死后血漿和溶血樣本中IgE的穩(wěn)定性

王天琦，王天方，賈宇晴，曹志鵬，朱寶利

1.中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院，遼寧 沈陽110122；2.天津市公安局河西分局物證鑒定所，天津300061

過敏性休克死亡是法醫(yī)學鑒定的重要內(nèi)容之一，由于缺乏特異性的病理形態(tài)學改變，導致此類案件的法醫(yī)學鑒定具有一定難度[1]。過敏性休克主要由Ⅰ型超敏反應(yīng)介導，免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）是介導Ⅰ型超敏反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)[2]。在既往研究報道[3]中已證實，死后血清IgE 的檢測對過敏性休克的死因診斷具有輔助作用并已在實際工作中得到一定的應(yīng)用。

在實際工作中，由于樣本的送檢、移交或檢測不及時等因素造成樣本需暫時保存，一般為冷凍保存，有時還需長期保存以備檢。臨床研究[4-5]結(jié)果表明，IgE 在正確采集下可以保存數(shù)周，在有抗凝劑的作用下可以室溫保存11 周且維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不被降解，在-20 ℃條件下可穩(wěn)定保存6 個月。動物實驗[6]結(jié)果顯示，大鼠死后血清IgE 在冷凍、室溫及4 ℃條件下可穩(wěn)定保存25 d。但在法醫(yī)學實踐中，尸體冷凍保存及死后變化常導致嚴重溶血，因此，探究IgE 在死后樣本中的穩(wěn)定性用于指導實際工作是很有必要的。

本研究擬收集死亡案例的血漿及溶血樣本，對IgE 經(jīng)-20 ℃、4 ℃、25 ℃3 種條件下保存、5 次反復凍融后及-80℃長期超低溫冷凍保存后的穩(wěn)定性進行初步探究。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及選取標準

本研究共選取39 例中國醫(yī)科大學司法鑒定中心在2017—2018 年受理的非冷凍且死后48 h 內(nèi)進行尸體解剖案例的心血樣本，其中20 例在獲取血液后立即以3 000×g離心20 min 獲得血漿，血漿性狀為無肉眼可見溶血，另外19 例血液在獲取后用超聲破碎法（500 W，20 kHz，5 min）致其溶血，制備成溶血樣本。

由于大多數(shù)尸體在解剖前經(jīng)過冷凍保存，較難收集到非冷凍且死后經(jīng)過時間＜48 h 的過敏性休克死亡案例，故本研究收集的39 例為一般常見案例，死因為交通事故18 例、心臟性猝死17 例、縊死2 例、高墜2 例，其中男性28 例，女性11 例，年齡為21～67 歲。

本研究通過了中國醫(yī)科大學倫理委員會的批準。

1.2 IgE在不同保存條件下的穩(wěn)定性

取5 例血漿樣本及5 例溶血樣本，分為3 組，分別保存在-20 ℃、4 ℃、25 ℃，每組分裝成6 份，每份200 μL，分別在第0、3、7、14、21、28 天檢測樣本IgE。

1.3 血漿和溶血樣本長時間冷凍處理過程

取20 例血漿樣本和19 例溶血樣本，每例分為2份，每份200 μL。第1份于獲取后立即檢測，獲得IgE初始濃度，第2 份經(jīng)-80 ℃冷凍保存1 年（365 d）后檢測IgE。

1.4 血漿和溶血樣本反復凍融處理過程

取10 例血漿樣本及10 例溶血樣本，每例分為4 份，每份200 μL。第1 份于獲取后立即檢測，獲得IgE 初始濃度；第2 份經(jīng)-20 ℃冷凍40 min 后樣本完全凍結(jié)，立即取出室溫解凍，連續(xù)反復5 次后檢測IgE；第3 份經(jīng)-80 ℃冷凍30 min 后樣本完全凍結(jié)，立即取出室溫解凍，連續(xù)反復5 次后檢測IgE；第4 份經(jīng)-80 ℃冷凍再室溫解凍，每次冷凍時間＞24 h，反復5 次后檢測IgE。

1.5 IgE的檢測方法

血漿和溶血樣本的IgE 應(yīng)用cobas e411 型電化學發(fā)光全自動免疫分析儀及配套人免疫球蛋白E 檢測試劑盒（瑞士Roche 公司）進行檢測。血漿樣本使用儀器直接檢測；溶血樣本應(yīng)用配套樣本稀釋液Diluent Universal（瑞士Roche公司），使用儀器自動稀釋100倍后再進行檢測IgE 濃度，以去除溶血對檢測造成的干擾。

1.6 降解率的計算

在-20 ℃、4 ℃、25 ℃保存穩(wěn)定性研究中，以初始濃度（0 d 時）為基礎(chǔ)濃度，用經(jīng)不同條件下保存處理后的濃度與之對比，計算降解率（degradation rate，DR），計算公式如下：

式中，C0為樣本中IgE 的初始濃度（IU/mL）；Cx為保存3、7、14、21、28 d 后IgE 的濃度（IU/mL）。

1.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 血漿及溶血樣本中IgE在不同保存條件下的穩(wěn)定性

血漿及溶血樣本中IgE 隨著保存時間的延長，濃度總體呈下降趨勢，降解率呈升高趨勢。3 種保存條件下28 d 后血漿中IgE 的降解情況大致相同，均值在15%左右。溶血樣本保存28 d 后，相同條件下較血漿樣本降解速度加快（P＜0.05），并且在25 ℃保存條件下降解速度快于-20 ℃和4 ℃保存條件（P＜0.05）。血漿及溶血樣本中IgE 在不同保存條件下的穩(wěn)定性檢測結(jié)果見表1～2。

