綠藻ChlB基因和藍(lán)藻NIES基因在溺死相關(guān)浮游生物檢測(cè)中的應(yīng)用

李歡，徐曲毅，劉超，肖成，趙建，余仲昊，楊幸怡，李越，萬(wàn)立華

1.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，重慶400016；2.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所 法醫(yī)病理學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510442；3.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510515

水中尸體的溺死診斷是現(xiàn)今法醫(yī)學(xué)鑒定中的熱點(diǎn)問(wèn)題，同時(shí)也是法醫(yī)工作中面臨的挑戰(zhàn)性問(wèn)題。由于人在溺死過(guò)程中，水中浮游生物可通過(guò)呼吸系統(tǒng)進(jìn)入體循環(huán)，進(jìn)而蓄積于肝、腎等器官，因此可通過(guò)檢測(cè)溺死者這些器官中相關(guān)的浮游生物而建立溺死診斷方法。本研究針對(duì)綠藻ChlB基因和藍(lán)藻NIES基因設(shè)計(jì)特異性引物，構(gòu)建一種特異性較強(qiáng)、靈敏度較高的聚合酶鏈反應(yīng)-毛細(xì)管電泳（polymerase chain reaction-capillary electrophoresis，PCR-CE）方法，同時(shí)比較微波消解-真空抽濾-自動(dòng)掃描電子顯微鏡（microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscope，MD-VF-Auto SEM）方法，旨在擴(kuò)大溺死相關(guān)浮游生物檢測(cè)范圍，提高溺死相關(guān)浮游生物的證據(jù)力。

1 材料與方法

1.1 常用儀器與試劑

2K15 高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma 公司），Applied BiosystemsTMVeritiTM96 孔熱循環(huán)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），3130xl基因分析儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司），Qubit 2.0 熒光定量?jī)x（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），Thermomixer comfort?恒溫混勻儀（美國(guó)Eppendorf 公司），Millipore純水機(jī)（Mili-q，美國(guó)Millipore 公司），GeneMapperIDXv1.4（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），MW3000微波消解儀（奧地利Anton Paar 公司），Quanta 600 型掃描電鏡（美國(guó)FEI 公司）。

PowerSoilTMDNA Isolation 試劑盒（美國(guó)MO BIO公司），蛋白酶K（20 mg/mL，美國(guó)Qiagen 公司），二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT；美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），Qubit dsDNA HS Assay 試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），甲酰胺和CC5 ILS500 內(nèi)標(biāo)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），反應(yīng)混合液（無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司），濃硝酸、30%過(guò)氧化氫（廣州化學(xué)試劑廠）。

1.2 樣本準(zhǔn)備

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣本及來(lái)源

人類女性基因組DNA 9947A 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司。

21 種不同的淡水藻株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，包含8種淡水硅藻［針桿藻（Synedra radians）、舟形藻（Naviculasp.）、直鏈藻（Melosiravarians）、小環(huán)藻（Cyclotellasp.）、菱形藻（Nitzschiasp.）、異極藻（Fragilariasp.）、脆桿藻（Fragilariasp.）、橋彎藻（Cymbella gracilis）］，4 種淡水綠藻［蛋白核小球藻（Chlo-rella pyrenoidosa）、普通小球藻（Chlorella vulgaris）、斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、廉纖藻（Ankistudesmussp.）］，6 種淡水藍(lán)藻［念珠藻（Nostocsp.）、魚腥藻（Anabaenasp.）、單歧藻（Tolypothrixsp.）、柔細(xì)束絲藻（Aphanizomenon gracile）、產(chǎn)毒銅綠微囊藻（toxic Microcystis）、不產(chǎn)毒銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）］，3 種其他淡水藻［纖細(xì)裸藻（Euglena gracilis）、遁形甲藻（Peridiniopsissp.）、衣藻（Chlamydomonas）］。

16 種海水藻株購(gòu)自廈門浠柏生物技術(shù)有限公司，包括6 種海水硅藻［中肋骨條藻（Skeletonema costatum）、威氏海鏈藻（Thalassiosira weissflogii）、旋鏈毛角藻（Chaetoisceros curvisetus）、多列擬菱形藻（Pseudo-nitzschiamultiseries）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）、隱秘小環(huán)藻（Cyclotella cryptita）］，5 種海水綠藻［亞心扁藻（Platymonas subcordiformis）、杜氏鹽藻（Dunaliella salina）、小球藻（Chlorellasp.）、四爿藻（Tetraselmissp.）、卵囊藻（Oocystis）］，1 種海水藍(lán)藻［聚球藻（Synechococcus）］，4 種海水甲藻［伊姆裸甲藻（Gymnodinium impudicum）、鏈狀亞歷山大藻（Alexandrium catenella）、海洋原甲藻（Prorocentrum micans）、血紅哈卡藻（Akashiwo sanguinea）］。

