二斑葉螨雌成螨對(duì)高溫脅迫的生理響應(yīng)

王常清，韓永金，曹進(jìn)剛，張 潔，尚素琴

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070)

二斑葉螨Tetrarcychusurticae(Koch)屬于節(jié)肢動(dòng)物門Arthropod蜱螨亞綱Acarina真螨目Acariformes葉螨科Tetranychidae，廣泛分布于世界各地。二斑葉螨通過刺吸式口器取食，可為害1 000多種植物，包括豆類、黃瓜、玉米、草莓，以及多種果樹等，對(duì)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成了嚴(yán)重的危害(趙衛(wèi)東等, 2003; 李忠洲等, 2013; Topuzetal., 2018)。

近年來，甘肅地區(qū)草莓種植規(guī)模逐步擴(kuò)大，栽培模式也由露地轉(zhuǎn)變?yōu)闇厥曳N植(湯玲等, 2017)。隨著種植面積的不斷擴(kuò)大，草莓病蟲害問題日益突出，成為制約草莓健康發(fā)展的重要因素之一，其中二斑葉螨是為害草莓的優(yōu)勢(shì)害螨，可使草莓植株矮化、早衰，葉片干枯，果實(shí)縮小，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致植株死亡，影響草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)(曹立軍等, 2018)。

溫度對(duì)螨的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖、生理生化代謝等有著重要的影響(Cunnington, 1965; 楊麗紅等, 2014)，其中，高溫對(duì)螨的影響更為顯著(劉開林, 2007; 陳瑜和馬春森, 2010; 戈峰, 2011)。高溫可直接影響螨或通過作用于寄主植物間接影響它們的生理代謝等(Cunnington, 1984; 楊大興, 2009; Everattetal., 2013)。在環(huán)境變化或極端因子的脅迫時(shí)，螨可以通過調(diào)整自身的免疫調(diào)節(jié)途徑或一些酶類來應(yīng)對(duì)逆境脅迫(Weber, 2005; 黃吉, 2020)。研究發(fā)現(xiàn)，螨體內(nèi)的多功能氧化酶(MFO)、羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，不僅能夠代謝對(duì)自身不利的外源化學(xué)物質(zhì)(Cuietal., 2011)，而且在適應(yīng)逆境脅迫等方面也起著重要作用(Wenetal., 2009; Yangetal., 2010; 劉建業(yè)等, 2017)。

在晴天，溫室中溫度可達(dá)到40℃以上，并穩(wěn)定維持一段時(shí)間(Zhangetal., 2016; 孫麗娟等, 2019)，雖然高溫對(duì)二斑葉螨有一定的負(fù)面影響，但其仍然能夠適應(yīng)高溫脅迫并穩(wěn)定存活、繁殖、擴(kuò)大種群(龔淑, 2015; Bayuetal., 2017)。

目前，有關(guān)設(shè)施農(nóng)業(yè)中的優(yōu)勢(shì)害螨二斑葉螨的研究大多集中在高溫對(duì)二斑葉螨的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)影響方面，但對(duì)其如何通過體內(nèi)解毒酶系來適合高溫脅迫的機(jī)制研究尚無報(bào)道。因此，本文模擬高溫脅迫環(huán)境對(duì)二斑葉螨體內(nèi)3種解毒酶(CarE、MFO、GST)的比活力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化規(guī)律，旨在闡明二斑葉螨在生理生化水平上如何應(yīng)對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制，以期為設(shè)施農(nóng)業(yè)中害螨的綜合防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試螨源

二斑葉螨種群采自甘肅省蘭州新區(qū)草莓農(nóng)業(yè)示范園，用新鮮四季豆在人工氣候箱中飼養(yǎng)繁殖約120多代備用。培養(yǎng)條件為：T=25±1℃，RH=60%±5%，光周期L ∶D=16 h ∶8 h。期間不做其他溫度處理且不接觸任何殺蟲劑。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1主要試劑

