谷氨酸鈉攝入引起的果蠅腸道菌群多樣性變化研究

王丹鳳，謝甲鈺，楊 廣*，陳文鋒*

(1. 福建農林大學應用生態(tài)研究所，福州 350002；2. 福州大學生物科學與工程學院，福州 350108)

谷氨酸鈉(Monosodium Glutamate，MSG)是氨基酸的一種鈉鹽，其是調味料“味精”的主要成分。MSG是一種增味劑，通常添加到食品、蔬菜罐頭、湯和加工的肉中。美國食品和藥物管理局(FDA)已將MSG歸類為“通常被認為是安全的”食品成分，但其使用仍存在爭議(Walker and Lupien, 2000)。因此，將MSG添加到食品中時，F(xiàn)DA要求將其列在標簽上(Lavine, 2007)。

MSG已被用作食品添加劑數(shù)十年。多年來，F(xiàn)DA收到許多有關含MSG食品引起不良反應的傳聞。這些反應被稱為MSG癥候群，包括：頭痛、出汗、面部壓力或緊繃，臉、頸部和其他區(qū)域出現(xiàn)麻木、刺痛或灼痛，快速的、顫動的心跳(心)、胸痛、惡心等(Gehaetal., 2000)。但是，研究人員沒有找到有關MSG與這些癥狀之間聯(lián)系的明確證據(jù)(Jinap and Hajeb, 2010)。不過，研究人員承認，一小部分人可能會對MSG產生短期反應，癥狀通常較輕，不需要治療，防止反應的唯一方法是避免食物中含有MSG。

腸道不僅是人體消化吸收的重要場所，同時在維持正常免疫防御功能中發(fā)揮著極其重要的作用。作為人體最龐大、最復雜的微生態(tài)系統(tǒng)，腸道中存在數(shù)量龐大的微生物，腸道菌群及其代謝產物不僅能調節(jié)人體健康，而且在膳食和宿主之間起到了重要的橋梁作用(Neish, 2009; Clementeetal., 2012)。但是，關于MSG攝入是否改變腸道菌群組成還未見報道。16S rRNA位于原核細胞核糖體小亞基上，包括10個保守區(qū)域(Conserved Regions)和9個高變區(qū)域(Hypervariable Regions)，其中保守區(qū)在細菌間差異不大，高變區(qū)具有屬或種的特異性，隨親緣關系不同而有一定的差異。因此，16S rDNA可以做為揭示生物物種的特征核酸序列，被認為是最適于細菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的指標(Youssefetal., 2009; Caporasoetal., 2011; Hessetal., 2011)。16S rDNA擴增子測序(16S rDNA Amplicon Sequencing)，通常是選擇某個或某幾個變異區(qū)域，利用保守區(qū)設計通用引物進行PCR擴增，然后對高變區(qū)進行測序分析和菌種鑒定。16S rDNA擴增子測序技術已成為研究環(huán)境樣品中微生物群落組成結構的重要手段(Youssefetal., 2009; Caporasoetal., 2011; Hessetal., 2011)。黑腹果蠅作為重要的模式生物，與高等動物相比，存在很高比例的同源基因，一直是各種生物學問題研究很好的模式(Uguretal., 2016; Staatsetal., 2018)。本文利用黑腹果蠅作為材料，利用16S rDNA測序研究其腸道響應MSG攝入的微生物組成變化，以期為理解MSG攝入對腸道菌群的影響提供更多的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 果蠅培養(yǎng)及處理

本研究所用果蠅為行為實驗常用的果蠅，基因型為w1118(Bloomington果蠅保種中心編號為BS5905)。飼養(yǎng)于含有0.75%大豆粉、4.5%玉米粉、1.5%酵母、0.5%丙酸、0.1%尼泊金甲酯、0.02%玉米糖漿、1.25%蔗糖、1.25%葡萄糖、0.5%瓊脂的食物中。飼養(yǎng)條件為25℃，光周期L ∶D=12 h ∶12 h。收集羽化后2～3 d的果蠅30頭，用含有或不含有1% MSG(上海生物工程生物有限公司，A602012)的蔗糖培養(yǎng)基(5%蔗糖，1%瓊脂進行飼養(yǎng)(培養(yǎng)基經過高溫高壓滅菌處理)，第4天的Zeitgeber Time 2(ZT2)(ZT0為開燈時間，ZT12為關燈時間)收集果蠅腹部樣品并-80℃凍存。所有化學試劑采購自國藥集團化學試劑有限公司或上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 測序樣品準備及測序分析

