DNA甲基化在免疫型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的研究進(jìn)展①

賈紫千 馮曉玲 李娜 張楊 蔣莎（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱150040）

復(fù) 發(fā) 性 流 產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指孕婦在妊娠20周前，連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的自然流產(chǎn)，發(fā)病率約為2%~4%［1］。導(dǎo)致RSA發(fā)病的原因復(fù)雜，其中約一半的RSA夫婦不能被明確診斷，稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrentspontaneous abortion，URSA）。正常妊娠的建立需要母體對(duì)胚胎半同種異體抗原產(chǎn)生免疫耐受，以防止母體免疫系統(tǒng)對(duì)胚胎產(chǎn)生免疫攻擊，而引發(fā)流產(chǎn)［2］。這種免疫因素造成的RSA與母體自身抗體及母體免疫耐受失衡有關(guān)，其中后者與URSA關(guān)系密切。母胎界面上的免疫細(xì)胞對(duì)維持母胎免疫耐受平衡起關(guān)鍵作用［3］。DNA甲基化為廣泛存在的表觀修飾方式，異常的DNA甲基化可影響免疫細(xì)胞的增殖、分化及凋亡，而介導(dǎo)多種免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展［4］。因此，DNA甲基化可通過調(diào)控母體自身抗體及免疫細(xì)胞功能介導(dǎo)RSA的發(fā)生。

1 DNA甲基化

DNA甲基化屬于一種動(dòng)態(tài)的表觀遺傳修飾，是甲基化與去甲基化平衡的過程，其在決定哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)育、譜系識(shí)別和轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面發(fā)揮重要作用［5］。DNA甲基化是通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DN‐MT1、DNMT3A、DNMT3B）的催化，將活化的甲基添加到第5個(gè)碳位置CpG二核苷酸的胞嘧啶上，最終形成5-甲基胞嘧啶產(chǎn)物（5-methylcytosine，5-mC）的過程［6］，其可引起DNA構(gòu)象改變，從而影響機(jī)體免疫相關(guān)基因及細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。DNA甲基化的異?？杀憩F(xiàn)為甲基化缺陷、高甲基化及甲基化酶高表達(dá)。DNA低甲基化促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，使免疫細(xì)胞異常活躍，免疫功能紊亂。哺乳動(dòng)物的DNA甲基化動(dòng)態(tài)過程大體都表現(xiàn)出生殖細(xì)胞高甲基化、胚胎低甲基化［7］。著床發(fā)育過程DNA甲基化的缺陷可導(dǎo)致胚胎發(fā)育障礙及胚胎死亡，高甲基化可引起胚胎細(xì)胞基因突變［8］。在胚胎發(fā)育過程中，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶是促進(jìn)細(xì)胞分化的必需酶，DNMT1的主要作用是通過DNA的復(fù)制來維持甲基化水平，研究認(rèn)為DNMT1的紊亂可引起絨毛組織中DNA甲基化水平降低，是導(dǎo)致早期妊娠失敗的原因［9］。而DN‐MT3A和DNMT3B稱為從頭甲基化，是將未發(fā)生甲基化的CpG催化出新的甲基化位點(diǎn)，可促進(jìn)蛻膜細(xì)胞、滋養(yǎng)細(xì)胞的分化與增殖及胚胎的發(fā)育［10］。

2 DNA甲基化在免疫型RSA中的作用

免疫因素導(dǎo)致的RSA可分為母體自身抗體對(duì)胚胎產(chǎn)生排斥反應(yīng)的自身免疫型RSA，以及母胎界面中母體免疫耐受功能失衡，無法識(shí)別來自父系的胚胎抗原呈現(xiàn)低免疫反應(yīng)，引起母體封閉抗體陰性而攻擊胚胎的同種免疫型RSA。

2.1 在自身免疫型RSA中的作用自身免疫型RSA可因母體患有某種自身免疫性疾病，而產(chǎn)生特定的抗體，排斥胚胎著床及發(fā)育，包括組織非特異性自身抗體及組織特異性自身抗體。

