蘇淮豬BMP7基因3′-UTR多態(tài)性分析
2021-03-29 01:13:44尹杭杜星潘增祥李強(qiáng)劉紅林李齊發(fā)
尹杭,杜星,潘增祥,李強(qiáng),劉紅林,李齊發(fā)*
(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.江蘇省淮陰種豬場(chǎng),江蘇 淮安 223322)
骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein 7,BMP7)是BMP/SMAD信號(hào)通路的重要配體,在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育、骨骼發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育、生殖生理乃至癌癥等疾病發(fā)生等過程中均發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)BMP7在雌性生殖器官如卵巢、輸卵管和子宮等中表達(dá),特別是在卵泡膜細(xì)胞中高表達(dá),在顆粒細(xì)胞中也檢測(cè)到其存在[5-6]。在卵巢組織中,BMP7主要通過旁分泌或自分泌形式調(diào)節(jié)類固醇激素生成、卵泡細(xì)胞(包括卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞等)狀態(tài)、卵泡發(fā)育和排卵等,進(jìn)而影響雌性動(dòng)物生殖力。在類固醇激素生成方面,添加BMP7融合蛋白可以刺激卵巢顆粒細(xì)胞釋放雌激素(E2)[5]。利用BMP結(jié)合蛋白如gremlin、noggin、chordin和follistatin拮抗BMP7則可促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞的雄激素分泌[6]。在卵泡細(xì)胞狀態(tài)方面,BMP7可促進(jìn)大鼠卵巢中顆粒細(xì)胞的增殖[7]。在卵泡發(fā)育方面,在大鼠卵巢中注射BMP7會(huì)增加各級(jí)卵泡(如原始卵泡、初級(jí)卵泡、腔前卵泡和有腔卵泡等)數(shù)量[7]。這些結(jié)果表明BMP7在卵泡發(fā)育和雌性生殖中具有重要作用。
卵巢組織中BMP7基因表達(dá)水平與家畜繁殖力密切相關(guān),研究發(fā)現(xiàn)多胎綿羊品種或個(gè)體卵巢組織中BMP7基因表達(dá)水平顯著高于單胎綿羊品種或個(gè)體[8-9]。經(jīng)全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序(WGBS)發(fā)現(xiàn)卵巢組織中BMP7基因的DNA甲基化與綿羊高繁殖力關(guān)系密切[10]。在長(zhǎng)白豬-杜洛克-大白豬家系中,利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)發(fā)現(xiàn)BMP7是排卵數(shù)性狀的候選基因[11]。最近,基因組重測(cè)序發(fā)現(xiàn)BMP7是大白豬產(chǎn)仔數(shù)性狀(包括總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù))的候選基因[12]。然而,目前在BMP7基因上發(fā)現(xiàn)的與豬繁殖性狀關(guān)聯(lián)的多態(tài)位點(diǎn)較少。本文以蘇淮豬(1個(gè)以新淮豬為母本、大白豬為父本培育而成的瘦肉型新品種,具有生長(zhǎng)速度快、瘦肉率高、耐粗飼和肉質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn),平均每胎產(chǎn)仔數(shù)10頭以上,3胎以后可達(dá)13頭以上,與高繁殖力豬種相比仍有一定的差距)[13]BMP7基因?yàn)檠芯繉?duì)象,采用PCR擴(kuò)增和測(cè)序獲得豬BMP7基因3′-UTR序列,采用池DNA測(cè)序篩選BMP7基因3′-UTR中的突變位點(diǎn),并分析其多態(tài)性與繁殖性狀的關(guān)系,采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析突變對(duì)BMP7基因3′-UTR活性的影響,以期為解析豬BMP7基因3′-UTR的調(diào)控機(jī)制、挖掘豬分子育種的遺傳標(biāo)記提供參考。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