采用通用型柱式基因組DNA提取試劑盒對基因組DNA進行提取(北京康為世紀生物科技有限公司，CW2298)，按照說明書操作從果蠅腹部提取總DNA。提取裂解液中加入終濃度為0.1 mg/mL的溶菌酶(北京康為世紀生物科技有限公司，CW0887S)。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，使用帶標簽序列(Barcode)的16S V4區(qū)特異引物(515F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGG TAA-3′和806R:5′-GGACTACHVHHHTWTCTAAT-3′)(Caporasoetal., 2011)，Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行PCR(ThermoFisher, F532S)，確保擴增效率和準確性。PCR產物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據(jù)PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用1×TAE 2%瓊脂糖膠電泳純化PCR產物，剪切回收目標條帶。使用GeneJET膠回收試劑盒回收產物(Thermo Fisher, K0629)。最后使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒(ThermoFisher, 4471252)進行文庫的構建，構建好的文庫經過Qubit(ThermoFisher, Q33266)定量和文庫檢測合格后，使用的Ion S5TMXL(ThermoFisher, A27214)進行上機測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)的處理

使用Cutadapt(V1.9.1, http://cutadapt.read thedocs.io/en/stable/)(Asshaueretal., 2015)先對測序讀值(Reads)進行低質量部分剪切，再根據(jù)Barcode從得到的Reads中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列初步質控得到原始數(shù)據(jù)(Raw Reads)。經過以上處理后得到的Reads進行嵌合體序列去除，Reads序列通過(https://github.com/torognes/vsearch/)與物種注釋數(shù)據(jù)庫進行比對檢測嵌合體序列，并去除其中的嵌合體序列(Rognesetal., 2016)，得到最終的有效數(shù)據(jù)(Clean Reads)。

1.4 OTU聚類和物種注釋

高通量測序得到的16S序列有成千上萬條，如果對每條序列都進行物種注釋的話，工作量大、耗時長，而且16S擴增、測序等過程中出現(xiàn)的錯誤會降低結果的準確性。因此，在16S分析中引入分類操作單位(Operational Taxonomic Units, OTUs)，對相似性序列進行聚類，分成數(shù)量較少的分類單元，基于分類單元進行物種注釋。這不僅簡化工作量，提高分析效率，而且OTU在聚類過程中會去除一些測序錯誤的序列，提高分析的準確性。利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001,http://www. drive5.com/uparse/)(Haasetal., 2011)對所有樣品的全部Clean Reads進行聚類，默認以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs，同時選取OTUs的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。對OTUs序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA132(http://www.arb-silva.de/)(Edgar, 2013)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(Wangetal., 2007)進行物種注釋分析(設定閾值為0.8～1)，獲得分類學信息并分別在各個分類水平：界(Kingdom)，門(Phylum)，綱(Class)，目(Order)，科(Family)，屬(Genus)，種(Species)統(tǒng)計各樣本的群落組成。使用MUSCLE(Quastetal., 2013)(Version 3.8.31, http://www.drive5. com/muscle/)軟件進行快速多序列比對，得到所有OTUs序列的系統(tǒng)發(fā)生關系。最后對各樣品的數(shù)據(jù)進行均一化處理，以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標準進行均一化處理，后續(xù)的α多樣性分析和β多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

1.5 樣本復雜度分析(α多樣性)

α多樣性(αDiversity)用于分析樣本內(Within-community)的微生物群落多樣性(Lietal., 2013)，通過單樣本的α多樣性分析可以反映樣本內的微生物群落的豐富度和多樣性，包括用一系列統(tǒng)計學分析指數(shù)、物種多樣性曲線等來評估各樣本中微生物群落的物種豐富度和多樣性的差異。稀釋曲線(Rarefaction Curve)和等級聚類曲線(Rank Abundance)是常見的描述組內樣本多樣性的曲線。稀釋曲線是從樣本中隨機抽取一定測序量的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計它們所代表物種數(shù)目(即OTUs數(shù)目)，以抽取的測序數(shù)據(jù)量與對應的物種數(shù)來構建曲線。稀釋曲線直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣本中物種的豐富程度，當曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量漸進合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產生少量新的物種(OTUs)。等級聚類曲線是將樣本中的OTUs按相對豐度(或者包含的序列數(shù)目)由大到小排序得到對應的排序編號，再以OTUs的排序編號為橫坐標，OTUs中的相對豐度(也可用該等級OTU中序列數(shù)的相對百分含量)為縱坐標，將這些點用折線連接，即繪制得到Rank Abundance曲線，它可直觀的反映樣本中物種的豐富度和均勻度。在水平方向上，物種的豐富度由曲線的寬度來反映，物種的豐富度越高，曲線在橫軸上的跨度越大；在垂直方向上，曲線的平滑程度，反映了樣本中物種的均勻程度，曲線越平緩，物種分布越均勻(Lundbergetal., 2013)。使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算Observed-otus、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Goods-coverage和PD_whole_tree指數(shù)，使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線和Rank abundance曲線，并使用R軟件進行α多樣性指數(shù)組間差異分析；α多樣性指數(shù)組間差異分析進行非參數(shù)wilcox檢驗。