12 種標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自廣東省微生物研究所，包括嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）、舒氏氣 單 胞 菌（Photobacteriu mleiognathi）、哈 氏 弧 菌（Vibrio harveyi）、副溶血性弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）、鲇愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）、赫氏埃希菌（Escherichia hermannii）、長(zhǎng)雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）、大腸桿菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candidaalbicans）等。

1.2.2 尸體樣本

篩選25 例尸體樣本（表1，其中溺死20 例、非溺死5例，25例均系統(tǒng)尸體解剖明確死亡原因，且有目擊者或被視頻拍攝到），各取肺組織（右肺尖葉中部）0.5 g，為避免污染，要求其包膜完整，避光-20 ℃保存?zhèn)溆?。案件尸體樣本由廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所提供。

1.3 DNA提取及定量

分別取1 mL 標(biāo)準(zhǔn)藻株或菌株到離心管，用2K15高速冷凍離心機(jī)以離心半徑10 cm，10 000 r/min，離心0.5 h，棄上清液0.5 mL。實(shí)際案例尸體肺組織樣本取0.5 g，剪碎，置于離心管中。加入10 μL 蛋白酶K（20 mg/mL）、10 μL DTT 和500 μL 裂解液。Thermomixer comfort?恒溫混勻儀56 ℃，1 500 r/min，振蕩3 h。用PowerSoilTMDNA Isolation 試劑盒提取DNA。

表1 實(shí)際案件尸體樣本信息Tab. 1 Actual case cadaver sample information

按照Qubit dsDNA HS Assay 試劑盒說(shuō)明書制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將1 μL 樣品DNA 和199 μL 工作液混合均勻后，用2K15 高速冷凍離心機(jī)以離心半徑10 cm，10 000 r/min，離心5 min，室溫避光孵育3 min，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定DNA 濃度。

1.4 引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增

依據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中綠藻ChlB基因（登錄號(hào)GU205324.1）和藍(lán)藻NIES基因（登錄號(hào)LC455590.1）保守序列，采用Applied BiosystemsTMPrimer ExpressTMv3.0.1 軟件（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），設(shè)計(jì)引物ChlB和引物NIES（表2），使用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）驗(yàn)證引物特異性。以綠色熒光FAM 標(biāo)記引物5′端，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

通過(guò)Applied BiosystemsTMVeritiTM96 孔熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR，PCR擴(kuò)增總體積10 μL：反應(yīng)混合液4 μL，熱啟動(dòng)C-Taq酶0.4 μL，上下游引物各1.5 μL（濃度均為10 μmol/L），超純水（由Millipore 純水機(jī)制得）0.6 μL，DNA 模板2 μL。PCR 過(guò)程：94 ℃10 min；94 ℃40 s，58 ℃30 s，72 ℃40 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。所有實(shí)驗(yàn)均包括陰性對(duì)照組（滅菌雙蒸水）。在3130xl基因分析儀上，用1 μL PCR 產(chǎn)物、0.4 μL CC5 ILS500內(nèi)標(biāo)和9.5 μL 甲酰胺進(jìn)行CE 檢測(cè)。采用GeneMapperID-Xv1.4 進(jìn)行片段分析，100 個(gè)相對(duì)熒光單位（relative fluorescence units，RFU）作為峰值檢測(cè)閾值。

表2 PCR-CE體系的引物序列Tab. 2 Primer sequences for PCR-CE system

1.5 引物特異性及靈敏度

提取人類女性基因組9947A、21 種淡水藻、16 種海水藻、12 種標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA，以引物ChlB 和引物NIES 分別擴(kuò)增，驗(yàn)證引物特異性（若以引物ChlB 僅能擴(kuò)增蛋白核小球藻，引物NIES 僅能擴(kuò)增產(chǎn)毒銅綠微囊藻和不產(chǎn)毒銅綠微囊藻，則證明其具有特異性）。Qubit 2.0 熒光定量?jī)x測(cè)定結(jié)果為陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)株DNA，將其按10 倍體積比稀釋，建立1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、1 ng 8個(gè)濃度梯度，PCRCE 檢測(cè)，確定可檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)株的最低DNA 濃度。

