影響血凝及血凝抑制試驗結(jié)果的因素

楊 麗

（遼寧省凌海市農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展中心-動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 凌海 121200）

血凝和血凝抑制試驗是目前縣級疫控中心獸醫(yī)實驗室進行禽流感、新城疫動物疫病監(jiān)測最常用的試驗方法之一。但血凝和血凝抑制試驗在實際操作中經(jīng)常受到多種因素的影響，增加了試驗誤差，甚至改變了試驗結(jié)果，本文結(jié)合實際工作，將影響試驗結(jié)果的因素進行總結(jié)分析。

1 被檢樣品對試驗結(jié)果的影響因素

1.1 樣品處理 采樣后將樣品傾斜放置2～4h（防止暴曬），讓其自然析出血清(夏天放在室內(nèi),冬天可以放置在37℃溫箱內(nèi)析出)。避免搖晃，防止溶血。采血后盡量避免馬上離心，防止分離后的血清形成膠凍狀或不完全膠凍樣。特殊情況需要分離血清時，需1500～2000轉(zhuǎn)/min，離心5min。

1.2 樣品保存 采樣后要及時送檢，不能在24h內(nèi)送到的，全血要分離出血清，將血清冷凍后送檢。分離的血清在冷藏溫度下（4℃）存放不能超過5d，冷凍溫度下（-20℃）不能存放時間過久（6個月為宜），冷凍后的血清不能反復(fù)凍融（不宜超過3次），會直接導(dǎo)致抗體效價降低。血清樣品保存不當，無論是運送中還是檢驗中，腐敗變質(zhì)會嚴重影響試驗結(jié)果。

2 雞紅細胞的制備對試驗結(jié)果的影響因素

2.1 雞紅細胞的采集 實驗室應(yīng)準備3只SPF公雞，條件不足的也可選免疫過禽流感和新城疫疫苗的的健康公雞，但應(yīng)比正常洗滌血球次數(shù)增加3～5次，洗去紅細胞表面的抗體，以減小結(jié)果誤差。

給大公雞采血時要做到無菌操作，用一次性注射器(10mL、9號針頭)可在一個大容器內(nèi)先加入抗凝劑，采血后拔下針頭將容器傾斜，沿著容器壁將血緩緩打入，注意速度不要太快，以免擠破紅細胞?？鼓齽┮m量添加（可以實際經(jīng)驗為準），加入的過多會影響紅細胞的結(jié)構(gòu)，抑制凝集現(xiàn)象產(chǎn)生，加入過少則血液出現(xiàn)凝集塊，影響試驗觀察，引起誤判使得凝集價偏低，凝集抑制價偏高。同樣抗凝劑加入的時間、方法不當同樣會產(chǎn)生血凝塊，影響檢測結(jié)果。采血后將采出的3只公雞血混合再離心，這樣配出的紅細胞均勻一致。

2.2 1%雞紅細胞的離心配制

紅細胞的濃度對血凝及血凝抑制試驗的結(jié)果有很大影響,采用國家標準規(guī)定1%的雞紅細胞。洗滌血球時離心的轉(zhuǎn)速為新城疫2000轉(zhuǎn)/min，禽流感1000轉(zhuǎn)/min，時間為10min，洗滌次數(shù)3～5次，不應(yīng)少于3次，直至上清液與PBS顏色接近為止。如果離心的轉(zhuǎn)速偏高，等體積紅細胞數(shù)量增大，血凝價測定偏低，血凝抑制價相應(yīng)偏低；相反離心的轉(zhuǎn)速偏低，等體積紅細胞數(shù)量減少，結(jié)果造成血凝價測定偏高，血凝抑制價相應(yīng)偏高。離心結(jié)束后用吸管將上清液移去（必須除去上層的白膜），切勿倒出去，直接倒出去達不到離心的目的，會使紅細胞混入洗液。移完后再用吸管加入等量的洗液，保持離心機的平衡。離心好的紅細胞用吸管（最好剪成斜型）小心吸取，不能反復(fù)吹吸，以免造成紅細胞結(jié)構(gòu)破壞，發(fā)生溶血，使用溶血后的血球相當于紅細胞的有效濃度降低，會出現(xiàn)上段所述結(jié)果，同時影響觀察效果。洗滌次數(shù)不能減少，以確保得到純凈的雞紅細胞。洗滌次數(shù)減少后，血清中的雜質(zhì)不能洗干凈，會干擾反應(yīng)體系病毒與紅細胞的反應(yīng)，造成試驗誤差。