1.6 多樣本比較分析(β多樣性)

β多樣性(βDiversity)是對不同樣本的微生物群落構成進行比較分析。首先根據(jù)所有樣本的物種注釋結果和OTUs的豐度信息，將相同分類的OTUs信息合并處理得到物種豐度信息表(Profiling Table)。同時利用OTUs之間的系統(tǒng)發(fā)生關系，進一步計算Unifrac距離(Unweighted Unifrac)(Lozuponeetal., 2007; Lozuponeetal., 2011)。Unifrac距離是一種利用各樣本中微生物序列間的進化信息計算樣本間距離，兩個以上的樣本，則得到一個距離矩陣。然后，利用OTUs的豐度信息對Unifrac距離(Unweighted Unifrac)進一步構建Weighted Unifrac距離(Lozuponeetal., 2007)。最后，通過多變量統(tǒng)計學方法主成分分析(PCA, Principal Component Analysis)、主坐標分析(PCoA, Principal Co-ordinates Analysis)、無度量多維標定法(NMDS, Non-Metric Multi-Dimensional Scaling)等方法，從中發(fā)現(xiàn)不同樣本(組)間的差異。用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算Unifrac距離。使用R軟件(Version 2.15.3)繪制主成分分析(PCA, Principal Component Analysis)，主坐標分析(Principal Co-ordinates Analysis, PCoA)和無度量多維標定法(Non-Metric Multi-Dimensional Scaling, NMDS)圖。PCA分析使用R軟件的ade4包和ggplot2軟件包，PCoA分析使用R軟件的WGCNA、stats和ggplot2軟件包，NMDS分析使用R軟件的vegan軟件包。

2結果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)的質量

本研究選擇16S V4區(qū)對對照組(Control)和MSG飼喂組(MSG)果蠅腸道菌群進行擴增測序，將IonS5TMXL下機數(shù)據(jù)導出fastq文件。根據(jù)barcode序列區(qū)分各個樣本數(shù)據(jù)。然后進行嵌合體過濾，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)，即Clean Reads。數(shù)據(jù)處理過程中各步驟得到的序列統(tǒng)計結果見表1?？梢钥闯?，所有樣品中Clean Reads中堿基質量值大于20(測序錯誤率小于1%)的堿基所占的百分比均大于80%，Clean Reads的數(shù)目與Raw Reads數(shù)目的百分比均在90%以上，說明測序結果準確，整體數(shù)據(jù)質量比較高(表1)。

表1 測序數(shù)據(jù)預處理統(tǒng)計及質控

2.2 MSG攝入對腸道菌群組成的影響

為研究各樣本的腸道菌群物種組成，對所有樣本的有效序列(Effective Tags)，以97%的一致性(Identity)進行OTUs聚類，然后對OTUs的代表序列進行物種注釋。為了快速直觀的展示樣本中的物種組成及豐度信息，本研究構建了OTUs對應的物種注釋熱圖，以每個OTUs大于1 000個讀值進行過濾，發(fā)現(xiàn)MSG組腸道菌群更為復雜(圖1A)。同時，本研究使用KRONA(Ondovetal., 2011)對物種注釋結果進行可視化展示，也得到類似結果(圖1B-C)。這些結果顯示：與對照組相比，MSG飼喂組腸道菌群組成確實發(fā)生了明顯變化，MSG組腸道菌群組成更為復雜(圖1)。

2.3 MSG對腸道菌群物種分布的影響

根據(jù)物種注釋結果，本研究選取每個樣本在各分類水平(門Phylum、綱Class、目Order、科Family、屬Genus、種Species)上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖，以便直觀查看各樣本在不同分類水平上，相對豐度較高的物種及其比例。結果顯示MSG飼喂組相比對照組，厚壁桿菌門Firmicutes、芽孢桿菌綱Bacilli、乳桿菌目Lactobacillales、乳桿菌科Lactobacillaceae豐度顯著升高，而屬種水平差異從該分析上看不出，被歸為其它類(圖2)。

圖2 各分類水平上的物種相對豐度柱形圖Fig.2 Histogram of species relative abundance at each classification level注：橫坐標是樣本名；縱坐標表示相對豐度；Others表示圖中這10個門之外的其他所有門的相對豐度之和。Note: The abscissa was the sample name; the ordinate represented the relative abundance. Others represented the sum of the relative abundances of all other groups except 10 groups in the figure.

