微量生物物證提取套裝在現(xiàn)場(chǎng)微量血痕DNA檢驗(yàn)中的應(yīng)用

巴華杰，金明，石津瑋，朱愛(ài)華，馬駿

常州市公安局物證鑒定所，江蘇 常州213003

隨著DNA 檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，能成功獲得DNA 分型的生物物證所需DNA 含量已經(jīng)從納克級(jí)減少到皮克級(jí)，甚至單個(gè)細(xì)胞也可能成功檢出[1]。如何盡可能將現(xiàn)場(chǎng)生物物證進(jìn)行轉(zhuǎn)移提取，不斷提升DNA 檢出率是目前一直探索的問(wèn)題[2-3]。微量生物物證的類型、載體表面的性狀以及提取工具的選擇均會(huì)影響DNA檢驗(yàn)的成功率[4-5]。雖然行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[6]規(guī)定提取的生物物證應(yīng)當(dāng)晾干后放入透氣紙質(zhì)物證袋內(nèi)低溫、干燥保存，但并沒(méi)有規(guī)定生物物證放置的具體操作技術(shù)規(guī)范和評(píng)價(jià)指標(biāo)。實(shí)際工作中較為常見(jiàn)的做法[7-8]是，采用棉簽蘸純水“干濕兩步法”提取現(xiàn)場(chǎng)微量生物物證，提取后放入紙質(zhì)物證袋內(nèi)進(jìn)行送檢。該方法可能存在的不足有：（1）棉簽蘸純水進(jìn)行擦拭后放入物證袋內(nèi)后，在溫度較高的夏天，尤其是我國(guó)南方地區(qū)，棉簽處于潮濕狀態(tài)下，生物物證容易產(chǎn)生腐敗，還可能有霉菌生長(zhǎng)，對(duì)生物物證中的DNA 造成嚴(yán)重破壞；（2）在送檢過(guò)程中，棉簽與物證袋內(nèi)壁可能進(jìn)行反復(fù)摩擦，造成生物物證的轉(zhuǎn)染損失[8]，致使后續(xù)的DNA 檢出率大大降低；（3）所采用的物證袋多沒(méi)有經(jīng)過(guò)外源DNA滅活處理，物證袋所用材料及物證袋在生產(chǎn)過(guò)程中很可能會(huì)被接觸過(guò)的外源DNA 污染，同時(shí)因環(huán)節(jié)眾多、質(zhì)量控制樣本也難以建立。針對(duì)上述問(wèn)題，本研究將可推式棉簽2 根、生物檢材采集保護(hù)液0.3 mL、離心套管1 個(gè)預(yù)封裝在一個(gè)多功能物證袋內(nèi)，組成微量生物物證提取套裝，以期解決現(xiàn)場(chǎng)微量生物物證現(xiàn)場(chǎng)提取及送檢中存在的問(wèn)題，有效提升微量生物物證的DNA 檢出率。本研究采用平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，將微量生物物證提取套裝提取模擬現(xiàn)場(chǎng)微量血痕的DNA 檢驗(yàn)效果與普通法進(jìn)行對(duì)比，以評(píng)估“微量生物物證提取套裝”在提取現(xiàn)場(chǎng)微量生物物證中的DNA 檢驗(yàn)效果。

1 材料與方法

1.1 樣本準(zhǔn)備

1 名志愿者提供的外周靜脈血2 mL，于乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝管保存。采集血樣后4 h 內(nèi)，用移液器將1 μL 血樣滴于附有灰塵的樓道地面上，制成地面血痕以模擬現(xiàn)場(chǎng)微量血痕，共計(jì)500 份。

1.2 主要儀器與試劑

Ther-Mix 恒溫混勻儀（英國(guó)Integrated Technologies 公司），QIA Symphony SP 核酸純化儀（德國(guó)Qiagen 公司），Sigma1-14 臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司），Speed cycler 2 擴(kuò)增儀（德國(guó)Analytik Jena 公司），Heraeus Labofuge 400 平板離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），3500xL 基因分析儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），ZWYR-200D 恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司）。QIA Symphony DNA Investigator 試劑盒（德國(guó)Qiagen公司），VeriFilerTMPlus PCR擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.3 提取工具

微量生物物證提取套裝（自行設(shè)計(jì)）：包含可推式棉簽（天津諾維萊博科技有限公司）2 根、生物檢材采集保護(hù)液（天津諾維萊博科技有限公司，貨號(hào)TECS1806）0.3 mL、離心套管（南京多利洋生物技術(shù)有限公司）1 個(gè)，預(yù)封裝在一個(gè)多功能物證袋內(nèi)。