2.1.1 組織非特異性自身抗體組織非特異性自身抗體包括抗磷脂抗體（antiphospholipid antibody，aPL）、抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）及抗DNA抗體等。aPL又包括抗心磷脂抗體（anticardio‐lipin antibody，ACA）、狼瘡抗凝因子、抗β2糖蛋白1（β2GP-1）抗體。ACA陽性是導(dǎo)致RSA發(fā)病最主要的原因，ACA可通過胎盤血管內(nèi)皮競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合磷脂受體，損傷胎盤血管內(nèi)皮，使胎盤形成血栓，導(dǎo)致蛻膜與胎盤供血不足、胎盤栓塞梗死，造成妊娠失?。?1］。約20%的RSA患者合并有抗磷脂抗體綜合征（antiphospholipid antibody syndrome，APS）［2］。有研究發(fā)現(xiàn)，抗β2GP1-CXCL4抗體復(fù)合物可激活內(nèi)皮細(xì)胞釋放促炎和促凝血因子形成APS模型，激活DNMT3B、TET1、HDAC9等甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)，可影響APS患者白介素8（interleukin-8，IL-8）啟動(dòng)子和組織因子（tissue factor，F(xiàn)3）第一內(nèi)含子的表觀遺傳修飾的改變，其中IL-8啟動(dòng)子甲基化可作為APS的鑒別因素或臨床表現(xiàn)，IL-8和F3甲基化水平的差異預(yù)示了血栓形成前的炎癥過程［12］。ANA和抗DNA抗體多在系統(tǒng)性紅斑狼瘡及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病中呈陽性，其引發(fā)RSA的機(jī)制尚不明確，抗DNA抗體與RSA的關(guān)系尚存爭(zhēng)議。目前認(rèn)為ANA導(dǎo)致的RSA可能是由于感染因素，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎癥的發(fā)生，使胚胎不能植入；或血液中的ANA免疫復(fù)合物沉著于蛻膜血管組織中，影響胎盤發(fā)育，造成早期妊娠丟失［13］。有研究發(fā)現(xiàn)患有自身免疫性疾病的患者T細(xì)胞中含有低甲基化的DNA和類似的自身免疫性T細(xì)胞亞群，認(rèn)為DNA甲基化的缺陷是自身免疫性疾病的發(fā)病原因［14］。

2.1.2 組織特異性自身抗體組織特異性自身抗體包括抗精子抗體（antisperm antibody，AsAb）、抗卵巢抗體（anti ovarian antibody，AoAb）、抗子宮內(nèi)膜抗體（endomethal antibody，EmAb）、抗甲狀腺抗體（antithyroid antibody，ATA）等。AsAb可通過干擾精子獲能及頂體反應(yīng)阻礙受精卵的形成，同時(shí)激活巨噬細(xì)胞形成，殺傷精子或受精卵，從而造成早期流產(chǎn)。熱休克蛋白（heat shock proteins，HSP）可與人類AsAb發(fā)生反應(yīng)，阻止受精，HSPA1L啟動(dòng)子的DNA甲基化降低，可使該蛋白含量上調(diào)，則含有HS‐PA1L的精子更容易被殺傷［15］。AoAb的產(chǎn)生代表自身免疫功能的紊亂，卵巢受到感染產(chǎn)生抗體，而影響卵巢功能，抑制卵子排出，使卵巢內(nèi)分泌功能紊亂，著床后卵巢分泌的雌孕激素不足，進(jìn)而導(dǎo)致RSA的發(fā)生。DNMT存在于卵母細(xì)胞中，隨著卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)到胚胎的植入，呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)的增加，DNMT的缺陷會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟受損、胚胎死亡及異常基因表達(dá)相關(guān)的綜合征，如免疫功能異常［16］。Em‐Ab的形成可由于子宮內(nèi)發(fā)生炎癥反應(yīng)，從而激活子宮內(nèi)膜組織抗原形成抗體，受損的子宮內(nèi)膜可影響胚胎的植入或發(fā)育，引起流產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)反復(fù)胚胎植入失敗的婦女子宮內(nèi)膜的網(wǎng)蛋白表達(dá)下調(diào)，在整個(gè)月經(jīng)周期中，子宮內(nèi)膜中的甲基化譜是發(fā)生變化的，在子宮內(nèi)膜甲基化的基因組調(diào)控下，可影響子宮內(nèi)膜生物學(xué)的改變［17］。妊娠早期正常的生理變化，如血漿血量增加、碘濃度降低、甲狀腺結(jié)合球蛋白產(chǎn)生增加，都可導(dǎo)致妊娠期間對(duì)甲狀腺激素的需求增加，當(dāng)RSA患者免疫功能紊亂，血清ATA含量升高，高表達(dá)的ATA引起胎盤反應(yīng)性增高，致使胎盤功能降低，發(fā)生流產(chǎn)［18］。經(jīng)研究證實(shí)甲狀腺功能亢進(jìn)患者的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞整體呈低甲基化趨勢(shì)，DNMT1的表達(dá)也普遍偏低［19］。

