大鼠顱骨材料力學和骨質(zhì)參數(shù)的增齡性變化

李曼，李明杰，2，黃江，樂翠云，王堯，趙令強，王承飛，萬昌武，汪家文

1.貴州醫(yī)科大學法醫(yī)學院，貴州 貴陽550004；2.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧530021

顱骨是由23 塊形狀、大小均不同的扁骨和不規(guī)則骨組成的特殊球形體，位于脊柱上方，起著支撐和保護腦組織的作用[1]。位于顱骨上表面的額、顳、頂、枕骨主要由外板、板障和內(nèi)板3 層結(jié)構(gòu)組成，類似“三明治”結(jié)構(gòu)，顱骨的生物力學性狀即由其3 層結(jié)構(gòu)以及骨密度、骨厚度等多種因素共同決定。研究[2-4]結(jié)果表明，顱骨的生物力學性狀和微觀結(jié)構(gòu)具有與年齡相關(guān)的重要特征，不同年齡顱骨影像學參數(shù)和材料參數(shù)存在差異[5-6]，但現(xiàn)有研究覆蓋的年齡范圍較窄[7-8]，且不同年齡之間顱骨骨折閾值差異方面的文獻也較少[7，9-12]。本研究以SD 大鼠為研究對象，探討其顱骨材料力學及骨質(zhì)參數(shù)的增齡性變化規(guī)律，為顱骨骨折的生物力學響應、頭顱有限元模型建模及年齡推斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性SD 大鼠48 只，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供［合格證號SCXK（黔）2018-0001］，按出生年齡分為2、4、6、8、17、26、52 和104 周齡組，每組6 只。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會批準（審批號1901050），實驗嚴格按照動物倫理要求進行。

1.2 方法

1.2.1 樣本預處理

各組大鼠按0.5～1.0 mL/100 g 劑量腹腔注射10%水合氯醛溶液，過量麻醉致死[13]后分離頭部，使用牙托粉制成模具固定頭顱，去除顱頂部軟組織暴露顱蓋骨，使用生理鹽水浸濕的紗布覆蓋于顱骨表面保濕。

1.2.2 顱骨材料力學參數(shù)檢測

所有樣本于2 h 內(nèi)行顱骨壓縮試驗，檢測材料壓縮參數(shù)。將固定好大鼠頭顱的牙托粉模具置于KD Ⅱ-0.2 型微機控制電子萬能試驗機（深圳市凱強利試驗儀器有限公司）承重底座上，使用直徑3.0 mm 圓柱形壓具，調(diào)節(jié)壓具接觸面高度至剛好接觸大鼠右側(cè)顱頂骨中部。預調(diào)3 次達到穩(wěn)定狀態(tài)后在室溫下進行壓縮試驗（圖1）。加載參數(shù)設置：試驗速度為5 mm/min，預加載力為0.5 N，停機條件為位移5.0 mm（預實驗證實未接觸顱底，但顱頂骨已發(fā)生骨折），材料試驗機自帶軟件KPTest V4.3ch（深圳市凱強利試驗儀器有限公司）自動輸出極限載荷、壓縮強度、壓縮模量。

1.2.3 顱骨骨質(zhì)參數(shù)檢測

壓縮試驗完成后，咬骨鉗分離頂部顱骨片，采用ZKKS-CT 小動物Micro-CT 系統(tǒng)（廣州中科愷盛醫(yī)療科技有限公司）掃描顱骨樣本。掃描參數(shù)設置：射線管電流159 μA，電壓70 kV，掃描物長度30 mm，掃描分辨率30 μm，曝光時間600 ms，掃描角度180 度。正式掃描前使用體膜進行標定，得到原始圖像。將原始圖像導入三維醫(yī)學圖像處理及分析系統(tǒng)（3D medical image processing and analyzing system，3DMed；中國科學院自動化研究所醫(yī)學圖像處理研究室開發(fā)），將圖像調(diào)整至矢狀位，對顱骨頂部中段全層進行3 次厚度測量，取平均值為各顱骨的厚度值，并通過肉眼觀察各組圖像，對比分析其顱縫閉合情況及骨折類型。取顱骨中段3 mm 厚度（切片間距0.03 mm，100 片）為感興趣區(qū)域（region of interesting，ROI），設定灰度閾值后，Micro-CT 系統(tǒng)控制插件（中國科學院自動化研究所）直接測量并計算出骨密度、骨體積、骨小梁厚度、顱骨厚度等骨質(zhì)參數(shù)。