普通法：純水、2 根棉簽和普通紙質(zhì)物證袋。

1.4 方法

1.4.1 提取方法

微量生物物證提取套裝法：250 份現(xiàn)場(chǎng)微量血痕采用微量生物物證提取套裝提取。具體操作流程：（1）打開(kāi)多功能物證袋，取出生物檢材采集保護(hù)液及2 根可推式棉簽，其中1 根蘸取生物檢材保護(hù)液。采用“干濕兩步法”對(duì)現(xiàn)場(chǎng)微量血痕進(jìn)行提取，擦拭過(guò)程中可反復(fù)旋轉(zhuǎn)棉簽頭部，盡可能使血痕轉(zhuǎn)移充分。（2）取出離心套管，打開(kāi)管蓋，將擦拭后的兩根棉簽頭部推入離心套管的上層套管內(nèi)。（3）將離心套管密封，放入多功能物證袋內(nèi)保存，在袋子上做好標(biāo)記。

普通法[7-8]：250 份血痕采用2 根相同的可推式棉簽蘸取純水進(jìn)行“干濕兩步法”提取，提取好的血痕棉簽置于普通紙質(zhì)物證袋內(nèi)，并用自封袋將其完全封閉。

為模擬高濕環(huán)境送檢的過(guò)程，將以上裝有現(xiàn)場(chǎng)微量血痕的500 份物證袋放置在37 ℃的ZWYR-200D恒溫?fù)u床上進(jìn)行振蕩，振蕩回旋頻率為400 r/min。

1.4.2 檢驗(yàn)方法

采用平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別在恒溫?fù)u床上2、24、48、72、96 h 時(shí)，微量生物物證提取套裝法和普通法各取50 份，采用QIA Symphony SP 核酸純化儀依照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA 提取，裂解體系為200 μL，洗脫體系為50 μL。采用VeriFilerTMPlus PCR 擴(kuò)增試劑盒10 μL 擴(kuò)增體系（模板DNA 1 μL）在Speed cycler 2擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增（26 個(gè)循環(huán)），每次檢驗(yàn)均加2800M和ddH2O 分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用3500xL 基因分析儀進(jìn)行檢測(cè)，采用GeneMapper?ID-Xv1.3 軟件（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4.3 判定標(biāo)準(zhǔn)[9]

所有基因座均能正確分型，譜峰清晰均一、判型準(zhǔn)確、峰值＞200 相對(duì)熒光單位（relative fluorescence unit，RFU）、雜合子兩個(gè)峰高比例＞70%、無(wú)或少雜峰等干擾判型的因素。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件（美國(guó)IBM 公司）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，檢驗(yàn)成功率的比較采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

恒溫?fù)u床放置2 h 時(shí)，微量生物物證提取套裝法的檢出率（100.00%）與普通法（98%）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。盡管普通法中只有1 例DNA 檢驗(yàn)失敗，但普通法的峰高普遍較微量生物物證提取套裝法低，個(gè)別基因座峰值均衡性有所下降（圖1）。

圖1 恒溫?fù)u床放置2 h的血痕樣本STR分型圖譜Fig. 1 STR typing map of bloodstain samples on constant temperature shaker for 2 h

放置24、48、72、96 h 后，微量生物物證提取套裝法的檢出率（100.00%、100.00%、100.00%、96.00%）均高于普通法（62.00%、26.00%、10.00%、0），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 微量生物物證提取套裝法與普通法對(duì)現(xiàn)場(chǎng)微量血痕提取后不同時(shí)間DNA檢出率的比較Tab. 1 Comparison of DNA detection rate after trace bloodstain samples from the scene collected at different time by Trace Biological Evidence Collection kit method and common method

3 討 論

現(xiàn)場(chǎng)勘驗(yàn)中提取到足量的有核細(xì)胞是DNA 分型成功的關(guān)鍵。因而，在送檢過(guò)程中有效降低有核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染損失及腐敗菌的破壞，以保證在DNA 提取環(huán)節(jié)獲得足夠濃度的DNA 溶液至關(guān)重要。研究[8]結(jié)果顯示，現(xiàn)場(chǎng)檢材在送檢過(guò)程中DNA 轉(zhuǎn)移率平均為22.06%，其中接觸類生物物證在紙質(zhì)物證袋內(nèi)的平均轉(zhuǎn)移率為52.85%，塑料物證袋內(nèi)的平均轉(zhuǎn)移率為36.87%?，F(xiàn)場(chǎng)提取后棉簽拭子沾染的腐敗菌一直處于繁殖狀態(tài)，其中37 ℃為多數(shù)腐敗菌最理想的培養(yǎng)溫度[10]，其繁殖能力處于最佳狀態(tài)。

