miR-34c在急性腦梗死患者血清中的表達

駱嵩 屈洪黨 劉曉林 許娟娟 馬博 李理 劉東亮 郝佳妮 劉楚楚

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，安徽 蚌埠 233004)

缺血性腦卒中已經(jīng)成為全球范圍的第一大死亡病因，其高致殘率和高死亡率給家庭和社會都帶來了沉重的負擔〔1，2〕。近年來，微小RNA(miRNA)是新發(fā)現(xiàn)的一類重要的非編碼RNA(一般為18～25個核苷酸)。研究證實，miRNA家族廣泛存在于生物體中，并發(fā)現(xiàn)其參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)、炎癥反應(yīng)等諸多疾病的發(fā)生〔3～6〕。在小鼠神經(jīng)根痛的炎癥反應(yīng)動物模型中，發(fā)現(xiàn)miR-34c具有減輕炎癥反應(yīng)，緩解神經(jīng)根痛的作用〔7〕。以往的研究主要是觀察miR-34c調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生、AD炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，在急性腦梗死炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中的作用卻鮮有報道。本文通過檢測急性腦梗死患者外周血腫miR-34c表達水平，分析其與炎癥反應(yīng)指標的關(guān)系，為進一步尋找治療急性腦梗死新靶點提供新的思路和線索。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2018年1月至2019年1月在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診治的20例急性腦梗死患者為梗死組，男13例(65%)，女7例(35%)，平均年齡(62.35±5.81)歲；高血壓5例(25%)，高脂血癥4例(20%)，糖尿病2例(10%)，吸煙者6例(30%)，飲酒者5例(25%)；另外健康體檢者20例(正常組)，男14例(70%)，女6例(30%)，平均年齡(61.22±4.32)歲，高血壓4例(20%)，高脂血癥3例(15%)，糖尿病1例(5%)，吸煙者2例(10%)，飲酒者3例(15%)。兩組一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。納入標準：①符合急性腦梗死診斷標準〔8〕，且在磁共振成像(MRI)上證實與本次臨床癥狀相關(guān)的新發(fā)梗死；②腦梗死患者發(fā)病3 d內(nèi)，完善相關(guān)外周血等檢驗；③性別不限，美國國立衛(wèi)生研究院腦卒中量表(NIHSS)評分在4～20分；④相關(guān)檢驗檢查獲得患者或者法定直系家屬知情同意。排除標準：生命體征不穩(wěn)定、幽閉綜合征等不能配合影像學(xué)檢查的疾病；臨床資料不完整；本研究獲得蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2外周血采集及炎癥指標 采集研究對象清晨空腹靜脈血5 ml，并將其置于不含抗凝劑的試管內(nèi)。室溫下自然凝聚30～60 min，待血液凝固后，以2 000～3 000 r/min的速度離心5～10 min，上清液即為血清，保存在-80℃冰箱。炎癥指標如血清中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、尿酸(UA)、C反應(yīng)蛋白(CRP)含量。

1.3實時熒光定量(RT)-PCR法檢測血清中miR-34c水平 采用RT-PCR法檢測血清中miR-34c表達水平，U6 RNA 引物(內(nèi)參照引物)和miR-34c 莖環(huán)引物均購自上海百力格生物科技有限公司，基因表達相對量用2-△△Ct法進行分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進行方差分析、獨立樣本t檢驗、Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組miR-34c表達水平 與正常組相比，梗死組外周血中的miR-34c表達水平顯著下降(1.12±0.02 vs 0.65±0.07；P<0.05)。

2.2miR-34c與炎性指標關(guān)系 正常組LDL-C平均(2.17±0.22)mmol/L，UA平均(278.54±15.61)μmol/L，CRP平均(1.40±0.26)mg/L；神經(jīng)功能無缺損。兩組血清LDL-C、UA、CRP比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。梗死組LDL-C平均(2.66±1.00)mmol/L，UA平均(434.89±61.78)mmol/L,CRP平均(5.54±4.91)mg/L，入院時NIHSS平均(10.14±4.07)分。急性腦梗死患者外周血miR-34c與血清LDL-C、UA、CRP呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.672、-0.629、-0.723；P=0.043、0.038、0.041)；與入院時NIHSS呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.562,P=0.046)。

3 討 論

急性腦梗死已經(jīng)取代心血管疾病成為我國最常見的死亡病因〔1，2〕，目前的治療主要是及時進行責任血管再通，促進缺血組織的再灌注，但與此同時，缺血缺氧下小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和再灌注炎性損傷等都直接影響到腦梗死患者的臨床預(yù)后。目前研究證實，在缺血半暗帶區(qū)域同樣存在著“炎癥半暗帶”〔9～11〕，因此如何有效調(diào)節(jié)梗死后的炎癥反應(yīng)，減輕其對組織，尤其是缺血半暗帶組織的繼發(fā)性損傷尤為重要。近年來研究顯示，神經(jīng)系統(tǒng)中的miRNA在炎癥反應(yīng)過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，表明其參與急性腦梗死的炎癥反應(yīng)過程〔12，13〕。而以往在對神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，如AD研究中，發(fā)現(xiàn)miR-34c可以調(diào)節(jié)M1型小膠質(zhì)細胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)〔14～18〕；此外，在慢性神經(jīng)縮窄性損傷的小鼠模型中，miR-34c可以靶向調(diào)控含Pyrin結(jié)構(gòu)域NOD樣受體家族(NLRP)3炎性小體的活化，進而改善神經(jīng)痛癥狀〔7〕。隨著生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，這些miRNA在腦梗死發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)功能不斷得到發(fā)現(xiàn)和闡明，有望成為治療腦梗死的新靶點。

急性腦梗死組織損傷中，炎癥反應(yīng)占有十分重要的地位。LDL是發(fā)生動脈粥樣硬化的危險重要因素之一，其經(jīng)化學(xué)修飾作用后，易和清道夫受體結(jié)合，被巨噬細胞攝取，形成泡沫細胞，并停留于血管壁，不斷促使動脈壁形成斑塊；而CRP是細菌和嚴重組織損傷的一項非特異性指標。其也是機體固有免疫機制的一部分，可激活補體，增強和促進淋巴細胞、巨噬細胞生成活化等；UA是核蛋白和核酸中嘌呤分解代謝的最終產(chǎn)物，當生成增多時，相應(yīng)的氧自由基生成增多，從而加劇炎癥反應(yīng)，因此UA增高提示缺血缺氧腦組織炎癥反應(yīng)的劇烈〔19〕。這些炎癥指標均提示炎癥反應(yīng)發(fā)生，本研究進一步提示炎癥反應(yīng)在腦梗死的發(fā)病過程中起到重要的作用。

本研究提示miR-34c可能具有減輕炎癥反應(yīng)的作用；miR-34c外周血表達水平對于評估急性腦梗死患者神經(jīng)功能缺損程度有著重要的臨床意義。

綜上，外周血miR-34c表達水平的測定，對于評估腦梗死患者危重程度及炎癥反應(yīng)程度等具有一定的參考價值，但由于研究樣本數(shù)量較少，且為單中心，使得該研究可能存在偏差，因此在后續(xù)的研究中，我們將進一步擴大樣本，并進一步深入到細胞水平研究miR-34c調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的機制。