圖3 物種豐度聚類圖Fig.3 Cluster map of species abundance注：縱向為樣本信息，橫向為物種注釋信息，圖中左側的聚類樹為物種聚類樹；熱圖對應的值為每一行物種相對豐度經過標準化處理后得到的Z值，即一個樣本在某個分類上的Z值為樣本在該分類上的相對豐度和所有樣本在該分類的平均相對豐度的差除以所有樣本在該分類上的標準差所得到的值。Note: The sample information was in the vertical direction, and the species annotation information was in the horizontal direction. The cluster tree on the left in the figure was the species cluster tree. The corresponding value of the heat map was the Z value obtained by normalizing the relative abundance of the species in each row. The Z value of a category was the difference between the relative abundance of the samples in the category and the average relative abundance of all samples in the category divided by the standard deviation of all the samples in the category.

于是，根據(jù)對照組和MSG飼喂組不同分組在各分類水平(門Phylum、綱Class、目Order、科Family、屬Genus)上的物種注釋及豐度信息，本研究進一步選取豐度排名處于前35的信息，根據(jù)其在每個分組中的豐度信息，從物種和分組兩個層面進行聚類，繪制成熱圖，便于發(fā)現(xiàn)哪些物種在哪個分組中聚集較多或含量較低。結果也顯示MSG飼喂組相比對照組，厚壁桿菌門Firmicutes、芽孢桿菌綱Bacilli、乳桿菌目Lactobacillales、乳桿菌科Lactobacillaceae、乳桿菌屬Lactobacillus豐度顯著升高(圖3)。

另外，本研究還利用LEfSe(LDA Effect Size)分析群落結構差異，找出MSG飼喂組和對照組間豐度變化差異顯著的物種及其在兩個分組間的富集情況。LEfSe的統(tǒng)計結果包括三部分，分別是LDA值分布柱狀圖，進化分支圖(系統(tǒng)發(fā)育分布)和組間具有統(tǒng)計學差異的Biomarker在不同組中豐度比較圖(Segataetal., 2011)。LDA值分布柱狀圖顯示MSG組和對照組間具有統(tǒng)計學差異的Biomarker共12個，其中影響最大的差異物種為乳桿菌目Lactobacillales和變形菌門Proteobacteria(圖4 A)。進化分支圖顯示兩個重要分支為厚壁桿菌門Firmicutes和變形菌門Proteobacteria，厚壁桿菌門中的重要成員就包括芽孢桿菌綱(Bacilli)、乳桿菌目Lactobacillales和腸桿菌科Enterococcaceae(圖4 B)。與前面結果一致，LEfSe豐度比較圖也顯示MSG飼喂組相比對照組，厚壁桿菌門、芽孢桿菌綱Bacilli、乳桿菌目豐度顯著升高(圖4 C)。

圖4 物種豐度的LEfSe分析Fig.4 LEfSe analysis of species abundance注：LDA值分布柱狀圖中展示了LDA Score大于設定值(默認設置為4)的物種，即組間具有統(tǒng)計學差異的Biomarker。展示了不同組中豐度差異顯著的物種，柱狀圖的長度代表差異物種的影響大小(即為LDA Score)。在進化分支圖中，由內至外輻射的圓圈代表了由門至屬(或種)的分類級別。在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類，小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比。著色原則：無顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色，差異物種Biomarker跟隨組進行著色，紅色節(jié)點表示在紅色組別中起到重要作用的微生物類群，綠色節(jié)點表示在綠色組別中起到重要作用的微生物類群，若圖中某一組缺失，則表明此組中并無差異顯著的物種，故此組缺失。圖中英文字母表示的物種名稱在右側圖例中進行展示。Note: The LDA value distribution histogram showed the species with an LDA Score greater than the set value (the default setting was 4), that was, biomarker with statistical differences between groups. Species with significantly different abundances in different groups were shown, and the length of the histogram represented the magnitude of the impact of the different species (ie, LDA Score). In the evolutionary branch diagram, the circle radiating from the inside to the outside represented the classification level from the door to the genus (or species). Each small circle at a different classification level represented a classification at that level, and the diameter of the small circle was proportional to the relative abundance. Coloring principle: The species with no significant difference were uniformly colored yellow, and the different species Biomarker followed the group for coloring. The red node indicated the microbial group that played an important role in the red group, and the green node indicated that it played an important role in the green group. Microbial groups, if a group was missing in the picture, it means that there were no significant differences in species in this group, so this group was missing. The names of the species indicated by the English letters in the figure were shown in the legend on the right.