用于提取基因組DNA的蘇淮豬183份耳組織樣品來自于江蘇省淮陰種豬場(chǎng),詳細(xì)記錄每頭母豬的繁殖性能,包括總產(chǎn)仔數(shù)(the total number of piglets born,TNB)、產(chǎn)活仔數(shù)(number of piglets born alive,NBA)和死胎數(shù)(number of stillborn,NSB)等?；蚪MDNA采取酚/氯仿抽提法提取,提取的基因組DNA保存在-20 ℃冰箱中,用于后續(xù)試驗(yàn)。
1.2 PCR擴(kuò)增、測(cè)序和序列分析
根據(jù)大白豬BMP7基因的3′-UTR序列[14],利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增蘇淮豬BMP7基因3′-UTR序列。上/下游引物對(duì)序列為:5′-GTGTTCCAGGTCCACTTCAT-3′/5′-CCCAACTCCAAGCAGAAA-3′,預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為822 bp。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序見文獻(xiàn)[14],退火溫度為54 ℃。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后,送南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。利用DNAMAN 5.22軟件進(jìn)行序列整理和同源性分析。利用在線網(wǎng)站miRBase(http://www.mirbase.org/)預(yù)測(cè)3′-UTR序列上的miRNA應(yīng)答元件(MRE)。
1.3 突變位點(diǎn)篩選與分型
將20頭蘇淮豬的基因組DNA等量混勻,構(gòu)建DNA池。以池DNA為模板,利用1.2節(jié)中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)合格后,送南京擎科生物科技有限公司測(cè)序,篩選突變位點(diǎn)。利用直接測(cè)序法對(duì)每個(gè)個(gè)體進(jìn)行基因分型。
1.4 關(guān)聯(lián)分析
根據(jù)每個(gè)個(gè)體的基因型數(shù)據(jù),計(jì)算基因型頻率、遺傳多樣性參數(shù),進(jìn)行哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)。采用SAS v9.2軟件中的GLM程序?qū)蛐团c繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。分析模型如下:
yiklmn=μ+HYSi+Pk+Al+Gm+eiklmn,
式中:yiklmn為性狀的觀察值;μ為群體均值;HYSi表示場(chǎng)-年-季的效應(yīng);Pk表示胎次的效應(yīng);Al表示日齡效應(yīng);Gm表示基因型效應(yīng);eiklmn為隨機(jī)殘差。
1.5 載體構(gòu)建
為構(gòu)建豬BMP7基因3′-UTR的雙熒光素酶報(bào)告載體,利用Primer Premier 5.0軟件篩選序列內(nèi)的酶切位點(diǎn),設(shè)計(jì)含有雙XbaⅠ位點(diǎn)的引物。上/下游引物序列分別為:5′-GCTCTAGACAGGCGTGTGAGGGTATTT-3′/5′-GCTCTAGATCCTCTCGCACAGACACAA-3′,預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為276 bp,退火溫度為55 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后,用XbaⅠ核酸內(nèi)切酶于37 ℃分別對(duì)目的片段和pGL3-basic載體(Promega公司)進(jìn)行酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后連接,再轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后涂板,待長(zhǎng)出單克隆菌落后挑菌,測(cè)序確認(rèn)。
1.6 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和熒光素酶活性分析