圖1 大鼠顱骨單向縱軸壓縮試驗示意圖Fig. 1 Schematic diagram of unidirectional longitudinal compression test of rat skulls

1.2.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 軟件（美國IBM 公司）進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)均以表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法。采用Pearson 相關(guān)性分析對極限載荷、壓縮強度和壓縮模量與年齡之間的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)r）進行分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠顱骨材料力學參數(shù)增齡性變化

各組大鼠顱骨極限載荷、壓縮強度和壓縮模量組間差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）。進一步兩兩比較顯示：17 周組極限載荷及壓縮強度與6 周組、8 周組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；26 周組極限載荷、壓縮強度與8 周組、17 周組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義，壓縮模量僅與17 周組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；52 周組極限載荷、壓縮強度與17 周組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。統(tǒng)計分析表明，極限載荷、壓縮強度和壓縮模量在26 周前均呈增大趨勢，與年齡呈明顯正相關(guān)（r值分別為0.937、0.937、0.818，P＜0.05）。極限載荷、壓縮強度、壓縮模量均在52 周組時降低，但在104 周時又上升［與26 周組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）］。

表1 各年齡組大鼠顱骨材料力學參數(shù)增齡性變化Tab. 1 The age-related changes of material mechanics parameters of rat skulls at different age groups（n=6，）

表1 各年齡組大鼠顱骨材料力學參數(shù)增齡性變化Tab. 1 The age-related changes of material mechanics parameters of rat skulls at different age groups（n=6，）

注：1）與6周組比較，P＜0.05；2）與8周組比較，P＜0.05；3）與17周組比較，P＜0.05。

壓縮模量/MPa 9.68±1.64 16.91±3.93 55.14±19.10 80.61±31.39 127.93±26.70 210.13±113.482）168.97±102.27 245.23±109.42組別/周2468 17 26 52 104極限載荷/N 5.62±1.33 11.05±2.41 22.91±6.85 28.30±9.19 44.91±11.921）2）68.41±7.712）3）61.01±22.573）65.08±25.35壓縮強度/MPa 0.80±0.19 1.56±0.34 3.24±0.97 4.00±1.30 6.35±1.691）2）9.68±1.092）3）8.63±3.193）9.21±3.59

2.2 大鼠顱骨骨質(zhì)參數(shù)增齡性變化

各組大鼠顱骨骨密度、骨體積、骨小梁厚度和顱骨厚度總體組間差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各年齡組兩兩比較上述骨質(zhì)參數(shù)結(jié)果見表2：隨年齡增長，骨密度、骨體積和骨小梁厚度在2～52 周組均隨年齡呈增大趨勢（骨小梁厚度26 周組稍降低），與年齡呈正相關(guān)（r值分別為0.965、0.963、0.913，P＜0.05）；52 周后稍降低。

大鼠顱骨的冠狀縫、矢狀縫和人字縫均隨著年齡的增長表現(xiàn)為寬→窄→融合變化趨勢，骨折類型也存在差異。2 周組未見明顯骨折線，但受壓縮側(cè)與對側(cè)相比可見明顯骨縫分離。4～104 周組均可見明顯凹陷性骨折痕跡，且隨著年齡增長，凹陷程度逐漸加重，直至出現(xiàn)孔狀骨折。大鼠顱骨的矢狀位掃描圖顯示，隨著大鼠年齡的增長，顱骨厚度逐漸增大。骨折形態(tài)方面，2～4周組僅見顱縫分離，6～104周組則出現(xiàn)粉碎性骨折，骨折形態(tài)呈“口小底大”的“火山口”樣外觀（圖2～3）。

表2 各年齡組大鼠顱骨骨質(zhì)參數(shù)增齡性變化Tab. 2 The age-related changes of bone material parameters of rat skulls at different age groups（n=6，）

表2 各年齡組大鼠顱骨骨質(zhì)參數(shù)增齡性變化Tab. 2 The age-related changes of bone material parameters of rat skulls at different age groups（n=6，）

注：1）與2 周組比較，P＜0.05；2）與4 周組比較，P＜0.05；3）與6 周組比較，P＜0.05；4）與8 周組比較，P＜0.05；5）與17 周組比較，P＜0.05；6）與26周組比較，P＜0.05；7）與52周組比較，P＜0.05。

