豬流行性腹瀉基因工程疫苗研究進展

韓 瑞，王清華，閆鵬先，師偉偉，賀 筍

（天康生物制藥有限公司，新疆 烏魯木齊 830032）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的急性腹瀉，其主要臨床表現(xiàn)為嘔吐，仔豬急性水樣腹瀉等。該病毒可以感染任意階段的豬，成年豬臨床癥狀不明顯，但哺乳仔豬感染后癥狀非常嚴重，死亡率可高達90%，給整個養(yǎng)豬行業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。PEDV于1971年首次在英國被發(fā)現(xiàn)，1978年于比利時分離出首個PEDV毒株，并命名為CV777，隨后PEDV開始席卷整個歐洲。1982年P(guān)EDV在亞洲出現(xiàn)，隨后在亞洲各個國家廣泛流行，但隨著近些年疫苗行業(yè)的發(fā)展，PEDV在亞洲的流行有所遏制。直至2010年，高致病性變異PEDV的出現(xiàn)引起了國內(nèi)疫情大規(guī)模暴發(fā)，隨后亞洲各國也相繼暴發(fā)了嚴重疫情，給亞洲各國養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的損失。2013年P(guān)EDV首次在美國被發(fā)現(xiàn)，隨即在國內(nèi)出現(xiàn)了PEDV大暴發(fā)，之后傳至北美洲各國，致使北美各國養(yǎng)豬業(yè)損失慘重。由于PED對養(yǎng)豬行業(yè)影響逐漸增大，各國均加強了對該病的防控，但目前還沒有專門針對該病的治療藥物，疫苗接種是目前最主要的防控手段。當(dāng)前市面流行的主要以傳統(tǒng)的PEDV滅活疫苗和弱毒疫苗為主，但由于PEDV變異速度快，基因型種類繁多，各個豬場之間的基因型都有很大區(qū)別，這使得當(dāng)前疫苗的防護效果差強人意。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，越來越多的基因工程疫苗，如亞單位疫苗，病毒樣顆粒疫苗，重組活載體疫苗，轉(zhuǎn)基因植物疫苗和核酸疫苗等逐漸被研發(fā)出來，受到企業(yè)的廣泛重視。本文就當(dāng)前PEDV基因工程疫苗的最新研究進展進行簡要的概述。

1 PEDV病毒

1.1 PEDVPEDV屬于α-冠狀病毒屬，病毒顆粒成不規(guī)則球形，大小不均一，粒子直徑范圍為130～170nm，其顆粒表面由長約18nm的棒狀突起覆蓋。其基因組大小約為28Kb，為單股正鏈RNA，整個基因組由5’非編碼區(qū)，3’非編碼區(qū)以及7個開放閱讀框組成。病毒粒子由四種結(jié)構(gòu)蛋白：纖突糖蛋白（Spike，S），包膜蛋白（Envelope，E），外膜蛋白（Membrane，M），核衣殼蛋白（Nucleocapcid，N）組成，分別由ORF2，ORF4，ORF5，ORF6基因編碼。ORF1a和ORF1b約占整個基因組的2/3，主要編碼nsp1-nsp16等16個非結(jié)構(gòu)蛋白，主要在病毒感染、基因組復(fù)制以及轉(zhuǎn)錄等過程中發(fā)揮作用。ORF3編碼PEDV中的唯一的一種離子通道類型的輔助蛋白，主要在病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用。

1.2 PEDV致病機理PEDV在豬群間主要通過糞口途徑傳播，也可以通過糞鼻途徑傳播。研究發(fā)現(xiàn)PEDV主要在豬小腸中復(fù)制、感染，從而導(dǎo)致小腸上壁絨毛細胞萎縮壞死，小腸功能紊亂，電解質(zhì)失衡，營養(yǎng)吸收不良，進而引起腹瀉。