考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、α-乙酸萘酯(α-NA)、還原性谷胱甘肽(L-glutathione，GSH)、α-萘酚(α-naphthol，≥99%)、還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH，>98%)：北京索萊寶科技有限公司。毒扁豆堿：甘肅金博研生物科技有限公司、固藍(lán)B鹽：上海源葉生物科技有限公司、乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetra acetic aid，EDTA，≥99.5%)：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司、對(duì)硝基苯酚(P-nitrophenol，≥99.5%)：湖北鑫潤(rùn)德化工有限公司、十二烷基磺酸鈉(sodium lauryl-sulfonate，SDS)、1-氯-2, 4-二硝基苯(1-chloro-2,4-dini-trobenzene，CDNB，≥99%)：上海中秦化學(xué)試劑有限公司。

1.2.2主要儀器

智能人工氣候箱(HQH-H300，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Epoch，美國伯騰儀器有限公司)、高速冷凍離心機(jī)(H1850R，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)、恒溫水浴鍋(S·HH·W 21·420 S，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)、超純水器(UPD-I-20 T，四川優(yōu)普超純科技有限公司)等。

1.3 方法

1.3.1高溫脅迫處理

以25℃為對(duì)照，設(shè)置3個(gè)高溫：36℃、39℃、42℃，每個(gè)溫度的脅迫時(shí)間為2 h、4 h、6 h。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.2酶源蛋白制備及含量測(cè)定

挑取各處理的試螨大約160頭雌成螨于1.5 mL的離心管中，用液氮迅速冷卻并分別加入1.5 mL預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(0.04 mol/L，pH7.0、0.1 mol/L，pH7.8、66 mmol/L，pH7.0)充分研磨后用高速冷凍離心機(jī)離心(4℃，10 000 g，15 min)，取上清液得相應(yīng)的酶源(CarE、MFO、GST)于4℃保存。

參照Bradford(1976)的方法，在酶標(biāo)板中依次加入一定比例的考馬斯亮藍(lán)和酶液，對(duì)照用磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH7.0)代替。37℃反應(yīng)10 min在595 nm處測(cè)定OD值，根據(jù)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量。

1.3.3羧酸酯酶(CarE)比活力測(cè)定

參照何恒果(2010)和Asperen(1962)的方法，在酶標(biāo)孔中依次加入α-乙酸萘酯(含毒扁豆堿)、磷酸緩沖液(0.04 mol/L，pH7.0)、酶液，以α-乙酸萘酯為底物水浴(30℃)反應(yīng)10 min，加入顯色劑(V1 % 固藍(lán)B水溶液: V5 %十二烷基磺酸鈉水溶液=2 ∶5)，于600 nm處測(cè)定其OD值。根據(jù)α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線和蛋白含量以及OD值換算酶比活力(酶比活力單位：μmol/μg/min)。

1.3.4多功能氧化酶(MFO)比活力測(cè)定

參照何恒果(2010)和Shang等(1984)的方法，略有改動(dòng)，在離心管中依次加入對(duì)硝基苯甲醚(0.1 mmol/L)、磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH7.8)、NADPH(1 mmol/L)、酶液，以對(duì)硝基苯甲醚為底物水浴(37℃)反應(yīng)30 min，經(jīng)1 mol/L鹽酸終止反應(yīng)，并用氯仿、氫氧化鈉溶液(0.5 mol/L)進(jìn)行萃取，最終的產(chǎn)物加入酶標(biāo)板于400 nm處測(cè)定OD值。根據(jù)對(duì)硝基苯酚曲線和蛋白含量以及OD值換算酶比活力(酶比活力單位：μmol/μg/min)。

1.3.5谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)比活力測(cè)定

參照何恒果(2010)和Clark等(1984)的方法，以1-氯-2, 4-二硝基苯(0.03 mol/L)為底物與還原性谷胱甘肽，經(jīng)GST作用于37℃反應(yīng)10 min，于340 nm處間隔1 min測(cè)定10 min之內(nèi)的OD值，根據(jù)(Habigetal., 1974)的方法結(jié)合蛋白含量計(jì)算酶比活力(酶比活力單位：μmol/μg/min)。

酶比活力根據(jù)以下公式計(jì)算：

酶比活力=[(ΔOD340·v)/ (ε·L)]/p

式中ΔOD340為吸光度每分鐘的變化值，v為酶促反應(yīng)體系，ε為產(chǎn)物的消光系數(shù)[0.0096 L/(μmol·cm)]，L為光程(1 cm)，p為蛋白含量。