配制好的紅細胞懸液當日用不完的可置4℃冰箱保存，時間不超過1周，但實際工作中如果每天都使用，超過3d紅細胞就開始溶血不能使用，以免影響試驗結(jié)果。

3 反應(yīng)板的選擇、使用對試驗結(jié)果的影響

3.1 反應(yīng)板應(yīng)選擇質(zhì)量好的一次性96孔V型板，要保持板面及凹孔的干凈，板面應(yīng)水平，不能彎曲、傾斜，使用不合格的反應(yīng)板會嚴重影響結(jié)果。板孔傾斜的角度會影響紅細胞的沉降速度，角度過小，紅細胞沉降加快，血凝價偏低，血凝抑制價偏高。角度過大，紅細胞沉降減慢，血凝價偏高，血凝抑制價偏低。

3.2 在試驗靜置過程中不能振動反應(yīng)板。當反應(yīng)時間沒到而頻繁的取放、觀察反應(yīng)板，操作不甚，凝集會受到影響，測定的凝集價偏低，而凝集抑制價會偏高。因此在靜置過程中一定要輕拿輕放，最好是等到時間再看結(jié)果，才能保證實驗的準確性。

4 抗原效價的測定及配置對試驗結(jié)果的影響

4.1 抗原的保存 血凝及血凝抑制試驗用的抗原一般是干粉，應(yīng)-20℃保存。在進行抗原效價的測定時，同一批號的抗原最好同時使用，并要經(jīng)過4HAU抗原回滴，對抗原進行最終校正，重復(fù)試驗，減少誤差?？乖哪瘍r在外界不穩(wěn)定，冷藏保存或反復(fù)凍融時其血凝價降低。測定好血凝價的抗原如果一次不能用完時應(yīng)分裝到滅菌離心管內(nèi)，管上標注分裝日期和效價，每管的分裝量最好是一次使用量，避免反復(fù)凍融。使用反復(fù)凍融的抗原，血凝抑制滴度會偏高，一般血凝價相差的滴度與血凝抑制價相差的滴度相一致。

4.2 稀釋液

稀釋液應(yīng)使用pH為7.0～7.2的PBS緩沖液，pH值7.2時，紅細胞沉降最充分，圖形最清晰；PBS液的pH在5.8以下,紅細胞易自凝，試驗結(jié)果不成立；pH7.8以上凝集的紅細胞洗脫加快，易造成觀察誤差，使得凝集價檢測偏低，凝集抑制價偏高。PBS液要現(xiàn)配現(xiàn)用，PBS要在高壓后調(diào)至pH7.2。如果用生理鹽水代替PBS液，要使用新開瓶的滅菌生理鹽水，稀釋液的配制時間不宜過長，一經(jīng)使用保存不要超過3周，否則可能被環(huán)境污染，不能保持無菌的反應(yīng)環(huán)境，使得檢測結(jié)果受到干擾，出現(xiàn)試驗不成立、跳孔等現(xiàn)象。

4.3 4單位病毒液的配制使用 計算好本次試驗所需要的病毒液量，配制的4U病毒液量應(yīng)適當正好，避免浪費和不夠，配制好的病毒液要混勻，混合不均時，病毒的含量不一，濃度高的血凝抑制價降低，濃度低的血凝抑制價升高。病毒液要現(xiàn)配現(xiàn)用，放置時間不應(yīng)超過6h，并置于4℃冰箱保存。加樣時從冰箱取出。時間過長，病毒的凝集力降低，不放冰箱保存，病毒的凝集力會很快下降，不能繼續(xù)使用。加入4U病毒抗原時應(yīng)該從稀釋倍數(shù)高的孔向稀釋倍數(shù)低的孔加入（即從后向前加），滴加過程中采取懸滴法，避免移液吸頭接觸液面而被反應(yīng)板中的液體污染。振蕩的時間一般不少于1min，時間過短不能充分混合，凝集抑制價升高，時間過長血球容易被破壞，結(jié)果失敗，陰、陽對照不能成立。

