā)難以清除。目前常用的分子生物學(xué)檢測蠶病病原手段包括PCR、實時熒光qPCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增LAMP、巢式PCR等方法。隨著高通量測序方法的發(fā)展，測序成本的不斷降低，高通量檢測方法被廣泛應(yīng)用在各種病原的檢測中。在各高通量測序平臺中，牛津納米孔公司Oxford Nanopore的掌上納米孔測序儀MinION是一款便攜式測序儀，能夠直接進行DNA和RNA測序，擁有超長的讀長、實時測序、隨時終止等特性，被廣泛應(yīng)用在檢測多種病原體中(Warwick Dugdaleetal., 2019；Wongsurawatetal., 2019)。本文通過利用MinION測序儀對蓖麻蠶病蠶組織樣品的DNA進行測序，鑒定病蠶感染的病原物，以實現(xiàn)利用高通量測序技術(shù)對蓖麻蠶疾病進行監(jiān)控。

1 材料與方法

1.1 DNA提取

蠶病取自江蘇省南京市蠶農(nóng)的蠶室，接種于實驗室內(nèi)飼養(yǎng)的蓖麻蠶1齡幼蟲，接種后至2～3齡幼蟲集體發(fā)病，幼蟲脫離寄主、拒食、拉稀，死后呈現(xiàn)發(fā)黑、軟化等癥狀，死后蠶體整體用于DNA提取以獲得足夠量的起始DNA濃度。待測蠶體首先在80℃孵育5 min以殺滅病原以防交叉污染，每1 g蠶體組織放于10 mL CTAB裂解液(2% CTAB，100 mM Tris (pH 8.0)，20 mM EDTA，1.4 M NaCl，3%疏基乙醇)中研磨，65℃水浴2 h。待降溫至室溫，加入等體積的酚氯仿異戊醇(25 ∶24 ∶1)萃取，震蕩10 s后離心10 min，取上清液重復(fù)上一步再次加入等體積的酚氯仿異戊醇萃取。上清液加入等體積的異丙醇沉淀DNA，顛倒混勻后，離心10 min。棄上清留取DNA沉淀，加入適量70%乙醇清洗DNA，離心5 min后棄上清并用移液器吸干液體，晾干DNA后加入100 μL無菌水溶解DNA。

1.2 納米孔測序文庫構(gòu)建

DNA溶液經(jīng)過微量分光光度計測量DNA含量，取2 μg DNA溶液加入Covaris g-TUBE打斷管上部，8 500 r/min離心1 min將DNA溶液離心到下部，顛倒后8 500 r/min離心1 min將DNA溶液重新離心到上部，DNA溶液取出1 μL加入微量分光光度計測量DNA含量并保證1 μg以上的DNA用于下一步實驗。利用末端修復(fù)試劑盒(NEBNext End repair / dA-tailing Module，E7546)對打斷的DNA進行末端修復(fù)，利用磁珠(AMPure XP beads)對DNA文庫進行回收，取1 μL文庫加入微量分光光度計測量DNA含量并保證700 ng以上的DNA用于測序。利用末端連接試劑盒(NEB Blunt/TA Ligase Master Mix，M0367)把連接測序試劑盒(1D Genomic DNA by ligation，SQK-LSK108)中的接頭連接到DNA上，并用AMPure XP磁珠回收DNA文庫，取1 μL文庫加入微量分光光度計測量DNA含量并保證430 ng以上的DNA用于測序。DNA測序芯片(Flow Cells R.9.4.1)放入MinION測序儀并連接電腦，對機器與芯片進行質(zhì)檢并保證芯片有800以上的可用納米孔，從芯片priming port孔取出20～30 μL緩沖液以去除氣泡，從priming port加入800 μL測序緩沖液并靜置5 min。打開sample port孔，再次從priming port加入200 μL測序緩沖液，DNA文庫與連接測序試劑盒中的測序珠(LLB)與緩沖液(RBF)混合，一滴一滴加入到sample port孔，關(guān)閉sample port與priming port。

1.3 納米孔測序與分析

MinION測序儀運行48 h，合并獲得fastq文件，測序原始數(shù)據(jù)儲存在國家基因庫生命大數(shù)據(jù)可信計算平臺(項目編號：CNP0001421，測序編號：CNR0339720)。從公共核酸序列數(shù)據(jù)庫NCBI下載各微孢子、各核多角體病毒、白僵菌、柞蠶腸球菌基因組，作為病原體序列數(shù)據(jù)庫，利用minimap2(v2.17)把測序序列比對到病原體數(shù)據(jù)庫中，以檢測測序結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