1.3.6酶動(dòng)力常數(shù)測(cè)定

參照Fernley(1974)和Wilkinson(1961)的方法，按比例分別將CarE、MFO、GST的底物α-乙酸萘酯、對(duì)硝基苯甲醚、1-氯-2, 4-二硝基苯稀釋成不同濃度梯度，根據(jù)1.3.3、1.3.4、1.3.5酶比活力的測(cè)定步驟進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖法模型計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Km)和(Vmax)大小。

1.4 數(shù)據(jù)處理

解毒酶比活力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)數(shù)據(jù)均采用Excel 2016和SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和計(jì)算，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

圖1為“閉式側(cè)體旋轉(zhuǎn)型”漿料磨粒磨損試驗(yàn)機(jī)的結(jié)構(gòu)示意圖.其主要結(jié)構(gòu)由三大部分組成：(1)智能控制臺(tái)——精準(zhǔn)設(shè)置并控制運(yùn)轉(zhuǎn)速度、時(shí)間以及各項(xiàng)安全反饋機(jī)制操作，以確保試驗(yàn)機(jī)安全有效地運(yùn)行；(2)一體式電機(jī)減速機(jī)；(3)試驗(yàn)機(jī)主體系統(tǒng).將過流部件試樣加工出一定傾斜角度，裝入容器側(cè)壁，葉片旋轉(zhuǎn)時(shí)使?jié){液旋流沖刷試樣.試驗(yàn)時(shí)，試樣位置如圖2所示.分別對(duì)不同傾角的試樣進(jìn)行試驗(yàn)，以研究相對(duì)沖磨角度對(duì)過流部件磨損的影響規(guī)律[3].

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對(duì)二斑葉螨體內(nèi)三種解毒酶比活力的影響

2.1.1高溫脅迫對(duì)羧酸酯酶(CarE)比活力的影響

高溫脅迫對(duì)二斑葉螨體內(nèi)CarE酶活性有明顯的影響(表1)。經(jīng)高溫脅迫后，CarE比活力均有所上升(除39℃脅迫6 h外)，其中36℃脅迫 4 h、6 h后酶比活力顯著高于脅迫2 h(P<0.05)，但39℃和42℃脅迫后，不同處理時(shí)間的酶比活力之間沒有明顯的差異。同一脅迫時(shí)間下，當(dāng)高溫脅迫2 h后，不同溫度處理的酶比活力之間沒有明顯的差異，但脅迫4 h和6 h后，36℃處理的酶比活力顯著高于39℃和42℃(P<0.05)，其中，39℃處理的酶比活力與對(duì)照沒有明顯的差異。結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)母邷?36℃)可以刺激二斑葉螨體內(nèi)CarE酶活性上升，但較長(zhǎng)時(shí)間的相對(duì)高溫(>36℃)可抑制酶活性的持續(xù)上升。經(jīng)雙因素方差分析，溫度和時(shí)間的交互效應(yīng)顯著(P<0.05)，其中36℃脅迫6 h后可促進(jìn)CarE酶活性的升高，酶比活力達(dá)到最大0.6914±0.0094 μmol/μg/min，是對(duì)照的1.79倍，39℃脅迫6 h后可抑制CarE酶活性的升高，酶比活力降至最低0.3780±0.0137 μmol/μg/min，與對(duì)照相比降低2.32%。

表1 高溫脅迫二斑葉螨對(duì)其羧酸酯酶比活力(μmol/μg/min)的影響Table 1 Effect of high temperature on specific activity of CarE in Tetrarcychus urticae