2.2 在同種免疫型RSA中的作用母胎界面屬于獨(dú)特的免疫位點(diǎn)，可耐受半同種異體的胎兒，并維持宿主對(duì)病原體的防御。同種免疫型RSA的發(fā)生是母體免疫細(xì)胞與來自滋養(yǎng)層及蛻膜中的胎兒免疫細(xì)胞之間的免疫耐受不平衡導(dǎo)致的，包括固有免疫紊亂和獲得性免疫紊亂。胚胎的植入過程表現(xiàn)為一種促炎狀態(tài)，妊娠的維持需要母胎間各類細(xì)胞因子處于平衡［2］。

2.2.1 固有免疫固有免疫屬于自然的免疫反應(yīng)，固有免疫應(yīng)答的細(xì)胞可永久性的存在于母胎界面，尋找可威脅妊娠的外來抗原。胎盤及蛻膜是固有免疫應(yīng)答的重要組成部分，蛻膜可合成各種趨化因子，包括自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）及補(bǔ)體系統(tǒng)等。

2.2.1.1 NK細(xì)胞蛻膜NK細(xì)胞可促進(jìn)血管生成和滋養(yǎng)層的入侵，與胎盤的發(fā)育密切相關(guān)。正常妊娠者外周血NK細(xì)胞含量在受精卵植入后呈下降趨勢(shì)，RSA患者外周血中NK細(xì)胞CD56+/CD16+升高，可損傷妊娠組織，導(dǎo)致RSA［20］。有研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化的變化與人類NK細(xì)胞活化程度相關(guān)，活化的NK細(xì)胞可導(dǎo)致CpG低甲基化，已知的DNA甲基化調(diào)節(jié)的免疫位點(diǎn)也在活化的NK細(xì)胞（如TNF-α、LTA、IL-13、CSF2）中發(fā)現(xiàn)?；罨腘K細(xì)胞處于高度去甲基化狀態(tài)，而原始NK細(xì)胞處于低去甲基化狀態(tài)，說明NK細(xì)胞的甲基化具有可塑性和重塑性［21］。提示隨著受精卵的植入到胚胎的形成，NK細(xì)胞表達(dá)升高導(dǎo)致的DNA去甲基化過程異常，可能是RSA的發(fā)病原因。

2.2.1.2 巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞屬髓樣免疫細(xì)胞，主要分為兩種類型：M1型具有殺菌和促炎功能，M2型具有免疫調(diào)節(jié)功能。受精卵著床前，蛻膜巨噬細(xì)胞向M1型極化，被認(rèn)為是人類胚胎和子宮內(nèi)膜間活躍的介質(zhì)，可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，使腫瘤因子表達(dá)升高［22］。在胚胎植入后，蛻膜基質(zhì)中的M2型巨噬細(xì)胞顯著增加，使T淋巴細(xì)胞活躍，吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）高表達(dá)，保護(hù)胎盤及胎兒的發(fā)育，當(dāng)胎盤發(fā)育結(jié)束，蛻膜巨噬細(xì)胞表達(dá)開始下降［23］。研究認(rèn)為母胎界面上強(qiáng)烈的促炎反應(yīng)可能不利于妊娠的維持，而DNA甲基化有助于母胎界面上的巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用，且母體細(xì)胞與胎兒細(xì)胞的DNA甲基化存在顯著差異，與免疫應(yīng)答相關(guān)的甲基化多在胎兒細(xì)胞中呈高表達(dá)［24］。SPINELLI等［25］通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人類IDO1基因甲基化異常的改變與流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)，妊娠期間抑制IDO1的活性可導(dǎo)致胎兒死亡，對(duì)早期流產(chǎn)的整倍體胎盤分析顯示呈高甲基化表達(dá)。