研究表明氨基肽酶N（porcine aminopeptidase N，pAPN）是PEDV的一種細胞表面受體，在PEDV侵染小腸絨毛細胞中起到了一定的作用，但近期研究表明pAPN并不是唯一的受體，APN基因敲除的豬仍然可以感染PEDV，這說明還有其他的感染途徑。最近研究表明除了小腸外，鼻腔粘膜也可以檢測出PEDV陽性，說明上呼吸道極有可能也是PEDV的易感部位。Li等發(fā)現(xiàn)PEDV能夠經(jīng)過鼻腔黏膜下的樹突狀細胞的攝取進入鼻腔黏膜固有層，隨后被PEDV遞呈給CD3+淋巴細胞，而CD3+后淋巴細胞又經(jīng)淋巴循環(huán)和血液循環(huán)遷移至腸黏膜，通過細胞間的接觸導(dǎo)致腸道感染。PEDV進入細胞內(nèi)可以通過調(diào)控各種信號途徑以及細胞因子來促進自身繁殖，以及引起細胞凋亡。王晨陽等人通過敲除PEDV的ORF3以及DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)ORF3可以抑制Caspase 3，從而抑制細胞的凋亡，同時熒光定量PCR結(jié)果顯示感染正常PEDV細胞的HSP70表達量明顯高于感染ORF3缺失的PEDV的細胞。此外PEDV還可以通過炎癥應(yīng)激調(diào)控炎癥因子相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，促進IL-8的釋放從而引起炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致細胞死亡，達到持續(xù)感染的目的。最近研究發(fā)現(xiàn)PEDV感染后會激活細胞外信號激酶（ERK），壓力激活蛋白激酶（SAPK）信號通路參與細胞的復(fù)制和凋亡，更加有利于PEDV的持續(xù)感染。

2 基因工程疫苗

2.1 亞單位疫苗PEDV顆粒表面的棒狀突起主要是由S蛋白組成，S蛋白含有多個B淋巴細胞抗原表位，主要在細胞侵染、細胞融合方面起到重要作用，同時也是產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白。Makadiya等人分別在酵母，昆蟲細胞和哺乳動物細胞中表達了S1結(jié)構(gòu)域，免疫小鼠后能夠產(chǎn)生較高的IgG和IgA抗體滴度，中和實驗結(jié)果表明動物體內(nèi)產(chǎn)生較高的中和抗體，在免疫后28d中和抗體滴度能達到1:100左右。S蛋白胞外結(jié)構(gòu)域中含有一個核心中和表位（COE），包含S蛋白的第499-638位氨基酸，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對PEDV的中和抗體。Li等人將沙門氏菌鞭毛蛋白(rSF)以佐劑的形式與COE重組形成rSF-COE-3D融合蛋白，將該融合蛋白作為抗原對豬進行3次免疫，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)動物體內(nèi)產(chǎn)生了高滴度的IgG和IgA，血清中的中和抗體滴度大于250，同時體內(nèi)產(chǎn)生大量的IFN-γ和IL-4，攻毒后仔豬腹瀉率大幅降低，能夠起到一定的保護作用，這可能與鞭毛蛋白密切相關(guān)，鞭毛蛋白具有能夠引起免疫應(yīng)答的優(yōu)勢表位，從而刺激機體產(chǎn)生T、B細胞免疫應(yīng)答。Chang等人采用HEK293細胞成功表達了S-LTB三聚體融合蛋白，通過肌肉注射方式免疫5周齡的豬，雖然可以產(chǎn)生特異性的IgG和IgA，但在糞便中特異性IgA水平較低。

亞單位疫苗與滅活疫苗以及弱毒活疫苗相比，擁有安全性高、產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低等眾多優(yōu)勢，但由于亞單位疫苗免疫原性較弱，抗體水平較低，保護時間較短等諸多限制因素，后續(xù)研究可以從免疫方式，免疫佐劑的選擇等方面進行探究。其中免疫佐劑的研究尤為重要，良好的佐劑可以將完整構(gòu)象的抗原分子遞送到免疫細胞，能夠刺激機體產(chǎn)生有效的中和抗體。

2.2 病毒樣顆粒疫苗病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）疫苗是由病毒的一種或多種蛋白自組裝而成的和病毒類似的空心顆粒，無病毒核酸，無復(fù)制能力，具有很強的免疫原性和生物學(xué)活性，是當(dāng)前疫苗研究的一個重要方向。