2.1.2高溫脅迫對(duì)羧酸酯酶(MFO)比活力的影響

高溫脅迫對(duì)二斑葉螨體內(nèi)MFO酶活性的影響如表2所示。經(jīng)高溫脅迫后，MFO比活力均有所上升(除42℃脅迫6 h外)，其中36℃和39℃脅迫后，不同處理時(shí)間的酶比活力之間差異不顯著(P>0.05)，但42℃脅迫4 h和6 h后，酶比活力顯著低于脅迫2 h(P<0.05)。而在相同脅迫時(shí)間下，高溫脅迫2 h后，36℃和42℃處理的酶比活力顯著高于39℃和對(duì)照(P<0.05)；高溫脅迫4 h后，36℃和39℃處理的酶比活力顯著高于42℃和對(duì)照(P<0.05)；高溫脅迫6 h后，36℃和39℃處理的酶比活力顯著高于42℃(P<0.05)。結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)母邷?36℃)可以刺激二斑葉螨體內(nèi)MFO酶活性上升，但較長(zhǎng)時(shí)間的相對(duì)高溫(>36℃)可抑制酶活性的持續(xù)上升。經(jīng)雙因素方差分析，溫度和時(shí)間的交互效應(yīng)顯著(P<0.05)，其中36℃脅迫4 h后可促進(jìn)MFO酶活性的升高，酶比活力達(dá)到最大0.0136±0.0003 μmol/μg/min，是對(duì)照的1.37倍，42℃脅迫6 h后可抑制CarE酶活性的升高，酶比活力降至最低0.0058±0.0004 μmol/μg/min，與對(duì)照相比降低41.83%。

表2 高溫脅迫二斑葉螨對(duì)其多功能氧化酶比活力(μmol/μg/min)的影響Table 2 Effect of high temperature on specific activity of MFO in Tetrarcychus urticae

2.1.3高溫脅迫對(duì)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)比活力的影響

高溫脅迫對(duì)二斑葉螨體內(nèi)GST酶活性的影響如表3所示。經(jīng)高溫脅迫后，GST比活力均有所上升(除42℃脅迫2 h外)，其中36℃和39℃脅迫 4 h 和6 h后酶比活力顯著低于脅迫2 h(P<0.05)，但42℃脅迫4 h后酶比活力顯著高于脅迫2 h(P<0.05)。而在相同脅迫時(shí)間下，高溫脅迫2 h后，36℃處理的酶比活力均顯著高于39℃、42℃和對(duì)照(P<0.05)；高溫脅迫4 h后，36℃和42℃處理的酶比活力與39℃差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于對(duì)照(P<0.05)；高溫脅迫6 h后，36℃處理的酶比活力與39℃和42℃差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于對(duì)照(P<0.05)。結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)母邷?36℃)可以刺激二斑葉螨體內(nèi)GST酶活性上升，但較長(zhǎng)時(shí)間的相對(duì)高溫(>36℃)可抑制酶活性的持續(xù)上升。經(jīng)雙因素方差分析，溫度和時(shí)間的交互效應(yīng)顯著(P<0.05)，其中36℃脅迫2 h后可促進(jìn)GST酶活性的升高，酶比活力達(dá)到最大23.2274±1.3311 μmol/μg/min，是對(duì)照的2.38倍，42℃脅迫2 h后可抑制CarE酶活性的升高，酶比活力降至最低7.8858±1.3935 μmol/μg/min，與對(duì)照相比降低19.14%。

2.2 高溫脅迫對(duì)二斑葉螨體內(nèi)3種解毒酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

2.2.1不同溫度對(duì)解毒酶米氏常數(shù)(Km)的影響

MFO的Km值除在39℃脅迫6 h、42℃脅迫4 h后均高于對(duì)照外，其它處理均低于對(duì)照(圖1-B)。36℃和39℃脅迫后MFO的Km值隨時(shí)間延長(zhǎng)先降低后升高，均在4 h降至最低；42℃脅迫后MFO的Km值隨時(shí)間延長(zhǎng)先升高后降低，4 h時(shí)顯著升高(P<0.05)達(dá)到最大是對(duì)照的1.58倍。相同時(shí)間脅迫下，2 h時(shí)，36、39、42℃脅迫后MFO的Km值均低于對(duì)照，其中39℃和42℃的Km值顯著低于對(duì)照(P<0.05)；4 h時(shí)36℃和39℃脅迫后MFO的Km值均顯著低于對(duì)照(P<0.05)，與對(duì)照相比分別降低37.49%和31.52%；6 h時(shí)，36℃和42℃脅迫后MFO的Km值均低于對(duì)照，與對(duì)照相比分別降低1.46%、39.49%。