1.6 毛細(xì)管電泳檢測(cè)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用3130xl基因分析儀檢測(cè)分析。其中，CC5 ILS500 內(nèi)標(biāo)、擴(kuò)增產(chǎn)物和甲酰胺按照體積比0.4∶1∶9.5比例混合均勻，使用3130xl基因分析儀檢測(cè)。

1.7 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序

從CE 檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的引物ChlB 擴(kuò)增產(chǎn)物和引物NIES擴(kuò)增產(chǎn)物中，各隨機(jī)挑選1例，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，使用BLAST比對(duì)測(cè)序結(jié)果。

1.8 MD-VF-Auto SEM法檢驗(yàn)案件尸體樣本

根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]報(bào)道的方法對(duì)各案例肺組織樣本進(jìn)行硅藻檢驗(yàn)，步驟如下：

取肺組織2 g，置消解罐內(nèi)，加入8 mL 濃硝酸和2 mL 30%過(guò)氧化氫后使用MW3000 微波消解儀進(jìn)行微波消解。將消解液倒入濾杯內(nèi)進(jìn)行抽濾后，取出濾膜（使用孔徑0.45 μm 的微孔濾膜），真空噴鍍金膜后用Quanta 600 型掃描電鏡進(jìn)行分析。將濾膜分為468 個(gè)矩形視場(chǎng)，加速電壓20 kV，對(duì)各樣本進(jìn)行檢測(cè)，調(diào)好焦距后，系統(tǒng)自動(dòng)掃描、逐個(gè)拍攝并存儲(chǔ)每個(gè)視場(chǎng)照片，并通過(guò)回訪感興趣視場(chǎng)，在400～8 000 倍下拍攝硅藻高分辨掃描電鏡照片（1 024 像素×800 像素），根據(jù)照片結(jié)果觀察硅藻確定其種屬，記錄樣本的硅藻總數(shù)和種類，進(jìn)行硅藻定性定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過(guò)SPSS 23.0 軟件（美國(guó)IBM 公司）采用χ2檢驗(yàn)對(duì)引物ChlB 和引物NIES 2 種方法檢測(cè)溺死尸體檢出率進(jìn)行比較（陽(yáng)性即為檢出，陰性即為未檢出）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 特異性和靈敏度

引物ChlB 僅能擴(kuò)增蛋白核小球藻，產(chǎn)物片段均為156 bp（圖1A），其靈敏度為0.161 ng；引物NIES 僅能擴(kuò)增產(chǎn)毒銅綠微囊藻和不產(chǎn)毒銅綠微囊藻，產(chǎn)物片段均為182 bp（圖1B～C），其靈敏度分別為0.109、0.197 ng。

圖1 CE檢測(cè)譜圖Fig. 1 CE detection spectrum

2.2 尸體樣本檢測(cè)結(jié)果

分別用PCR-CE 法和MD-VF-Auto SEM 法檢驗(yàn)25 例尸體肺組織樣本，結(jié)果顯示，引物ChlB 和引物NIES 檢出率均為95%（表3）。其中序號(hào)21～25 樣本來(lái)源于非溺死案例，使用引物ChlB 和引物NIES 檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

表3 PCR-CE法及MD-VF-Auto SEM法檢驗(yàn)尸體樣本結(jié)果Tab. 3 Results of examination of cadaver samples by PCR-CE and MD-VF-Auto SEM method

2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

分別從引物ChlB 和引物NIES 的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物中隨機(jī)抽取1 例，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

引物ChlB 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果（5′→3′）見圖2：GAATTAAAAAGACTTTTAACAGATCTAGGAATTAC AATTAATGAAATCCTTCCAGAAGGTGGGTCGGTTA CAAATATTAAAAAATTACCAAACGCTTGGTTTAATT TAATTCCTTATCGCGAAGTAGGCTTAATGACAGCAA AGTATTTGCAAGAA。

引物NIES 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果（5′→3′）見圖3：TAGTCTGCCAGTTTCCACCGCCTTTAGGTCGTTAAG CAACCTGATTTGACGGCAGACTTGGCTGACCACCTG CGGACGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTT GCCTCCCCCGTATTACCGCGGATCCTCTAGAGTCGA CCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTT TA。