Wang等人利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)成功構(gòu)建出了PEDVVLPs，對6周齡左右的小鼠2次免疫，分別在第2、4、6周后取血測定中和抗體滴度及IL-4水平，結(jié)果表明PEDVVLPs能夠引與滅活疫苗相當(dāng)?shù)闹泻涂贵w，同時能夠產(chǎn)生更高水平的IL-4。Lu等人將PEDV S蛋白的B細胞表位748YSNIGVCK755插入至乙型肝炎病毒核心衣殼蛋白上(HBcAg)，通過HBcAg的自組裝功能將B細胞表位展示于VLPs表面，4次免疫后檢測發(fā)現(xiàn)中和抗體滴小于1:20，但有意思的是在母豬分娩后母乳中的中和抗體水平逐漸增加，平均中和滴度能夠達到1:120，小腸病理切片顯示疫苗可以對小腸起到較好的保護作用。王翠玲通過分別構(gòu)建pFast-Bac-Dual-2S、pFastBac-Dual-2M、pFastBac-Dual-2E 質(zhì) 粒，利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)通過共感染的方式感染Sf9細胞制備出PEDV VLPs，通過肌肉注射的方式免疫小鼠，機體產(chǎn)生較高的滴度中和抗體，同時能誘導(dǎo)脾淋巴細胞產(chǎn)生較高滴度的IFN-γ和IL-4，表明PEDV VLPs可以激活機體的體液免疫和細胞免疫系統(tǒng)。作者又再次構(gòu)建了CTB融合蛋白質(zhì)粒并獲得拯救病毒pFastBac-Dual-2CTB，與其他拯救病毒共轉(zhuǎn)細胞獲得CTB嵌合的PEDV VLPs，通過口服的方式對小鼠和豬進行免疫/抗體中和實驗，間接ELISA以及ELISpot分析表明CTB嵌合的PEDV VLPs比未嵌合的VLPs能夠引起更強烈的細胞免疫和體液免疫應(yīng)答。

3 重組活載體疫苗

重組活載體疫苗是指將編碼有效抗原蛋白的基因重組到活載體上并使之表達的疫苗。活載體疫苗相較于傳統(tǒng)疫苗來說生產(chǎn)成本低、安全性好、能夠引起足夠強大的免疫應(yīng)答，可以在同一載體上插入不同的抗原基因，可用于研制多價多聯(lián)疫苗。目前還沒有獸用活載體疫苗上市，人用活載體疫苗的研究，產(chǎn)業(yè)鏈相對完成成熟，已經(jīng)有相應(yīng)產(chǎn)品上市。重組活載體疫苗主要包括病毒活載體疫苗和細菌活載體疫苗。

3.1 病毒活載體疫苗Chang等利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)分別將S蛋白和S1蛋白基因重組至桿狀病毒基因組上形成S-Bac和S1-Bac，然后將病毒分別對小鼠和豬進行肌肉注射免疫，S-Bac和S1-Bac均可以在體內(nèi)產(chǎn)生較高的IgG水平，但S-Bac可以產(chǎn)生更高的中和抗體，攻毒后顯示S1-Bac出現(xiàn)了較輕的臨床癥狀，而S-Bac幾乎沒有出現(xiàn)臨床癥狀。Ke等利用減毒重組水泡性口炎病毒(rVSVMT)為活載體，將刪除胞內(nèi)域19個氨基酸的S蛋白基因插入到載體中，成功構(gòu)建了重組病毒VSVMT-SΔ19，通過免疫小鼠發(fā)現(xiàn)體內(nèi)產(chǎn)生PEDV中和抗體滴度為1:100，母豬免疫后產(chǎn)生的PEDV中和抗體滴度為1:250，而且母豬分娩后5d內(nèi)的母乳中抗體滴度也達到了1:150，攻毒結(jié)果顯示對照組能夠足夠完全保護仔豬，保護率達100%。Liu等成功構(gòu)建了rAd-PEDV-S病毒，病毒在細胞中的滴度達到了1011PFU/mL，在4周齡的豬中進行免疫評估，發(fā)現(xiàn)只能夠產(chǎn)生體液免疫，細胞免疫并不明顯，不能對仔豬提供完全保護。

3.2 細菌活載體疫苗Hou等采用乳酸桿菌為表達載體，將枯草芽孢桿菌的聚谷氨酸合成酶A蛋白（pgsA）作為錨定基質(zhì)，并與PEDV N蛋白基因融合，將其展示到乳酸桿菌表面，通過口服和鼻內(nèi)免疫對母豬和小鼠進行接種，在接種后14d出現(xiàn)特異性IgG抗體，ELISA結(jié)果表明母豬血清中有較高的IgG抗體，更重要的是母豬初乳中的IgA水平明顯高于IgG水平，仔豬腹瀉率顯著降低。Wang等將PEDV COE基因重組到枯草芽孢桿菌中獲得B.subtilis-RC重組菌株，通過口服給藥的方式對豬進行免疫，ELISA結(jié)果表明血清中具有較高滴度的IgA和IgG抗體水平，同時口服免疫還導(dǎo)致內(nèi)皮淋巴細胞數(shù)量明顯增加，流式細胞結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD3+T淋巴細胞的數(shù)量明顯增加，并上調(diào)了CD4+/CD8+T細胞的比例，總之，B.subtilis-RC可以引起高水平的局部和全身免疫反應(yīng)。