GST的Km值僅在36℃脅迫2 h時(shí)低于對(duì)照外，其它處理均高于對(duì)照(圖1-C)。36℃脅迫后GST的Km值隨時(shí)間延長(zhǎng)先升高后降低，4 h時(shí)達(dá)到最大，39℃、42℃脅迫后GST的Km值隨時(shí)間延長(zhǎng)先降低后升高，均在4 h時(shí)降至最低。相同時(shí)間脅迫下，2 h時(shí)，39℃和42℃脅迫后GST的Km值均顯著高于對(duì)照(P<0.05)，而36℃脅迫后GST的Km值低于對(duì)照，與對(duì)照相比降低10.75%；4 h、6 h時(shí)，36℃、39℃、42℃脅迫后GST的Km值均高于對(duì)照以上結(jié)果說明高溫脅迫二斑葉螨后，其體內(nèi)MFO與底物的親和力程度高于CarE和GST。

圖1 高溫脅迫二斑葉螨對(duì)其解毒酶米氏常數(shù)(Km)的影響Fig.1 Effect of high temperature on Km of detoxification enzymes in Tetrarcychus urticae注：A，羧酸酯酶；B，多功能氧化酶；C，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。圖中不同大寫字母代表Km值在同一溫度不同時(shí)間之間經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母代表Km值在同一時(shí)間不同溫度之間經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。Notes: A, CarE; B, MFO; C, GST. The different capitals in the figure indicated the significantly differences of Km in the same temperature exposured to different time tested by Duncan’s new multiple range method (P<0.05), lowercases indicated the significantly differences of Km in the same time exposured to different temperature tested by Duncan’s new multiple range method (P<0.05).

2.2.2高溫脅迫對(duì)解毒酶最大反應(yīng)速率(Vmax)的影響

CarE的Vmax值除在36℃脅迫2 h、4 h后低于對(duì)照外，其它處理均高于對(duì)照(圖2-A)。36℃、42℃脅迫后CarE的Vmax值隨時(shí)間延長(zhǎng)先降低后升高，均在4 h降至最低，39℃脅迫后CarE的Vmax值隨時(shí)間延長(zhǎng)先升高后降低，4 h時(shí)升至最高，是對(duì)照的2.43倍。相同時(shí)間脅迫下，2 h時(shí)，39℃和42℃脅迫后CarE的Vmax值均顯著高于對(duì)照(P<0.05)，分別是對(duì)照的2.05倍和2.64倍；4 h時(shí)，39℃和42℃脅迫后CarE的Vmax值均高于對(duì)照；6 h時(shí)，36℃、39℃、42℃脅迫后CarE的Vmax值均高于對(duì)照，分別是對(duì)照的2.43倍、1.23倍、1.81倍。

圖2 高溫脅迫二斑葉螨對(duì)其解毒酶最大反應(yīng)速率(Vmax)的影響Fig.2 Effect of high temperature on Vmax of detoxification enzymes in Tetrarcychus urticae注：A，羧酸酯酶；B，多功能氧化酶；C，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。圖中不同大寫字母代表Vmax值在同一溫度不同時(shí)間之間經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母代表Vmax值在同一時(shí)間不同溫度之間經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。Notes: A，CarE; B，MFO; C，GST. The different capitals in the figure indicated the significantly differences of Vmax in the same temperature exposured to different time tested by Duncan’s new multiple range method (P<0.05), lowercases indicated the significantly differences of Vmax in the same time exposured to different temperature tested by Duncan’s new multiple range method (P<0.05).

MFO的Vmax值僅在42℃脅迫4 h后低于對(duì)照，其它處理均高于對(duì)照(圖2-B)。39℃脅迫后MFO的Vmax值隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，6 h時(shí)升至最高，顯著高于對(duì)照(P<0.05)，36℃和42℃脅迫后MFO的Vmax值隨時(shí)間延長(zhǎng)先降低后升高，均在4 h時(shí)降至最低。相同時(shí)間脅迫下，2 h時(shí)，36℃、39℃、42℃脅迫后MFO的Vmax值均顯著高于對(duì)照(P<0.05)，分別是對(duì)照的1.37倍、1.33倍、1.27倍；4 h時(shí)，36℃脅迫后MFO的Vmax值高于對(duì)照，39℃脅迫后MFO的Vmax值顯著高于對(duì)照(P<0.05)；6 h時(shí)，36℃、39℃、42℃脅迫后MFO的Vmax值均顯著高于對(duì)照(P<0.05)，分別是對(duì)照的2.28倍、2.31倍、1.55倍。

