LncRNA H19在腫瘤發(fā)病中的作用機(jī)制研究進(jìn)展①

朱 敏 郗雪艷 杜伯雨 （湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，十堰442000）

1 概述

由美國國立人類基因組研究院啟動的多國聯(lián)合研究項(xiàng)目計(jì)劃——DNA元件百科全書（EN‐CODE）項(xiàng)目已證實(shí)，基因組中有80%的基因可被轉(zhuǎn)錄，然而最終可表達(dá)為蛋白質(zhì)的基因只有不到2%［1］。那些不能夠編碼蛋白質(zhì)的RNA分子被稱為非編碼RNA（noncoding RNA，NcRNA），常見的經(jīng)典NcRNA有：rRNA、tRNA、snoRNA和snRNA等。

根據(jù)編碼序列的長短，NcRNA可分為短鏈非編碼RNA和長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）。LncRNA即為長度大于200個nt的NcRNA，占RNA總量的0.03%～0.20%［2］。早期的基因組學(xué)研究認(rèn)為：除rRNA、tRNA之外的NcRNA是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能，曾被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“垃圾”。與mRNA相比，LncRNA缺少開放閱讀框、核苷酸序列較短、外顯子較少、一級序列保守性差，可存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，通常在疾病、組織或細(xì)胞的特定發(fā)育階段表達(dá)［3-6］。LncRNA是基因組中含量最為豐富的NcRNA，其類型較多、作用方式復(fù)雜。目前人類基因中能確定的LncRNA約有53 000個，但能夠明確功能的LncRNA卻不多，大多數(shù)LncRNA在細(xì)胞發(fā)育中的作用和機(jī)制尚未明確。

LncRNA的功能復(fù)雜，可影響基因表達(dá)的各方面，其些功能可能與DNA、RNA或蛋白質(zhì)的相互作用有關(guān)［7-8］。LncRNA主要從以下3方面參與基因的表達(dá)調(diào)控：①表觀遺傳調(diào)控：LncRNA通常通過與DNA、異染色質(zhì)蛋白、組蛋白修飾酶及轉(zhuǎn)錄因子等結(jié)合的方式對目的基因的表觀遺傳特征進(jìn)行修飾調(diào)控，如組蛋白和DNA的甲基化、乙酰化和泛素化等修飾；②轉(zhuǎn)錄調(diào)控：LncRNA可影響轉(zhuǎn)錄過程的不同方面和不同組件，如：啟動子區(qū)、RNA聚合酶Ⅱ（RNAPⅡ）、RNA聚合酶Ⅲ（RNAPⅢ）、組蛋白等，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)；③轉(zhuǎn)錄后翻譯調(diào)控：LncRNA可作為其他RNA如：snmRNA、miRNA等的來源，對mRNA進(jìn)行前處理、剪接、運(yùn)輸、降解和翻譯，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。此外，LncRNA參與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的方式還包括與特定的miRNA形成競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），促進(jìn)或抑制其他基因表達(dá)。正是由于這幾方面的作用，Ln‐cRNA可以參與腫瘤調(diào)控的各個方面，如腫瘤的代謝、增殖、耐藥、轉(zhuǎn)移及腫瘤細(xì)胞凋亡等。

2 LncRNA H19與腫瘤

LncRNA H19（以下簡稱為H19）是最早被證實(shí)的與癌癥相關(guān)的LncRNA。H19位于染色體11p15.5編碼區(qū)域，是一個完全來自母體的等位基因，編碼一個長度約2.3 kb的RNA分子，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有表達(dá)，能夠影響細(xì)胞的增殖和分化，具有相當(dāng)程度的保守性；在胚胎發(fā)育時期的內(nèi)胚層、中胚層及其分化的組織內(nèi)高度表達(dá)，在出生后的人類組織中，除心臟和骨骼肌外，在其他組織中表達(dá)程度低，幾乎不參與表達(dá)，但在組織損傷、應(yīng)激或腫瘤發(fā)生時可被重新激活表達(dá)［9-11］。隨著近來研究的深入，多種證據(jù)均清晰表明，異常表達(dá)的H19可作為一種致癌或抑癌因子參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程。