本研究使用的“微量生物物證提取套裝”具有多種優(yōu)勢(shì)：（1）提取到的現(xiàn)場(chǎng)生物物證的棉簽頭放置在離心套管內(nèi)全部用于后續(xù)的DNA 檢驗(yàn)，有效避免了運(yùn)輸過(guò)程中的損失。同時(shí)，后續(xù)的DNA 檢驗(yàn)省去了前處理的環(huán)節(jié)，檢驗(yàn)工作更加高效。（2）擦拭中用生物檢材采集保護(hù)液代替純水，有效抑制現(xiàn)場(chǎng)生物物證中腐敗菌的繁殖，有效減緩了DNA 的降解。（3）一個(gè)離心套管可以同時(shí)放置4 根擦拭的棉簽，有利于徹底提取現(xiàn)場(chǎng)局部的生物物證，提高其提取質(zhì)量。基于以上優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用微量生物物證提取套裝提取現(xiàn)場(chǎng)生物物證特別是微量生物物證的DNA，其檢出率和檢出質(zhì)量都將有可能大幅度提升。

為增加本研究結(jié)果對(duì)實(shí)際案件現(xiàn)場(chǎng)勘驗(yàn)的參考價(jià)值，本研究在含有較多腐敗菌的有浮塵的樓道地面以1 μL 靜脈血模擬現(xiàn)場(chǎng)微量血痕，將普通法的血痕棉簽放置在透氣性較差的密封紙質(zhì)物證袋內(nèi)并用自封袋封閉，同時(shí)采用恒溫?fù)u床模擬送檢過(guò)程中生物物證與物證袋之間的摩擦，將溫度設(shè)置在腐敗菌繁殖能力最強(qiáng)的37 ℃，以應(yīng)對(duì)現(xiàn)場(chǎng)生物物證可能出現(xiàn)的極端情況。為增加可比性，模擬的現(xiàn)場(chǎng)微量血痕的提取均采用相同的可推式棉簽，并采取能夠有效提升現(xiàn)場(chǎng)生物物證提取效果的“干濕兩步法”[11-13]進(jìn)行提取。

本研究結(jié)果顯示，在恒溫?fù)u床上放置2 h 時(shí)，雖然微量生物物證提取套裝法與普通法的檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是從STR 分型圖譜的峰高和峰值均衡性來(lái)看，普通法血痕中可用于STR 分型的DNA 片段含量已經(jīng)有降低的趨勢(shì)，可見(jiàn)，在現(xiàn)實(shí)工作中，即便做到現(xiàn)場(chǎng)提取后及時(shí)送到實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，這種方法所獲得的STR 分型結(jié)果的質(zhì)量也很可能會(huì)受到一定影響。

在37℃恒溫?fù)u床上放置24～96 h，微量生物物證提取套裝法的檢出率均高于普通法（P＜0.05）。72 h內(nèi)微量生物物證提取套裝法的檢出率均為100.00%，這些結(jié)果表明，微量生物物證提取套裝能夠較好地保護(hù)現(xiàn)場(chǎng)提取到的生物物證中可用于STR 分型的DNA片段。微量生物物證提取套裝對(duì)DNA 提取的較高效率很有可能是由于使用生物檢材保護(hù)液抑制腐敗菌的繁殖以及使用離心套管防止微量血痕與物證袋摩擦從而降低轉(zhuǎn)染損失等綜合因素導(dǎo)致的。在96 h 時(shí)，微量生物物證提取套裝法的檢出率（96.00%）開(kāi)始降低，表明微量生物物證提取套裝中的生物檢材保護(hù)液有可能不能殺死生物物證中的腐敗菌，可能只能一定程度抑制腐敗菌的繁殖，延緩腐敗菌對(duì)微量血痕中DNA的破壞。可見(jiàn)，使用微量生物物證提取套裝提取生物物證也不能長(zhǎng)期放置，應(yīng)于96 h 內(nèi)及時(shí)送檢，以防止在環(huán)境溫度過(guò)高及生物物證中DNA 含量較低等極端條件時(shí)，生物物證DNA 檢出失敗的情況發(fā)生。

本研究通過(guò)對(duì)比微量生物物證提取套裝法和普通法提取現(xiàn)場(chǎng)微量血痕，在不同放置時(shí)間后的STR 分型結(jié)果，發(fā)現(xiàn)對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)微量血痕，微量生物物證提取套裝法優(yōu)于普通法，可有效提升現(xiàn)場(chǎng)微量血痕的DNA檢出率并延長(zhǎng)現(xiàn)場(chǎng)微量血痕的檢出時(shí)限。微量生物物證提取套裝通過(guò)使用生物檢材保護(hù)液抑制腐敗菌的繁殖，使用離心套裝避免生物檢材的摩擦轉(zhuǎn)染損失，可有效提升現(xiàn)場(chǎng)生物物證的DNA 檢出率，有望成為現(xiàn)場(chǎng)微量生物物證的理想提取工具。