所有處理下GST的Vmax值均高于對(duì)照(圖2-C)。36℃、39℃、42℃脅迫后GST的Vmax值隨時(shí)間延長(zhǎng)先降低后升高，均在4 h時(shí)降至最低。相同時(shí)間脅迫下，2 h、4 h、6 h時(shí)，36℃、39℃、42℃脅迫后GST的Vmax值均高于對(duì)照；2 h、4 h時(shí)，39℃脅迫后GST的Vmax值分別高于36℃和42℃；6 h時(shí)，39℃脅迫后GST的Vmax值分別顯著高于36℃和42℃(P<0.05)。

以上結(jié)果說明高溫脅迫二斑葉螨后，其體內(nèi)GST與底物的反應(yīng)速率快于MFO和CarE。

3 結(jié)論與討論

作為變溫動(dòng)物，螨和昆蟲一樣，對(duì)環(huán)境變化均比較敏感，尤其是極端高溫脅迫會(huì)在很大程度上影響它們的生理代謝和生存。研究發(fā)現(xiàn)，在一定的脅迫強(qiáng)度范圍內(nèi)，昆蟲能通過調(diào)整體內(nèi)的生理代謝、酶類、形態(tài)和行為等來應(yīng)對(duì)逆境脅迫(李寧等, 2016)。與昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)的酯酶(保幼激素)會(huì)通過抑制昆蟲變態(tài)或阻止成蟲器官發(fā)育來應(yīng)對(duì)逆境脅迫(白晶晶等, 2020)，與解毒代謝相關(guān)的羧酸酯酶(CarE)可通過螯合或阻隔作用來分解和催化對(duì)昆蟲機(jī)體有害的物質(zhì)(李永強(qiáng), 2012)；多功能氧化酶(MFO)分布在昆蟲的多種組織和器官中，能對(duì)一些外源或內(nèi)源毒素進(jìn)行氧化代謝，使昆蟲能夠極大提升自我保護(hù)和適應(yīng)逆境脅迫的能力(Feyereisen, 1999)；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)可與某些特異的內(nèi)源或外源有毒物質(zhì)結(jié)合進(jìn)而降低有毒物質(zhì)的細(xì)胞毒性，達(dá)到解毒的作用(Kuetal., 1994)。

本研究發(fā)現(xiàn)，二斑葉螨雌成螨經(jīng)高溫脅迫后，其體內(nèi)解毒酶活力均發(fā)生變化。CarE的比活力均高于對(duì)照(除39℃脅迫6 h外)，這與Guo等(2018)發(fā)現(xiàn)高溫脅迫導(dǎo)致Q型煙粉虱Bemisiatabaci體內(nèi)CarE比活力上升的研究結(jié)果一致，但與高溫脅迫導(dǎo)致小菜蛾P(guān)lutellaxylostella體內(nèi)CarE比活力下降的結(jié)果不同(劉群, 2009)，研究結(jié)果不一致的原因可能是由于高溫對(duì)二斑葉螨、煙粉虱、小菜蛾的生理損傷程度不同，從而導(dǎo)致酶代謝過程中酶與底物的結(jié)合能力升高或下降引起的(Neven, 2000)。MFO的比活力也均高于對(duì)照(除42℃脅迫6 h外)，這與高溫脅迫導(dǎo)致綠盲蝽體內(nèi)MFO比活力下降的結(jié)果相反(馬云華, 2012)，可能是由于昆蟲或螨體內(nèi)內(nèi)分泌調(diào)控對(duì)高溫的響應(yīng)不同，從而促進(jìn)或抑制了一些內(nèi)分泌激素的合成間接影響MFO的相關(guān)基因表達(dá)(姚洪渭, 2001)。GST的酶比活力同樣均高于對(duì)照(除42℃脅迫2 h外)，這與高溫脅迫橘小實(shí)蠅Bactroceradorsalis(夾福先, 2012)和柑橘全爪螨PanonchuscitriMc Gregor(楊麗紅, 2011)誘導(dǎo)它們體內(nèi)GST比活力上升的結(jié)果相似，另外，Zhangetal.(2015)研究報(bào)道小菜蛾經(jīng)36℃和42℃脅迫1 ～ 24 h后，其體內(nèi)GST的比活力顯著上升，也與本文的研究結(jié)果一致，說明GST在螨或昆蟲抗高溫的過程中發(fā)揮了一定的作用。