4 轉(zhuǎn)基因植物疫苗

植物作為蛋白表達載體的研究由來已久，作為高等真核生物，在體內(nèi)可以對目的蛋白進行正確的折疊和翻譯后加工，形成具有正確結(jié)構(gòu)和功能的抗原，同時植物疫苗易于生產(chǎn)，儲存，安全性高，可以廣泛應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)中。但目前植物疫苗表達量普遍偏低，產(chǎn)業(yè)鏈不完成，因此產(chǎn)業(yè)化還需時日。

Ho等成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達PEDV COE蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草，通過Western Blotting鑒定COE蛋白已經(jīng)成功表達，且目的蛋白約占總蛋白的4%，達到234mg/kg，小鼠免疫結(jié)果表明植物疫苗可以刺激機體既可以產(chǎn)生體液免疫又可以產(chǎn)生細胞免疫，但中和抗體滴度只有1:60左右，需要從抗原設(shè)計方面進一步提高中和抗體滴度。Huy等成功構(gòu)建了PEDV COE基因與M細胞靶向配體（Co-1）基因的融合蛋白基因（COE-Co-1），并將COE-Co-1基因?qū)胫了居鷤M織，Western Blotting分析表明COE-Co-1蛋白已經(jīng)成功穩(wěn)定表達，目的蛋白占可溶性蛋白的0.083%，通過口服給藥的方式發(fā)現(xiàn)該抗原可以引起系統(tǒng)性免疫反應(yīng)和粘膜免疫反應(yīng)。Egelkrout等成功構(gòu)建了表達PEDV S1蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米，目的蛋白表達量可以達到20mg/kg，通過喂食方式進行粘膜免疫，ELISA結(jié)果表明其引起的中和抗體水平與商業(yè)疫苗相一致，可作為口服疫苗添加于飼料中。

5 核酸疫苗

核酸疫苗主要包括DNA疫苗和mRNA疫苗，其具有生產(chǎn)時間短，安全性高，免疫原性高等諸多優(yōu)點。但同時也面臨著生產(chǎn)成本，儲存運輸，技術(shù)要求高等劣勢。2014年Harrisvaccines公司已經(jīng)在美國申請了PEDV mRNA疫苗，而我國的獸用核酸疫苗目前還處于研發(fā)中。

Zhang等成功構(gòu)建了PEDV S1蛋白與TGEV S蛋白基因的融合基因SL7207(pVAXD-PS1-TS)，利用減毒沙門氏菌作為傳遞載體進行口服給藥，在給藥后2周抗體開始出現(xiàn)，6周時抗體水平達到頂峰，8周時抗體水平開始下降，血清中含有高滴度的中和抗體，同時也觀察到T淋巴細胞免疫引起的IFN-γ和IL-4水平的提升。其他眾多研究均發(fā)現(xiàn)核酸疫苗既可以刺激機體產(chǎn)生高水平的體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答。

核酸疫苗是近些年來，尤其是新冠疫情以來最受矚目的疫苗種類之一，尤其是mRNA疫苗具有抗體產(chǎn)生速度快、抗體滴度和保護率高、有效保護變異毒株等顯著優(yōu)勢，已經(jīng)在新冠疫苗上成功應(yīng)用。相信隨著mRNA技術(shù)的發(fā)展和產(chǎn)業(yè)鏈的完善，mRNA疫苗也必將應(yīng)用于獸用疫苗研發(fā)中。

6 展望

隨著養(yǎng)豬行業(yè)的崛起，豬病疫情的防控已成必然趨勢，高毒力的PED正在席卷全球，而接種疫苗是最有利的防控措施。PEDV作為一種腸道感染病毒，主要是刺激腸道免疫產(chǎn)生有效的中和抗體，而傳統(tǒng)疫苗則是刺激機體產(chǎn)生有效的血清IgG抗體，很少產(chǎn)生sIgA抗體，而最新的研究表明粘膜免疫刺激機體產(chǎn)生的sIgA抗體才能更有效的降低仔豬感染PEDV，降低死亡率。隨著分子生物技術(shù)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，PEDV基因工程疫苗的研發(fā)也將迎來大暴發(fā)，多種安全、有效、廉價的基因工程疫苗勢必會對養(yǎng)豬行業(yè)有巨大的幫助，且隨著基因工程疫苗的發(fā)展，未來免疫方式也勢必會逐漸實現(xiàn)從肌肉注射到口服給藥的逐步轉(zhuǎn)變，可以有效的刺激腸道產(chǎn)生更有效的sIgA抗體，提高仔豬的存活率，同時mRNA疫苗等新型的出現(xiàn)讓我們看到了未來疫苗研發(fā)新的方向，帶動整個行業(yè)的蓬勃發(fā)展。