組別/周2468 17 26 52 104骨密度/（mg·mm-3）103.15±1.96 155.60±3.271）233.99±7.891）2）279.41±15.412）3）290.61±18.483）365.91±15.534）5）600.62±26.395）6）469.58±23.646）7）骨體積/mm3 1.30±0.47 2.59±0.181）4.09±0.341）2）4.54±0.322）5.73±0.383）4）7.63±0.364）5）11.20±0.665）6）10.36±0.496）7）骨小梁厚度/mm 0.11±0.02 0.19±0.031）0.22±0.021）0.28±0.022）3）0.36±0.033）4）0.33±0.034）0.51±0.035）6）0.37±0.037）顱骨厚度/mm 0.20±0.02 0.21±0.01 0.27±0.011）2）0.37±0.032）3）0.44±0.023）4）0.51±0.034）5）0.90±0.035）6）0.79±0.056）7）

2.3 大鼠顱骨材料力學與骨質(zhì)參數(shù)的相關(guān)性分析

所有大鼠極限載荷、壓縮強度、壓縮模量均與骨密度、骨體積、骨小梁厚度、顱骨厚度呈正相關(guān)（P＜0.05，表3）。

表3 大鼠顱骨材料力學與骨質(zhì)參數(shù)相關(guān)性Tab. 3 Correlation between material mechanics and bone material parameters of rat skulls

3 討 論

目前，已有文獻[14-17]報道利用顱骨形態(tài)學特征進行年齡推斷。HENDERSON 等[14]研究認為，利用顱骨表面形態(tài)特征和顱骨骨縫結(jié)構(gòu)參數(shù)進行年齡推斷易受主觀因素影響，年齡推斷結(jié)果可能存在6～10 歲的誤差，實際應用價值值得商榷。莫世泰等[15]研究了冠狀縫、矢狀縫和人字縫等的愈合情況，發(fā)現(xiàn)顱縫的愈合程度與年齡存在正相關(guān)，該結(jié)果在CHIBA 等[16-17]的研究中也得到了證實，上述結(jié)果與本研究發(fā)現(xiàn)的隨著年齡增長，大鼠的顱縫由寬到窄直至融合呈現(xiàn)明顯的增齡性變化規(guī)律相一致。

TORIMITSU 等[18]通過對116具尸體顱骨進行力學試驗，發(fā)現(xiàn)其骨縫連接處破壞應力、破壞應力和顱骨厚度的平方比均與年齡存在相關(guān)性。LEE 等[6]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，顱骨的微觀結(jié)構(gòu)與力學參數(shù)間存在相關(guān)性。

本研究中，顱骨骨密度、骨體積和骨小梁厚度參數(shù)在52 周范圍內(nèi)與年齡呈正相關(guān)，具有較好的擬合度，提示可以利用上述骨質(zhì)參數(shù)進行年齡推斷。2、4、17、26、52、104 周齡大鼠分別與嬰幼兒（0～2 歲）、學齡前兒童（3～5 歲）、學齡兒童（10～12 歲）、青少年（18～20 歲）、中年（35～40 歲）和老年（65～70 歲）人群相對應[19]，提示顱骨骨密度、骨體積和骨小梁厚度參數(shù)在推斷中年及其以前人群年齡中具有優(yōu)勢。大鼠骨骼的快速生長發(fā)育多在26 周前，與人體骨骼發(fā)育相一致，故本研究分組的前期年齡間隔較短，后期較長，且各個具有代表性的年齡階段均包括在內(nèi)，對于探究人體各年齡階段骨折相關(guān)情況[20]也具有參考價值。本研究結(jié)果與ZHANG 等[21-22]研究不同年齡段大鼠股骨微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)變化趨勢基本一致，但二者的拐點年齡存在差異，后者骨密度、骨體積和骨小梁厚度數(shù)值逐漸增長到9月齡時開始下降，且各骨參數(shù)呈雙相變化，考慮造成拐點差異的原因可能是其分組間隔為1 月或2 月，與本研究的周齡分組不同。此外，研究的骨種類不同也是結(jié)論差異的重要原因。LILLIE 等[23]的研究也表明，隨著年齡增長，顱骨厚度的總體趨勢略有增加。本研究證實，隨著年齡增長，顱骨逐漸增厚，至52 周達最大值，其后略有下降，提示顱骨厚度也可以用于法醫(yī)學年齡推斷。