作為經(jīng)典的LncRNA，H19發(fā)揮作用的方式主要有以下幾方面：①編碼生成miR-675發(fā)揮調(diào)控功能；②作為ceRNA，依靠競爭性結(jié)合miRNA增強(qiáng)或抑制其下游基因表達(dá)，從而起到調(diào)控作用；③與蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA-蛋白復(fù)合體，作為橋梁介導(dǎo)蛋白質(zhì)間的相互作用。

2.1 H19通過編碼miR-675發(fā)揮調(diào)控作用 微小RNA（microRNA，miRNA）是一類由內(nèi)源性基因編碼的長度約為20～25個核苷酸的NcRNA。成熟的miR‐NA可被組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過堿基互補(bǔ)配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同誘導(dǎo)沉默復(fù)合體降解mRNA或者阻遏其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)［12］。miR-675是由其宿主H19的第一個外顯子區(qū)編碼生成的miRNA［13］。

與癌旁組織和正常組織相比，H19及miR-675在胃癌組織中高表達(dá)，H19的結(jié)合蛋白ISM1的表達(dá)與H19呈正相關(guān)，miR-675的靶基因CALN1的表達(dá)與miR-675呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步的研究證實(shí)，H19可通過對ISM1的直接調(diào)控和通過miR-675對CALN1表達(dá)的間接調(diào)控，共同促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［14］。此外，LIU等［15］的研究結(jié)果也顯示，H19依賴于miR-675以促進(jìn)胃癌AGS細(xì)胞的增殖和侵襲，在AGS細(xì)胞中過表達(dá)H19或miR-675可顯著降低RUNX1表達(dá)，提示RUNX1可能是H19/miR-675調(diào)節(jié)通路的下游分子，同時RUNX1可通過抑制H19/miR-675誘導(dǎo)的AKT/mTOR通路的激活，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。YAN等［16］的研究結(jié)果表明，H19/miR-675可抑制Fas相關(guān)死亡域蛋白（FADD）表達(dá)從而抑制包括caspase 8和caspase 3在內(nèi)的Caspase級聯(lián)通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖并抑制胃癌細(xì)胞凋亡，H19/miR-675/FADD/caspase 8/caspase 3通路可能成為胃癌治療的新靶點(diǎn)。在結(jié)腸癌細(xì)胞及結(jié)腸癌組織的原發(fā)病灶中，H19及miR-675也呈高表達(dá)，且體外研究證實(shí)miR-675可通過結(jié)合于編碼RB蛋白的mRNA的3′UTR降低腫瘤抑制因子—RB蛋白水平，從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，RB蛋白和H19/miR-675的表達(dá)在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中呈負(fù)相關(guān)，H19/miR-675可通過下調(diào)RB蛋白表達(dá)調(diào)控結(jié)腸癌的發(fā)展［17］。

以上研究均表明H19可通過miR-675實(shí)現(xiàn)其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲的作用。但也有研究結(jié)果提示H19/miR-675可能具有抑癌作用，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，miR-675在腫瘤組織中呈低表達(dá)，并與其下游靶基因CDK6（Cyclin dependent kinase 6）的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，CDK6為細(xì)胞周期中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，體外研究結(jié)果提示，來源于H19的miR-675表達(dá)水平的降低可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移，且miR-675可直接在腫瘤細(xì)胞中抑制CDK6的功能，提示H19/miR-675可能在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用［18］。此外，與不具有轉(zhuǎn)移能力的前列腺癌細(xì)胞P69相比，具有轉(zhuǎn)移能力的前列腺癌細(xì)胞M12中H19與H19來源的miR-675表達(dá)水平降低，并且二者與TGFβ1（transforming growth factorβ1）的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-675可直接與TGFβ1的3′UTR區(qū)結(jié)合并抑制其翻譯表達(dá)，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，提示H19/miR-675可能作為腫瘤抑制因子參與調(diào)控前列腺癌的轉(zhuǎn)移［19］。在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，H19/miR-675可通過AKT/GSK3β/Cdc25信號通路抑制肝細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，過表達(dá)H19可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）并抑制肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移［20］。