5 加樣過程對試驗結(jié)果的影響

5.1 血清樣品 病毒懸液和紅細胞懸液在使用前一定要搖勻，以保證每一孔中加入的濃度準確一致，避免加入的濃度高低不一，人為造成誤差。搖晃紅細胞懸液時力度不宜過大，防止紅細胞的結(jié)構(gòu)被破壞，造成溶血。

5.2 在使用微量移液器時，吸頭要安裝牢固，防止漏氣，操作時移液吸頭應(yīng)插到液面以下（要求懸滴的除外），手壓下的力度要均勻，否則移液量不準，造成結(jié)果偏差。在使用多道移液器時，吸取液體后觀察幾個吸頭中液面是否水平一致，有時操作不注意可能某個吸頭吸入量或多或少，直接影響結(jié)果測定。吸取的過程應(yīng)該做到“慢吸快打”，在吸液時要慢、準，放液時對準后速度要快，可以避免打完后吸頭下存留液體，保證加入的液體體積一致。

5.3 加液體時，最好懸滴，避免吸頭與反應(yīng)板孔接觸造成污染。尤其是在最后加入紅細胞懸液時，孔內(nèi)已有稀釋液、血清、4U抗原等，如果吸頭接觸到孔內(nèi)混合液，會造成各個孔內(nèi)液體相互污染，導(dǎo)致試驗結(jié)果出現(xiàn)誤差。所以在使用移液器時，一定要保持加樣器吸頭與凝集板孔間的距離，以保證每個凝集孔內(nèi)液體數(shù)量和濃度準確。

5.4 倍比稀釋血清時，抽吸6～8次，在吸取第一孔時要先按下移液器，再插入反應(yīng)板孔內(nèi)，吸取后插入第二孔液面以下，在反復(fù)抽取過程中，移液器吸頭不要離開液面，防止產(chǎn)生氣泡，造成移液體積不準確。

5.5 滴加1%紅細胞懸液時，要經(jīng)常晃動紅細胞懸液（注意不要用移液吸頭反復(fù)吹打或是攪動，避免破壞紅細胞），使紅細胞均勻分散在PBS中，防止紅細胞下沉，從而影響結(jié)果判定。

6 溫度和時間對試驗結(jié)果的影響

環(huán)境溫度通常應(yīng)在20～25℃，不能過高或過低，環(huán)境溫度除了用空調(diào)控制外，還可選擇將反應(yīng)板放置于室溫溫箱內(nèi)。溫度對HI試驗值的影響有時較大，室溫低于4℃，紅細胞會發(fā)生自凝。溫度高于37℃，凝集的紅細胞易洗脫，紅細胞很快沉降下來，即出現(xiàn)反應(yīng)物解離和紅細胞溶血現(xiàn)象。低于20℃反應(yīng)速度減慢，在規(guī)定時間觀察，對照結(jié)果不成立，此時讀孔，血凝價易判高，血凝抑制價易判低。所以選擇在20℃～25℃完成血凝抑制實驗，應(yīng)通過溫箱控溫。加入紅細胞靜置時間應(yīng)按照操作規(guī)程規(guī)定的時間及時觀察，超時10min以上，紅細胞發(fā)生裂解，結(jié)果不再有意義。

7 4HAU抗原回滴對試驗結(jié)果的影響

抗原回滴時必須選取奇數(shù)排、列的方法，便于取值。方法通常是在微量反應(yīng)板選擇3排5列，第5列為紅細胞對照孔。加樣后室溫(20～25℃)下靜置30～40min后觀察結(jié)果很重要。若第1、2孔凝集,則視為抗原配制正確。若第2孔流淌，則4HAU抗原濃度低，HA效價判高，需添加抗原。若第3孔發(fā)生凝集，則4HAU抗原濃度高，HA效價判低，需補加PBS。然后再次回滴，直至第1、2孔凝集,抗原配制正確為止。

8 小結(jié)

在血凝和血凝抑制試驗中，影響試驗結(jié)果的因素很多，只有嚴格按規(guī)定操作，細致、耐心地做好每一個環(huán)節(jié)，發(fā)現(xiàn)問題及時糾正處理，才能保證試驗結(jié)果的準確。