將本實(shí)驗(yàn)室保存的HEK293T細(xì)胞系置于37 ℃水浴中復(fù)蘇,離心后棄凍存液,加入DMEM培養(yǎng)基(含有15%胎牛血清和20 g·L-1青/鏈霉素)(Gibio公司)并輕輕吹打,重懸細(xì)胞后均勻接種T25瓶,置于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)中37 ℃培養(yǎng)。待細(xì)胞量長(zhǎng)滿約90%時(shí),使用胰蛋白酶消化2 min后,加入等量DMEM培養(yǎng)基并終止消化,轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,離心后棄上清液,再用DMEM培養(yǎng)基重懸,均勻接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞量長(zhǎng)滿約90%時(shí),用Lipofectamine 3000試劑(Invitrogen公司)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后,用裂解液收集12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞,1 200 r·min-1離心1 min。在避光條件下,利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Promega公司)和酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司)對(duì)單個(gè)樣品的螢火蟲熒光和海腎熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算熒光強(qiáng)度相對(duì)值。
1.7 數(shù)據(jù)分析
2 結(jié)果與分析
2.1 蘇淮豬BMP7基因3′-UTR序列分析
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序和序列整理后獲得639 bp的蘇淮豬BMP7基因3′-UTR部分序列,同源性分析發(fā)現(xiàn),蘇淮豬BMP7基因3′-UTR部分序列與杜洛克豬(GenBank ID:XM_005673044.3)、大白豬[14]的同源性均為99.84%,因?yàn)槎怕蹇素i和大白豬相應(yīng)序列完全一致(圖1)。為了解蘇淮豬BMP7基因3′-UTR上的RNA調(diào)節(jié)元件,首先采用在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站miRBase預(yù)測(cè)miRNA應(yīng)答元件(MRE),在蘇淮豬BMP7基因3′-UTR上發(fā)現(xiàn)5個(gè)miRNA(miR-658、miR-1373、miR-6794、miR-1934和miR-3067)的MRE(圖1)。另外,在蘇淮豬BMP7基因3′-UTR上還發(fā)現(xiàn)AU-富集元件(ARE)等RNA調(diào)節(jié)元件和polyA信號(hào)(PAS)。
圖1 蘇淮豬BMP7基因3′-UTR與其他豬種的同源性比對(duì)Fig.1 Identical alignments of BMP7 3′-UTR sequence in Suhuai pig with other pig breeds箭頭表示突變位點(diǎn);下劃線處表示RNA調(diào)節(jié)元件;ARE:AU富集元件;PAS:polyA信號(hào)。The arrow indicates variation site;Underlines indicate RNA regulatory elements;ARE:AU-rich element;PAS:polyA signal.
2.2 蘇淮豬BMP7基因c.*273A>G突變位點(diǎn)多態(tài)性分析
利用池DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)蘇淮豬BMP7基因3′-UTR上的突變位點(diǎn)進(jìn)行篩選,在終止密碼子(TGA)后273 nt處發(fā)現(xiàn)1個(gè)AG套峰,并將該位點(diǎn)命名為c.*273A>G。利用直接測(cè)序法對(duì)蘇淮豬BMP7基因 c.*273A>G 突變位點(diǎn)進(jìn)行基因分型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在蘇淮豬群體中存在3種基因型,即AA、AG和GG型(圖2)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),AG型為優(yōu)勢(shì)基因型,基因型頻率為0.448;A為優(yōu)勢(shì)等位基因,等位基因頻率為0.579(表1)。
圖2 蘇淮豬BMP7基因3′-UTR突變位點(diǎn)的基因型Fig.2 Genotype of mutations locus in the 3′-UTR of Suhuai pig BMP7 gene箭頭顯示為突變位點(diǎn)。The arrows indicate mutation locus.