2.4 MSG對腸道菌群α多樣性的影響

本研究首先對不同樣本在97%一致性閾值下的α多樣性分析指數(shù)(Shannon、Simpson、Chao1、ACE、Goods_coverage、PD_whole_tree)進行統(tǒng)計，Shannon和Simpson指數(shù)統(tǒng)計結果顯示MSG飼喂組和對照組相比，微生物群落多樣性組成存在顯著差異(表2)。另外，本研究還通過稀釋曲線和等級聚類曲線來分析物種豐富度和多樣性的差異。與α多樣性分析指數(shù)結果一致，物種多樣性曲線分析也顯示MSG飼喂組和對照組相比，微生物群落多樣性組成存在差異(圖5)。

表2 α多樣性指數(shù)統(tǒng)計表

圖5 稀釋曲線和等級聚類曲線Fig.5 Rarefaction and rank curves

2.5 MSG對腸道菌群β多樣性的影響

基于Weighted Unifrac或Unweighted Unifrac距離的PCoA分析顯示MSG飼喂組和對照組微生物群落存在顯著差異(圖6)。基于OTUs水平的主成分PCA分析和無度量多維標定NMDS分析也得到類似結果(圖6)。

圖6 β多樣性分析Fig.6 β diversity analysis

3 結論與討論

MSG攝入可顯著引起果蠅腸道菌群組成變化。長期飲食攝入會影響宿主腸道中微生物的結構和活性，且可快速、可重復地改變宿主腸道菌群(Davidetal., 2014)。反之，腸道菌群也可快速反饋與飲食結構相關的變化，促進宿主飲食方式的多樣性，影響宿主營養(yǎng)狀況。例如，果蠅腸道細菌攝入的糖決定了果蠅的脂質含量，與無菌果蠅相比，腸道含有醋桿菌的果蠅脂質含量更低(Huang and Douglas, 2015)。本研究首次證明MSG的攝入可以顯著引起果蠅腸道菌群組成變化，為理解MSG攝入對生物個體的影響提供了新的研究思路。

MSG攝入顯著提高了果蠅腸道乳桿菌屬Lactobacillus的組成。果蠅的腸道菌群至少包含 5～20種細菌，其中乳桿菌屬Lactobacillus和醋桿菌屬Acetobacter是實驗室飼養(yǎng)的果蠅腸道菌群的優(yōu)勢菌群(Wongetal., 2013)。乳桿菌屬Lactobacillus也是最常見的人類益生菌(Walter, 2008)。腸道是暴露于影響宿主生理的環(huán)境信號的主要管道，并通過神經元和血淋巴連接到大腦，腸道菌群會影響包括大腦在內的許多器官的功能。諸多研究表明，腸道與大腦之間的雙向交流可以影響包括焦慮、認知、傷害感受和社交互動在內的多種行為(Diaz Heijtzetal., 2011)。最近一項研究證明乳桿菌在果蠅中可以通過細菌木糖異構酶調節(jié)果蠅運動行為，并確定了章魚胺能神經元在其中起到媒介作用(Schretteretal., 2018)，揭示了腸道菌群在調節(jié)運動中的新作用。本研究揭示MSG攝入顯著提高了果蠅腸道乳桿菌屬Lactobacillus的組成，其功能有待進一步研究。

不同物質攝入對腸道菌群影響各異。比如高鹽攝入可提高老鼠腸道克里斯滕森菌科Christensenellaceae和棒狀桿菌科Corynebacteriaceae的含量(Bieretal., 2018)。低脂攝入提高人類腸道中布勞特氏菌Blautia和棲糞桿菌屬Faecalibacterium水平，而高脂攝入增加另枝菌屬Alistipes和擬桿菌屬Bacteroides水平，降低棲糞桿菌屬Faecalibacterium水平(Wanetal., 2019)。MSG對腸道乳桿菌的影響有待在其它物種中進一步探討。