高溫脅迫對(duì)二斑葉螨雌成螨體內(nèi)解毒酶的影響因溫度高低而有所差異。相比較39℃和42℃，36℃會(huì)極大促進(jìn)二斑葉螨雌成螨體內(nèi)CarE、MFO、GST的表達(dá)，使酶比活力升高。究其原因可能是36℃以上的高溫會(huì)破壞二斑葉螨體內(nèi)內(nèi)環(huán)境的保水系統(tǒng)導(dǎo)致水平衡失調(diào)使?jié)B透壓升高(Salinetal., 1999)，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不可恢復(fù)的生理損傷導(dǎo)致解毒酶活力下降；也有可能是高溫破壞了二斑葉螨體內(nèi)某些細(xì)胞的膜蛋白使細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性(Fields, 2002)降低或喪失，導(dǎo)致酶的轉(zhuǎn)運(yùn)速率降低進(jìn)而影響解毒酶的表達(dá)。

高溫脅迫對(duì)二斑葉螨雌成螨體內(nèi)解毒酶的影響因處理時(shí)間不同而不同。36℃和39℃脅迫后GST比活力隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸降低的趨勢(shì)，這與高溫脅迫西花薊馬(鄭玉濤, 2015)和蘿卜蚜(李蘋, 2013)導(dǎo)致它們體內(nèi)GST比活力隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低的結(jié)果相似。我們推測(cè)，GST比活力的變化可能與高溫脅迫氧化應(yīng)激而產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物(An and Choi, 2010；Marutanietal., 2010)有關(guān)，隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)脂質(zhì)過氧化物被GST清除后濃度降低，進(jìn)而導(dǎo)致GST的比活力降低。36℃和39℃脅迫后MFO比活力變化均呈先上升后下降的趨勢(shì)， 42℃脅迫后CarE和GST比活力的變化也呈相同的趨勢(shì)。說明高溫脅迫對(duì)二斑葉螨生理代謝有著不利的影響，二斑葉螨對(duì)高溫脅迫較為敏感，這種敏感程度隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而表現(xiàn)出差異性。

Km和Vmax是酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，Km值的變化代表酶與底物的親和力程度，Vmax值的變化反應(yīng)了酶催化底物反應(yīng)的速率大小(尚素琴和薛玉麗, 2019)。前期研究都是從Km值和Vmax值的變化為依據(jù)研究螨的抗藥性機(jī)制(何林等, 2003; 常蕓等, 2020)，而在本試驗(yàn)中，我們以Km值和Vmax值的變化來分析高溫脅迫后二斑葉螨雌成螨體內(nèi)解毒酶量變和質(zhì)變的差異性。與CarE和GST比較，高溫脅迫后二斑葉螨雌成螨體內(nèi)MFO的Km值均低于對(duì)照(除39℃處理6 h、42℃處理4 h)，Vmax值也同樣均高于對(duì)照(除42℃處理4 h)，MFO的Km值和Vmax值的變化量綜合反映了MFO與底物存在較高的親和力并且極大提高了代謝反應(yīng)速率，這說明MFO在二斑葉螨適應(yīng)高溫脅迫代謝中承擔(dān)主要作用。

二斑葉螨可通過調(diào)節(jié)自身體內(nèi)解毒酶(CarE、MFO、GST)比活力變化來代謝或清除高溫脅迫產(chǎn)生的有害物質(zhì)，從而維持其機(jī)體的正常生理代謝。通過對(duì)解毒酶活力和酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的綜合比較，發(fā)現(xiàn)3種解毒酶均有可能參與到二斑葉螨抗高溫的代謝過程中，而MFO在應(yīng)對(duì)高溫脅迫解毒的響應(yīng)中可能起主導(dǎo)作用。本研究?jī)H從解毒酶的酶比活力和酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)水平來探討二斑葉螨如何應(yīng)對(duì)高溫脅迫，而分子水平的響應(yīng)有待更進(jìn)一步的研究。