表1 蘇淮豬BMP7基因c.*273A>G突變位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率Table 1 Genotype and allele frequencies of c.*273A>G mutation of BMP7 gene in Suhuai pigs
2.3 蘇淮豬BMP7基因c.*273A>G突變位點(diǎn)遺傳多樣分析
對(duì)蘇淮豬BMP7基因c.*273A>G突變位點(diǎn)的遺傳多樣進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘇淮豬群體中BMP7基因c.*273A>G突變位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)為0.488,為中度多態(tài)性位點(diǎn)(0.25
2.4 蘇淮豬BMP7基因c.*273A>G突變位點(diǎn)多態(tài)性與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析
采用線性模型對(duì)c.*273A>G突變位點(diǎn)多態(tài)性與3個(gè)繁殖性狀(總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)和死胎數(shù))進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。從結(jié)果(表2)可以看出,AA型母豬的初產(chǎn)產(chǎn)仔數(shù)(10.98頭)比GG型個(gè)體(10.15頭)多0.83頭,且差異顯著(P<0.05);其他胎次各基因型間繁殖性狀均差異不顯著(P>0.05)。
表2 BMP7基因c.*273A>G突變位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)蘇淮豬繁殖性狀的影響Table 2 Effects of c.*273A>G mutation polymorphism of BMP7 on reproductive traits of Suhuai pigs
2.5 c.*273A>G突變位點(diǎn)不同等位型BMP7基因3′-UTR報(bào)告載體的構(gòu)建
為了解c.*273A>G突變對(duì)豬BMP7基因3′-UTR活性的影響,本試驗(yàn)擬構(gòu)建2種不同等位型豬BMP7基因3′-UTR熒光素酶報(bào)告載體。首先,以2種純合型(AA基因型和GG基因型)個(gè)體基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖3-A)。其次,將擴(kuò)增產(chǎn)物與pGL3-basic載體同時(shí)用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ進(jìn)行酶切、純化后連接。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后,成功獲得c.*273A>G位點(diǎn)的2種等位型BMP7基因3′-UTR熒光素酶報(bào)告載體,即pGL3-A和pGL3-G(圖3-B)。
圖3 豬BMP7 3′-UTR雙熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建Fig.3 Construction of dual luciferase reporter vector of porcine BMP7 3′-UTR A. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物PCR amplification products;B. 載體構(gòu)建示意圖Schematic diagram of vector construction.M. DAN標(biāo)準(zhǔn)品DNA marker;1. AA基因型BMP7 3′-UTR 擴(kuò)增片段Fragments amplified of BMP7 3′-UTR in AA genotype;2. GG基因型BMP7 3′-UTR 擴(kuò)增片段Fragments amplified of BMP7 3′-UTR in GG genotype.
2.6 c.*273A>G 突變對(duì)豬BMP7基因3′-UTR活性的影響
將空載pGL3-basic和pGL3-A、pGL3-G分別轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中,檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示,與對(duì)照組(空載)相比,2個(gè)BMP7基因3′-UTR報(bào)告載體pGL3-A和pGL3-G的熒光素酶活性均極顯著升高(P<0.01);pGL3-A載體的熒光素酶活性高于pGL3-G載體,但兩者差異不顯著(P=0.113)(圖4)。A等位型BMP7基因3′-UTR活性高于G等位型,這與AA型母豬總產(chǎn)仔數(shù)(TNB)高于GG型母豬(所有胎次和初產(chǎn)每胎分別高0.30頭和0.83頭,表2)的趨勢(shì)是一致的。
圖4 c.*273A>G突變位點(diǎn)不同等位基因型BMP7基因 3′-UTR報(bào)告載體的熒光素酶活性分析Fig.4 Luciferase activity assay of different allelic BMP7 3′-UTR reporter vector at mutation c.*273A>G**P<0.01.