2.2.1.3 DCs DCs被稱為有效的抗原提呈細(xì)胞，在免疫應(yīng)答過程中具有誘導(dǎo)抗原特異性激活和抑制的獨(dú)特能力，DCs可激活NK細(xì)胞，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞分化及Th細(xì)胞平衡，存在于非妊娠子宮、子宮內(nèi)膜、胎盤和蛻膜中［22，26］。DCs在蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中含量較低，但具有識(shí)別胎兒抗原的能力，在調(diào)節(jié)活化的母體T細(xì)胞中起重要作用。著床時(shí)子宮內(nèi)的DCs可能是對(duì)胎兒最大的免疫威脅，隨著胚胎的植入，遷移的DCs在蛻膜基質(zhì)中生長(zhǎng)，并通過基質(zhì)細(xì)胞衍生因子及其受體調(diào)節(jié)蛻膜血管的生成和血管擴(kuò)張，從而促進(jìn)胎盤的形成及胚胎的發(fā)育［27］。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）是蛻膜組織免疫耐受所需要的抑制性CD4+T輔助細(xì)胞的一個(gè)子集，正常妊娠人類的外周血Treg數(shù)量呈上升趨勢(shì)，蛻膜組織中Foxp3+Treg水平的降低是導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生的原因，而DCs可促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞中Foxp3位點(diǎn)呈低甲基化狀態(tài)，使母胎界面免疫功能紊亂，發(fā)生RSA［28-29］。

2.2.1.4 補(bǔ)體系統(tǒng)補(bǔ)體系統(tǒng)（complement sys‐tem，CS）為多種自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制，在缺血/再灌注過程中導(dǎo)致多種炎癥驅(qū)動(dòng)，而造成組織損傷。正常妊娠期間，CS在母胎界面上被激活，若胎盤中補(bǔ)體激活過多可能存在胎盤損傷及胎兒死亡的風(fēng)險(xiǎn)，因此在胎盤中保持CS的平衡非常重要。人體中補(bǔ)體C3含量最高，來源于胎盤，為胚胎營(yíng)養(yǎng)因子，是CS的樞紐，可介導(dǎo)補(bǔ)體系統(tǒng)激活，對(duì)妊娠早期胎盤的發(fā)育起重要作用［30］，但若其含量過高，引起補(bǔ)體系統(tǒng)過度激活，是導(dǎo)致免疫型RSA發(fā)生的原因。有研究發(fā)現(xiàn)C3基因體中有明顯的高甲基化CpG區(qū)，從而激活CS，使過多的補(bǔ)體在胎盤中沉積，誘導(dǎo)免疫性損傷，形成血栓前狀態(tài)，抑制胚胎發(fā)育，與RSA關(guān)系密切［31］。

2.2.2 獲得性免疫獲得性免疫是后天機(jī)體免疫系統(tǒng)受到病原體及有毒代謝產(chǎn)物等抗原刺激后，產(chǎn)生特異性抗體的識(shí)別及防御能力，促進(jìn)免疫應(yīng)答。Treg的異常表達(dá)、輔助性T細(xì)胞（T help cell，Th）的失衡及封閉抗體（blocking antibodies，BA）的缺失都是引起獲得性免疫功能紊亂，導(dǎo)致RSA的發(fā)病機(jī)制。

2.2.2.1 Treg Treg可分為來源于胸腺的天然Treg（nTreg）及在外周由幼稚細(xì)胞誘導(dǎo)的適應(yīng)性Treg（iTreg），nTreg有助于抑制免疫排斥，而iTreg的免疫調(diào)節(jié)能力相對(duì)較弱，nTreg的標(biāo)志物CD4+CD25+Treg的低表達(dá)能夠破壞免疫耐受［32］。妊娠期Treg主要集中于母胎界面，蛻膜T細(xì)胞可調(diào)節(jié)胎盤微環(huán)境并識(shí)別胎兒抗原，防止免疫排斥，促進(jìn)胚胎植入［33］。Treg的缺陷是導(dǎo)致反復(fù)胚胎植入失敗或胚胎停育，形成RSA的原因。Treg的缺陷是由機(jī)體轉(zhuǎn)錄因子Foxp3突變或缺失引起的，nTreg的發(fā)育不僅需要Foxp3的表達(dá)，還需要建立nTreg型CpG的低甲基化模式［34］。胚胎植入的過程相當(dāng)于炎癥反應(yīng)，有研究證實(shí)腫瘤壞死因子受體2（tumor necrosis factor receptor2，TNFR2）在炎癥條件下表達(dá)，TNFR2可通過限制Foxp3啟動(dòng)子的DNA甲基化來誘導(dǎo)Treg，并激活DC調(diào)節(jié)其功能［35］。因此Foxp3的正常表達(dá)及nTreg DNA低甲基化，對(duì)于妊娠的維持至關(guān)重要。