不同周齡大鼠顱骨骨折類型及形態(tài)存在差異。本研究顯示，低齡段的大鼠顱骨受壓易發(fā)生骨縫分離，而隨著年齡增長，受壓部位由凹陷性骨折逐漸表現(xiàn)為孔狀骨折。其原因可能是由于低齡大鼠顱骨彈性好，不易發(fā)生骨折，隨著年齡的增長，顱骨的脆性增大而彈性降低，故容易發(fā)生與致傷物接觸面形態(tài)類似的凹陷性骨折或粉碎性骨折。這與人類各年齡段人群骨折發(fā)生類型存在差異具有相似性。胎兒顱骨未完全閉合，通過自然分娩時受到母體產(chǎn)道的擠壓，若胎兒過大或產(chǎn)道過窄時容易發(fā)生新生兒顱骨骨縫分離或出現(xiàn)“乒乓球骨折現(xiàn)象”[24]；嬰幼兒和青少年四肢長骨受到外界暴力作用時，可能發(fā)生青枝骨折[25]；而中老年特別是老年人群骨骼在遭受損傷時比較容易發(fā)生錯位性骨折或粉碎性骨折[26-28]。據(jù)文獻[29-30]報道，隨著年齡的增長，骨骼質(zhì)量會降低，其基質(zhì)成分、骨皮質(zhì)孔隙率會發(fā)生變化，骨質(zhì)變疏松導致脆性增加，更易發(fā)生骨折風險。

壓縮試驗發(fā)現(xiàn)，不同年齡大鼠顱骨骨折的失效閾值存在差異。在2～26 周，隨著大鼠年齡增長，極限載荷、壓縮強度和壓縮模量呈明顯增大趨勢，與年齡呈正相關(guān)。大鼠顱骨壓縮強度和壓縮模量在骨骼發(fā)育期快速增大，在骨骼成熟期后增大幅度降低，可能與骨發(fā)育階段皮質(zhì)骨晶體結(jié)構(gòu)疏松，呈板狀結(jié)構(gòu)，承載能力較弱有關(guān)。隨著骨進入成熟期，纖維形成束狀結(jié)構(gòu)，其中礦物晶體緊密融合，具有較高的承載能力。隨著時間的推移，骨骼中晶體成分沿膠原纖維呈橫行生長，晶體變得非常細長，纖維變得更細、更脆，板狀結(jié)構(gòu)的某些部分甚至脫落，降低了大鼠顱骨彈性、抗壓縮性等生物力學性能[31]。本研究以雄性大鼠為對象，控制了性別因素，單純分析大鼠材料力學和骨質(zhì)參數(shù)隨年齡變化的趨勢，易于對變化趨勢進行分段擬合。結(jié)果提示，顱骨材料的極限載荷、壓縮強度和壓縮模量等生物力學參數(shù)在推斷青少年、學齡兒童、學齡前兒童及嬰幼兒人群的年齡中具有優(yōu)勢。

本研究中大鼠顱骨的骨密度、骨體積、骨小梁厚度及顱骨厚度等骨質(zhì)參數(shù)均與其極限載荷、壓縮強度、壓縮模量等材料力學參數(shù)呈正相關(guān)，驗證了顱骨的組織結(jié)構(gòu)決定顱骨的力學性能觀點。而年齡、性別以及影響成骨-破骨過程的生理和病理體質(zhì)因素對機體骨骼的材料力學特性均具有重要的影響[32-33]。已有報道[34-35]表明，取材部位的不同，以及顱骨是否附著軟組織[6，36]同樣會影響其微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)和材料力學參數(shù)，故在實驗時一定要控制變量，對單一因素進行研究，結(jié)果會更加可靠。

綜上所述，大鼠顱骨骨密度、骨體積、骨小梁厚度和顱骨厚度等骨質(zhì)參數(shù)，以及極限載荷、壓縮強度和壓縮模量等材料力學參數(shù)均在一定范圍內(nèi)與年齡增長呈正相關(guān)。本研究結(jié)果為顱骨骨折生物力學失效閾值與骨質(zhì)參數(shù)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時，證實顱骨材料力學與骨質(zhì)參數(shù)的增齡性變化規(guī)律可在一定范圍內(nèi)為法醫(yī)學年齡推斷提供參考。