3 討論
BMP7是雌性生殖必需的細(xì)胞因子,其在卵巢組織中的表達(dá)水平和基因多態(tài)性均與家畜的繁殖力有關(guān)[5,8-9]。在高繁殖力綿羊品種GMM的卵巢組織中BMP7mRNA水平顯著高于單胎綿羊品種Malpura[8]。在GMM綿羊中,攜帶高繁殖力基因FecB的母羊卵巢組織中BMP7mRNA水平顯著高于不攜帶FecB基因的個(gè)體[8]。在我國(guó)高繁殖力綿羊品種湖羊卵巢組織中,多羔母羊卵泡中BMP7mRNA水平顯著高于單羔個(gè)體[9]。高通量測(cè)序證實(shí)BMP7是影響湖羊高繁殖力性狀的候選基因[12]。BMP7基因啟動(dòng)子區(qū)g.58171886A>C突變位點(diǎn)多態(tài)性與我國(guó)著名的高繁殖力綿羊品種小尾寒羊的產(chǎn)羔數(shù)性狀顯著關(guān)聯(lián),其中CC型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AC型和AA型[15]。經(jīng)高通量技術(shù)發(fā)現(xiàn)BMP7是母豬繁殖性狀(如排卵數(shù)、總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)等)的重要候選基因[11-12]。在大白豬、長(zhǎng)白豬和杜洛克豬中,BMP7基因第3內(nèi)含子的g.35161T>C位點(diǎn)多態(tài)性與繁殖性狀(如產(chǎn)活仔數(shù)、出生窩重和21 d窩重)顯著關(guān)聯(lián)[16]。本文利用池DNA測(cè)序技術(shù)在蘇淮豬BMP7基因的3′-UTR中檢測(cè)到1個(gè)突變位點(diǎn)即c.*273A>G,發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性與蘇淮豬繁殖性狀顯著關(guān)聯(lián),說明BMP7基因是蘇淮豬繁殖性狀的候選基因。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),這個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性與大白豬的出生窩重顯著關(guān)聯(lián),且AA型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)比GG型個(gè)體平均每胎多0.61頭[14],與本文在蘇淮豬中不同基因型個(gè)體中產(chǎn)仔數(shù)的趨勢(shì)是一致的。這些結(jié)果表明,BMP7基因是母豬繁殖性狀的重要候選基因。
編碼基因3′-UTR上的堿基突變會(huì)通過改變mRNA穩(wěn)定性、翻譯、定位和多聚腺苷酸化等影響宿主基因的功能[17-19]。研究發(fā)現(xiàn),3′-UTR的rs2229611位點(diǎn)突變可以降低人肝癌細(xì)胞中葡萄糖6-磷酸酶催化亞基1(G6PC1)mRNA的穩(wěn)定性,并下調(diào)G6PC1基因的表達(dá)水平[17]。喉鱗癌相關(guān)基因SH3GL2BMP73′-UTR中SNP rs1049430的G等位基因與人喉鱗癌細(xì)胞中SH3GL2mRNA穩(wěn)定性下降、蛋白低表達(dá)及失活相關(guān)[20]。PD-L1(programmed death-ligand 1)是公認(rèn)的腫瘤免疫治療效果的預(yù)測(cè)標(biāo)志物,其3′-UTR上rs2297136位點(diǎn)多態(tài)性與胃癌患者血液中PD-L1蛋白表達(dá)水平以及患者的預(yù)后密切相關(guān)[21]。在人乳腺癌細(xì)胞中,RYR3(ryanodine receptor 3)基因3′-UTR的miR-367結(jié)合位點(diǎn)存在1個(gè)單堿基突變位點(diǎn)rs1044129A>G,該位點(diǎn)突變可影響miR-367與RYR3基因3′-UTR的結(jié)合親和力,進(jìn)而影響RYR3基因的表達(dá)[22]。本研究結(jié)果表明,c.*273A>G突變可使豬BMP7基因3′-UTR活性下降,雖未達(dá)到顯著水平,但這與AA型母豬總產(chǎn)仔數(shù)高于GG型母豬的趨勢(shì)是一致的。Liu等[23]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂周期蛋白42(CDC42)基因3′-UTR 上rs55618224T>C突變影響胎盤中CDC42基因3′-UTR活性和mRNA水平,進(jìn)而影響大白豬的總產(chǎn)仔數(shù)性狀。
總之,本文獲得蘇淮豬BMP7基因3′-UTR部分序列,發(fā)現(xiàn)其在不同豬種間的同源性較高,并在蘇淮豬BMP7基因3′-UTR中發(fā)現(xiàn)1個(gè)單核苷酸突變位點(diǎn)即c.*273A>G,其多態(tài)性與蘇淮豬產(chǎn)仔數(shù)性狀顯著關(guān)聯(lián),說明BMP7是蘇淮豬繁殖性狀的候選基因。A等位型BMP7基因3′-UTR活性高于G等位型,說明c.*273A>G突變部分通過影響B(tài)MP7基因3′-UTR活性影響蘇淮母豬的繁殖性狀。