表1 血漿樣本中IgE在不同保存條件下的穩(wěn)定性Tab. 1 Stability of IgE in plasma samples under different storage conditions （n=5）

表2 溶血樣本中IgE在不同保存條件下的穩(wěn)定性Tab. 2 Stability of IgE in hemolyzed blood samples under different storage conditions （n=5）

2.2 血漿和溶血樣本長時間冷凍后IgE濃度的比較

分別將血漿與溶血樣本在-80 ℃冷凍保存1 年后的IgE 濃度與初始濃度進行比較，發(fā)現(xiàn)血漿樣本在-80 ℃冷凍保存1 年后，其濃度與初始濃度相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而溶血樣本在-80 ℃冷凍保存1 年后，其濃度與初始濃度相比有所降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。血漿與溶血樣本中IgE 濃度在-80 ℃冷凍保存1 年后的檢測結(jié)果見表3。

2.3 血漿及溶血樣本反復凍融后IgE濃度的比較

分別將血漿與溶血樣本于-20 ℃保存40 min 凍融5 次、-80 ℃保 存30 min 凍 融5 次 及-80 ℃保 存24 h 以上凍融5 次后的檢測結(jié)果與初始濃度進行比較，發(fā)現(xiàn)血漿和溶血樣本經(jīng)上述冷凍處理后，IgE 濃度與初始濃度相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。血漿及溶血樣本中IgE 濃度在反復凍融后的檢測結(jié)果見表4。

表3 血漿及溶血樣本中IgE在-80 ℃冷凍保存1年后的檢測結(jié)果Tab. 3 Detection result of IgE in plasma and hemolyzed blood samples frozen at -80 ℃for 1 year（IU/mL）

表4 血漿及溶血樣本中IgE在反復5次凍融后的檢測結(jié)果Tab. 4 Detection result of IgE in plasma and hemolyzed blood samples after repeated freezing-thawing 5 cycles（n=10，IU/mL）

3 討 論

死后IgE 的檢測對過敏性休克死亡案例的鑒定具有一定的輔助作用，但對不同保存條件下的樣本穩(wěn)定性研究也僅見于針對臨床樣本的相關(guān)研究[5]。在死后生物化學檢測中，對于溶血樣本的保存和檢測也是重要的工作內(nèi)容之一。因此，本研究參照文獻[7]中針對死后樣本氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal probrain natriuretic peptide，NT-proBNP）的穩(wěn)定性研究，對死后血漿及溶血樣本在不同保存條件下IgE 的穩(wěn)定性進行了研究。由于樣本量的限制，本研究僅納入5 例血漿和5 例溶血樣本，該樣本量雖不足以精確反映各時間點的降解情況，但是可以反映常見3 種保存條件下降解的總體趨勢，以期對實際工作的樣本保存起到一定的指導作用。本研究結(jié)果表明，死后血漿樣本中IgE 可保持相對穩(wěn)定，在3 種保存條件下穩(wěn)定性接近，28 d 時降解率均值在15%左右；而溶血樣本中IgE 較血漿樣本穩(wěn)定性差，降解率高于血漿樣本（P＜0.05），并且在25 ℃保存條件下最不穩(wěn)定，降解率高于4 ℃及-20 ℃保存條件（P＜0.05）。因此，對于溶血樣本，建議及時檢測，若需保存應(yīng)及時分離出血漿。

在實際工作中，當樣本需要長期保存時，一般會首選冷凍保存以減少樣本的降解，且一般認為溫度越低降解越緩慢。本研究選擇-80 ℃的保存條件進行長時間冷凍保存。結(jié)果表明：死后血漿樣本在-80 ℃經(jīng)過1 年冷凍保存后IgE 濃度保持穩(wěn)定，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而溶血樣本在-80 ℃經(jīng)過1 年冷凍保存后則發(fā)生一定程度的降解，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。推測其原因，可能是在溶血后血細胞內(nèi)大量蛋白酶釋放[8]，雖然-80 ℃的低溫可在很大程度上降低其活性，但長時間保存還是會造成IgE 的緩慢降解。

對IgE 的凍融穩(wěn)定性研究中，有學者[9]將狗血清反復凍融25 次并進行檢測，發(fā)現(xiàn)狗血清中IgE 濃度保持穩(wěn)定；另有研究[10]將羊血清反復凍融15 次，也得到了相同的結(jié)論。上述研究初步證實了血清中IgE 的凍融穩(wěn)定性，本研究參照動物實驗文獻及臨床文獻中NT-proBNP 凍融穩(wěn)定性的處理方法[10-12]，對血漿和溶血樣本進行3 種凍融處理以探究IgE 的凍融穩(wěn)定性。結(jié)果表明，無論是血漿樣本還是溶血樣本，經(jīng)-20 ℃保存40min凍融5次、-80℃保存30min凍融5次及-80℃保存24 h 以上凍融5 次這3 種凍融處理后，IgE 濃度保持穩(wěn)定，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），證明在死后樣本中，IgE 依舊具有良好的凍融穩(wěn)定性。由于條件所限，本研究未收集到符合條件的過敏性休克死亡案例，僅能依據(jù)一般死亡案例探討血液中IgE 的穩(wěn)定性，有待在今后的研究中擴大樣本量進一步驗證。

綜上，死后血液樣本中IgE 具有良好的凍融穩(wěn)定性，可耐受5 次凍融循環(huán)。IgE 在死后血漿中可保持相對穩(wěn)定，并可在-80 ℃條件下長時間穩(wěn)定保存，但溶血樣本中IgE 穩(wěn)定性較差，建議及時檢測或分離血漿進行保存。