圖2 引物ChlB擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序圖譜Fig. 2 Sequencing spectrum of amplified product by primer of ChlB

圖3 引物NIES擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序圖譜Fig. 3 Sequencing spctrum of amplified product by primer of NIES

經(jīng)BLAST 比對(duì)，引物ChlB 和引物NIES 擴(kuò)增產(chǎn)物分別與綠藻ChlB基因（登錄號(hào)GU205324.1）和藍(lán)藻NIES基因（登錄號(hào)LC455590.1）同源，序列匹配度達(dá)99.00%，說(shuō)明上述兩對(duì)引物可分別特異性擴(kuò)增綠藻ChlB基因和藍(lán)藻NIES基因，提示特異性引物ChlB 和引物NIES 可用于溺死相關(guān)浮游生物的檢測(cè)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

引物ChlB 和引物NIES 2 種檢驗(yàn)方法檢測(cè)溺死尸體檢出率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MDVF-Auto SEM 法與本研究所建立的檢驗(yàn)方法檢測(cè)溺死尸體檢出率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

在多種溺死相關(guān)浮游生物檢測(cè)方法[2]中，傳統(tǒng)的硅藻檢驗(yàn)方法（如強(qiáng)酸消化法、酶消化法、碎漿法[3]等）硅藻損失率高，檢出率較低，所需時(shí)間長(zhǎng)，且濃酸消解過(guò)程釋放二氧化氮（NO2）等有害氣體，形成污染；硅藻形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)在取材過(guò)程中，易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[4]。目前硅藻檢驗(yàn)廣泛使用的方法是MD-VF-Auto SEM，ZHAO 等[5]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其靈敏度高、特異性好，污染小，且能夠?qū)柙宥ㄐ远?。然而，長(zhǎng)期生活在硅藻豐富環(huán)境下的人員（如食用貝類、蔬菜、吸煙等）攝入的硅藻數(shù)量在進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)后，硅藻的DNA 隨時(shí)間降解，硅藻殼仍留在體內(nèi)，該部分人員的溺死診斷，可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果[6-7]。

近年來(lái)，將溺死相關(guān)浮游生物的DNA 遺傳標(biāo)記（如UPA基因[6]、18S rDNA[7]、rbcL 基因[8]、16S rDNA[9]、COⅠ基因[10]、SSU基因[11]、rDNA[12]等）作為檢測(cè)對(duì)象，建立分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)方法，具有靈敏度和特異性高、檢測(cè)范圍廣的特點(diǎn)，且能在一定程度上排除形態(tài)學(xué)上的假陽(yáng)性，是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。由于MD-VF-Auto SEM 法需要對(duì)檢材進(jìn)行強(qiáng)酸消化、微波消解，此過(guò)程會(huì)破壞藍(lán)藻、綠藻等與溺死相關(guān)的藻類[13]，將此法與MD-VF-Auto SEM 法聯(lián)用，作為其輔助手段，可擴(kuò)大溺死相關(guān)浮游生物檢測(cè)范圍，提高檢測(cè)溺死相關(guān)浮游生物的證據(jù)力。

溺死尸體器官中除硅藻外，還存在藍(lán)藻[14-15]、綠藻[16]等其他藻類，這種藻類在正常人體內(nèi)不存在，卻存在于溺死尸體器官中。TIE等[14]根據(jù)藍(lán)藻16S rDNA設(shè)計(jì)引物，通過(guò)3 種基因組和轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)，估計(jì)基因組結(jié)合位點(diǎn)、擴(kuò)增大小和特異性，利用電子PCR 評(píng)估所設(shè)計(jì)引物的靈敏度和特異性等，直接用消化緩沖液處理溺死尸體組織后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，證明了所設(shè)計(jì)的特異性引物能夠擴(kuò)增出藍(lán)藻基因，可以對(duì)水中尸體進(jìn)行快速溺死診斷。KAKIZAKI 等[15]針對(duì)藍(lán)藻V7～V8 高度可變區(qū)域（variable regions）設(shè)計(jì)引物并通過(guò)454 焦磷酸測(cè)序分析其擴(kuò)增產(chǎn)物。RáCZ 等[16]提取溺死尸體的脾組織DNA 并利用藍(lán)藻、綠藻特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢測(cè)藍(lán)藻、綠藻。這兩種方法以序列分類單元聚類分析，使用了生物信息學(xué)的方法對(duì)特異性進(jìn)行驗(yàn)證，認(rèn)為產(chǎn)物中含有藍(lán)藻成分，但是缺乏真實(shí)的標(biāo)準(zhǔn)株的特異性驗(yàn)證。本研究所設(shè)計(jì)的引物，通過(guò)選取綠藻和藍(lán)藻的保守序列，利用GenBank 比對(duì)各物種的特征序列，設(shè)計(jì)的引物保守性更高，通過(guò)自然水體中常見藻類的標(biāo)準(zhǔn)株測(cè)試，特異性更?！医?jīng)過(guò)檢測(cè)大量實(shí)際案件溺死尸體的肺組織，檢出率高，更適用于溺死尸體診斷。