2.2 H19作為ceRNA發(fā)揮調(diào)控功能 SALMENA等［21］于2011年提出了ceRNA的理論推測，一定程度上揭示了“ceRNA-miRNA-mRNA”的基因調(diào)控模式，即ceRNA可通過與miRNA結(jié)合，解除miRNA對其靶基因mRNA的抑制作用，從而促進(jìn)靶基因的表達(dá)。越來越多的研究證實(shí)，H19可作為ceRNA競爭結(jié)合miRNA，起到分子海綿的作用，在各種腫瘤的生物學(xué)過程中發(fā)揮調(diào)控功能［22-24］。

Let-7家族在細(xì)胞的生長、分化、凋亡及腫瘤發(fā)生中具有重要意義。H19分子上有Let家族的典型和非典型結(jié)合位點(diǎn)，已有研究證實(shí)，H19存在2個可與Let-7結(jié)合的位點(diǎn)，H19通過分子海綿作用競爭性結(jié)合Let-7以解除Let-7對其靶點(diǎn)Dicer和Hmga 2的抑制作用，恢復(fù)兩種蛋白的正常表達(dá)［25］。在對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，H19在乳腺癌腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)水平較高，且體外研究結(jié)果提示H19的過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的成球、遷移及克隆形成能力；干擾H19的表達(dá)水平則可降低乳腺癌細(xì)胞的克隆形成和增殖能力，同時顯著抑制腫瘤細(xì)胞的成瘤能力，這些研究提示H19可能作為競爭性內(nèi)源性RNA，充當(dāng)miRNA Let-7的分子海綿，從而提高Let-7靶向的核心多能性因子LIN28的表達(dá)水平，由此H19、Let-7和轉(zhuǎn)錄因子LIN28之間形成了雙負(fù)反饋環(huán)，在乳腺癌腫瘤干細(xì)胞干性的維持中具有關(guān)鍵作用［26］。

與此類似，在其他腫瘤組織中H19也可通過競爭性結(jié)合miRNA從而起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲的作用。在膀胱癌中，H19可能作為ceRNA作用于miR-29b-3p，解除對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B的抑制，導(dǎo)致EMT和膀胱癌的轉(zhuǎn)移［27］。WANG等［28］對膽囊癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，H19可通過調(diào)節(jié)miR-194-5p的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)對AKT2表達(dá)的調(diào)控，促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的增殖及腫瘤體積的增大；而另外一項(xiàng)研究證實(shí)，H19還是miR-342-3p的上游分子，H19通過直接與miR-342-3p結(jié)合下調(diào)miR-342-3p水平，同時上調(diào)FOXM1（forkhead box protein M1），通過H19/miR-342-3p/FOXM1軸的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)控膽囊癌細(xì)胞的增殖［29］。在卵巢癌中，人皂苷20（S）-Rg3可下調(diào)H19的表達(dá)，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的Warburg效應(yīng)，其機(jī)制可能為：H19表達(dá)降低，其作為ceRNA競爭性結(jié)合miR-324-5p的效應(yīng)減弱，miR-324-5p的作用增強(qiáng)，抑制卵巢癌細(xì)胞的Warburg效應(yīng)也隨之增強(qiáng)，最終通過此效應(yīng)抑制了卵巢癌細(xì)胞的增殖［30］。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，H19作為內(nèi)源性分子海綿，通過隔離miR-130a-3p，解除miR-130a-3p對SOX4的抑制，促進(jìn)了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和成球能力及EMT過程［31］。在鼻咽癌中，H19可通過與miR-630競爭性結(jié)合，解除miR-630對組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶2（EZH2）的抑制，通過miR-630/EZH2通路抑制E-cadherin表達(dá)，增強(qiáng)了鼻咽癌細(xì)胞的侵襲能力［32］。在骨肉瘤細(xì)胞中，H19可競爭性結(jié)合miR-200，上調(diào)E盒結(jié)合鋅指蛋白1（ZEB1）和E盒結(jié)合鋅指蛋白2（ZEB2）的表達(dá)水平從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［33］；另一項(xiàng)研究結(jié)果提示，H19可與miR-141和miR-22結(jié)合，抑制其共同靶基因β-catenin表達(dá)，激活Wnt信號通路，并因此促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，加強(qiáng)骨的生成［34］。在結(jié)腸癌中，H19亦可作為ceRNA影響miR-138、miR-200a和miR-194-5p的功能，從而解除它們對相應(yīng)靶基因Vimentin、ZEB1/ZEB2、SIRT1的抑制，促進(jìn)EMT過程和耐藥［23，35-36］。