通過MinION測序儀獲得2 116 314條DNA序列約1.87 G個堿基，最長53 282 bp，中位數(shù)563，均值884，序列長度大多超過300 bp且集中在 300～1 500 bp長度(圖1)。其中，4 476條序列(占總序列2.1‰)被minimap2比對到病原數(shù)據(jù)庫(圖2)，且與比對到蓖麻蠶基因組類似，序列長度與比對堿基數(shù)量的散點圖集中在一片V字區(qū)域，并沒有線性關(guān)系。比對長度超過800 pb的序列中157條序列比對到家蠶微粒子Nosemabombycis基因組，139條序列比對到柞蠶腸球菌Enterococcuspernyi基因組(部分比對結(jié)果見表1)，比對長度超過300 bp的序列分別有206和313條序列比對到家蠶微粒子和柞蠶腸球菌基因組(圖3)，這說明樣品組織已經(jīng)感染兩種病原體。

圖1 MinION測序序列長度分布圖Fig.1 Distribution of the sequence lengths obtained by MinION

圖2 序列比對結(jié)果散點圖Fig.2 Scatter plot of mapping result注：A圖，序列與蓖麻蠶基因組比對結(jié)果；B圖，序列與病原數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果。Note：A, mapping results to genome; B, mapping results to pathogen database.

表1 部分序列比對結(jié)果

圖3 比對到病原基因組且比對長度超過300 bp的序列長度分布小提琴圖Fig.3 Violin plot of the sequence length mapped to pathology genomes with more than 300 pb mapping length 注：小提琴圖寬度代表序列的數(shù)量。Note：Widths of violin plot represent the sequence amount.

3 結(jié)論與討論

昆蟲組織具有高蛋白質(zhì)、高脂肪的特性，并且在被病原體感染后，壞死組織的DNA被降解，然而高通量測序?qū)NA提取的質(zhì)量有較高的要求并且起始建庫的DNA須達到足夠數(shù)量，因此昆蟲DNA的提取質(zhì)量決定了最終測序結(jié)果的優(yōu)劣。本研究采用提高裂解液與增加萃取次數(shù)的方式提高DNA的提取純度與數(shù)量，為昆蟲構(gòu)建高通量測序文庫提供參考。

單分子納米孔測序技術(shù)具有高通量、超長讀長、可以直接檢測堿基甲基化修飾、無需PCR擴增和體積較小便于攜帶等優(yōu)勢，可應(yīng)用于動植物和微生物基因組測序、宏基因組測序、RNA直接測序、微生物檢測、DNA與RNA甲基化檢測、mRNA的polyA長度定量等研究(曹影等, 2020。然而，單分子納米孔測序的結(jié)果具有較高的錯誤率，是阻礙其應(yīng)用的關(guān)鍵。目前MinION測序儀的單堿基準(zhǔn)確率約85%，修正后的一致性序列的準(zhǔn)確率可達97%～99%，因此對單分子納米孔測序的分析具有一定的挑戰(zhàn)。在DNA文庫構(gòu)建時，本研究通過DNA低速離心打斷管以獲取更長的DNA片段以構(gòu)建測序文庫，有利于增加序列比對的長度以增加可信度。值得注意的是，minimap2的比對長度并未與序列長度成線性關(guān)系，可能與minimap2的算法有關(guān)，因此本研究選取的置信區(qū)間為最低300 bp的比對長度，即比對長度超過300 bp為可信比對結(jié)果。同時，比對數(shù)據(jù)庫中病原物基因組序列的豐富度與病原物種類的選擇，會對鑒定結(jié)果起關(guān)鍵作用并影響最終鑒定結(jié)果。因此，在選擇病原物種核酸序列時，應(yīng)盡可能涵蓋所有蠶病病原的基因組序列，降低比對錯誤與假陽性。本實驗選擇真菌性病害病原、細菌性病害、微粒子基因組以及所有桿狀病毒基因組序列，盡可能構(gòu)建全面的病原序列數(shù)據(jù)庫以降低鑒定的誤差，并且通過過濾序列本身長度短且比對長度較短的序列，以增加比對結(jié)果可靠性。

本研究通過MinION測序儀對蓖麻蠶病蠶基因組進行測序，與病原基因組序列庫進行比對，無需PCR擴增步驟，降低了假陽性。利用MinION等高通量測序手段對病蠶、蠶具或蠶室進行檢測不僅可以一次性準(zhǔn)確的鑒定蠶病，也摒棄了PCR方法可能具備的假陽性現(xiàn)象，而且其不需要模板設(shè)計引物，甚至可以鑒定新病原等的特性，可以與PCR鑒定方法形成互補，對蠶病的全面監(jiān)測提供保障。