2.2.2.2 輔助性T細(xì)胞Th根據(jù)功能不同可分為Th1、Th2及Th17［36］。Th1主要參與外周組織器官特異性自身免疫性疾病的發(fā)生，促進(jìn)免疫排斥反應(yīng)，是造成RSA的潛在原因。Th2參與抗炎反應(yīng)，可減少胚胎毒性的分化，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，抑制Th1的分化功能［37］。因此，正常妊娠的建立，母胎界面細(xì)胞因子需要偏于Th2的表達(dá)。Th17可產(chǎn)生一系列促炎細(xì)胞因子和宿主防御因子，在預(yù)防妊娠期病理感染中發(fā)揮重要作用［2］。Th17異常表達(dá)，與胎兒丟失有關(guān)，可能導(dǎo)致RSA［38］。有研究發(fā)現(xiàn)正常妊娠前期Th2通路基因甲基化水平的變化更為頻繁，而在妊娠后期Th1通路CpG甲基化水平的變化較頻繁，因此Th1與Th2基因甲基化變化的情況與妊娠的維持相關(guān)［39］。YANG等［40］對(duì)CD4+T細(xì)胞分泌的Th1和Th17 DNA甲基化水平的變化進(jìn)行了全面分析，相比于Th1，Th17 DNA去甲基化區(qū)域的數(shù)量更多，與nTreg有更大的重疊。

2.2.2.3 封閉抗體BA是因胚胎同種半異體移植物刺激人類白細(xì)胞（human leukocyte antigen，HLA）、滋養(yǎng)細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等抗原與母體免疫系統(tǒng)反應(yīng)所產(chǎn)生的一類保護(hù)性IgG抗體，其可阻斷母體免疫系統(tǒng)對(duì)胚胎的攻擊。BA的缺乏或水平較低，可影響母體免疫應(yīng)答，是導(dǎo)致URSA發(fā)生的主要原因。HLA-G基因主要在妊娠期母體胎盤細(xì)胞中表達(dá)，該基因編碼多種亞型，可在整個(gè)母胎界面上完成多種功能，HLA-G蛋白水平的降低是妊娠失敗的原因，-725G等位基因的甲基化可抑制HLA-G轉(zhuǎn)錄，下調(diào)HLA-G蛋白表達(dá)，致使胚胎丟失［41］。

3 結(jié)語

成功的妊娠離不開各種免疫因素間的動(dòng)態(tài)平衡，母體自身免疫抗體的產(chǎn)生及母胎界面間的免疫調(diào)節(jié)失衡，都是影響胚胎植入，導(dǎo)致RSA發(fā)生的原因。DNA甲基化的異常不但與多種免疫性相關(guān)疾病的發(fā)生有關(guān)，又可通過影響母胎界面的免疫耐受，引起母體免疫系統(tǒng)對(duì)胚胎產(chǎn)生防御性排斥反應(yīng)。DNA甲基化作為表觀遺傳修飾領(lǐng)域中最具前景及敏感性的生物學(xué)標(biāo)志物，其在腫瘤學(xué)中研究廣泛，認(rèn)為DNA甲基化的發(fā)生早于基因突變，并可直接從組織中獲取相關(guān)遺傳物質(zhì)，對(duì)疾病進(jìn)行預(yù)防及治療。免疫型RSA與腫瘤的發(fā)病機(jī)制類似，都表現(xiàn)為各類免疫細(xì)胞異常的表達(dá)而對(duì)免疫應(yīng)答產(chǎn)生抑制作用。相信隨著對(duì)表觀遺傳學(xué)研究的深入，可以進(jìn)一步探索出DNA甲基化對(duì)免疫型RSA的靶向診斷及精準(zhǔn)治療，以促進(jìn)生殖醫(yī)學(xué)更快的發(fā)展。