H19作為ceRNA，與之競爭性結(jié)合的miRNA還在被不斷地揭示和補(bǔ)充，越來越多的證據(jù)表明H19可作為ceRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控功能。

2.3 H19通過與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合體發(fā)揮調(diào)控作用 H19可與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合體，作為橋梁介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用。在膀胱癌中，H19與EZH2結(jié)合形成復(fù)合體，此復(fù)合物結(jié)合于靶基因的啟動子，進(jìn)而激活Wnt信號通路并間接抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)膀胱癌轉(zhuǎn)移［37］。在結(jié)腸癌中，H19可與外顯子連接復(fù)合體的核心因子真核翻譯起始因子4A3（eukaryotic translation initiation factor 4A3，eIF4A3）結(jié)合形成復(fù)合體，此復(fù)合體通過H19/eIF4A3/cyclin D1/E1/CDK4通路調(diào)控細(xì)胞周期，參與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展［38］。有研究者認(rèn)為，H19可通過與甲基化CpG結(jié)合域蛋白1（methyl-CpG-binding domain protein 1，MBD1）結(jié) 合 形 成H19-MBD1復(fù)合物，并通過對差異甲基化區(qū)1（DMR1）抑制的組蛋白進(jìn)行修飾的方式，參與印記基因網(wǎng)絡(luò)中多個基因的表達(dá)［39］。在結(jié)腸癌中，H19可能與mac‐roH2A結(jié)合參與CDK4和Cyclin D1的表達(dá)，進(jìn)而影響RB1蛋白的磷酸化和結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖［40］。

3 問題與展望

隨著近年來對LncRNA研究的不斷深入，LncRNA與腫瘤的關(guān)系也不斷地被揭示。作為LncRNA中的一員，H19與腫瘤的關(guān)系和其作用機(jī)制也逐漸被人們所認(rèn)識，越來越多的證據(jù)表明，H19在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

自腫瘤干細(xì)胞學(xué)說被提出以來，雖然存在爭議，但腫瘤干性特征在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也越來越多地引起研究人員的興趣。依照該學(xué)說，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞功能亞群，其在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，越來越多的研究提示，LncRNA可能是腫瘤干細(xì)胞亞群的關(guān)鍵調(diào)控因子。目前已經(jīng)有研究人員嘗試了關(guān)于H19對幾種腫瘤干細(xì)胞作用的研究，但成果仍然不多［41-44］。深入研究H19對不同腫瘤干細(xì)胞的作用機(jī)制有望成為日后研究的重點(diǎn)，同時也可為深入揭示H19與腫瘤之間的關(guān)系提供證據(jù)，更有可能為腫瘤的臨床診療提供新靶點(diǎn)和分子標(biāo)志物。