本研究針對(duì)綠藻ChlB基因和藍(lán)藻NIES基因作為靶向基因，通過(guò)比對(duì)多對(duì)相關(guān)序列，選取其保守區(qū)域，針對(duì)其設(shè)計(jì)特異性引物ChlB 和引物NIES，構(gòu)建一種PCR-CE 檢測(cè)溺死相關(guān)浮游生物的方法。兩對(duì)引物最低檢測(cè)DNA 含量分別為0.161、0.109 ng，靈敏度高。使用BLAST 比對(duì)分析顯示，兩對(duì)引物分別與蛋白核小球藻ChlB基因和銅綠微囊藻NIES基因有最高匹配度。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：引物ChlB 和引物NIES 分別擴(kuò)增常見與溺死相關(guān)的藻類（21 種淡水藻、16 種海水藻、12 種細(xì)菌及擴(kuò)增人類基因組DNA 9947A）中，除蛋白核小球藻和銅綠微囊藻（產(chǎn)毒及不產(chǎn)毒）外，結(jié)果均為陰性，可見2 種引物僅對(duì)相關(guān)綠藻、藍(lán)藻呈現(xiàn)高度的特異性。若以該引物擴(kuò)增待檢DNA，PCR-CE 檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果，即可證明溺死相關(guān)藍(lán)藻及綠藻的存在。基于PCR-CE 法檢測(cè)20 例溺死案件尸體肺組織，引物ChlB、引物NIES 檢出率均為95%，具有較高的檢出率，且經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩種檢驗(yàn)方法結(jié)果之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用MD-VFAuto SEM 法檢測(cè)時(shí)，檢出率為100%，與本研究所建立的引物ChlB 和引物NIES 2 種檢驗(yàn)方法檢測(cè)溺死尸體的檢出率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

有報(bào)道[7]發(fā)現(xiàn)，已明確為溺死尸體的組織和水的硅藻試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)硅藻，但用PCR 特異性擴(kuò)增藍(lán)藻時(shí)，結(jié)果呈陽(yáng)性。本研究中溺死案例尸體樣本序號(hào)1 中肺組織檢出硅藻數(shù)量較少，但用2 種藍(lán)藻、綠藻的引物檢測(cè)為陽(yáng)性，因此這兩種藻類可以作為硅藻檢驗(yàn)的輔助證據(jù)。與MD-VF-Auto SEM 法相比，各有1 例溺死尸體結(jié)果為陰性，陰性結(jié)果可能與溺死尸體取樣時(shí)間有關(guān)，由于取樣時(shí)間間隔較長(zhǎng)，組織內(nèi)DNA 有所降解，但硅藻殼仍殘留在體內(nèi)，可查見其形態(tài)，但DNA結(jié)果則為陰性[7]。當(dāng)取樣時(shí)間間隔短時(shí)，器官中的硅藻不一定來(lái)自水中，可能為日常吸入，利用DNA 這類活性指標(biāo)檢測(cè)藍(lán)藻、綠藻，具有排除硅藻檢驗(yàn)假陽(yáng)性的潛力。當(dāng)水中硅藻密度較低時(shí)，僅進(jìn)行硅藻檢驗(yàn)不一定能得出最佳結(jié)果，借助其他溺死相關(guān)浮游生物，如藍(lán)藻及細(xì)菌等可提升溺死診斷的證據(jù)力。

本研究使用引物ChlB 和引物NIES 建立的PCRCE 法檢測(cè)溺死相關(guān)綠藻、藍(lán)藻，作為一種新的分子工具，為溺死相關(guān)浮游生物的檢測(cè)提供了良好的分子靶點(diǎn)，結(jié)合硅藻檢驗(yàn)，可擴(kuò)大檢測(cè)范圍，為溺死診斷提供更多證據(jù)。