磷酸化修飾對山豆根多糖抗Ⅰ型鴨肝炎病毒效果的影響

何淼,張寶康,粟靈琳,杜紅旭,明珂,白景英,劉家國,王德云,武毅

(南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院/教育部動物健康與食品安全國際合作聯(lián)合實驗室,江蘇 南京 210095)

鴨病毒性肝炎(duck viral hepatitis,DVH)是由鴨肝炎病毒(duck hepatitis virus,DHV)引起的高傳染性、高致死率的烈性傳染病。DHV-1被認為是分布最廣泛、危害最大的一類[1]。最近根據(jù)序列分析將其歸為小核糖核酸病毒科的一員[2],并重新命名為鴨甲型肝炎病毒Ⅰ型(DHAV-1)。DHAV-1是一種RNA病毒,沒有包膜,在胞質(zhì)中繁殖,病毒顆粒具有很強的抗性,在自然條件下很難清除[3],一旦感染,雛鴨死亡率可達100%,對全球養(yǎng)鴨業(yè)產(chǎn)生巨大危害?？祻网喲咫m有一定保護作用,但需要逐只注射,使用不便、人工成本高、應激大,限制其臨床應用,因此,鴨病毒性肝炎的治療急需替代藥物。

根據(jù)中醫(yī)理論,山豆根具有清熱、解毒、保肝作用,其主要活性成分為生物堿、多糖。研究表明山豆根多糖(Bush Sophora Root polysaccharide,BSRPS)可以有效清除氧自由基,調(diào)節(jié)細胞因子和調(diào)節(jié)免疫[4-5]。所有這些功能都有助于提高感染DHAV-1的雛鴨存活率。而化學修飾則提高多糖的這些生物活性,如增強其免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等活性[6-8]。我們前期的研究表明BSRPS具有良好的抗DHAV-1病毒作用[5],硫酸化修飾還可以進一步提高BSRPS的抗病毒和抗炎作用。但是,硫酸化修飾條件要求高、污染大、危險性高。我們發(fā)明的甙糖類成分磷酸化修飾法[9]條件溫和、環(huán)保,修飾物活性高。但BSRPS磷酸化修飾是否可以獲得相似的結(jié)果,尚未見報道。

病毒感染可誘導產(chǎn)生大量自由基[10]。過量自由基導致的氧化應激損傷被認為是RNA病毒感染引起的一種主要的病理損傷機制[11-12]。我們在前期研究中也發(fā)現(xiàn)DHAV-1感染可產(chǎn)生大量自由基,所以清除多余自由基可有效緩解肝損傷[13]。氧化還原平衡存在于組織和細胞中,由抗氧化酶系統(tǒng),包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和大量抗氧化物質(zhì),如谷胱甘肽(GSH)組成,這種平衡是許多能量代謝乃至生命活動的基礎(chǔ)。一旦平衡被打破,如酶系統(tǒng)活性下降、抗氧化物質(zhì)消耗殆盡、多余氧自由基的產(chǎn)生和積累等,會導致脂質(zhì)、DNA和蛋白質(zhì)[14]的過氧化。這些都說明消除氧自由基對減輕DHAV-1所致的肝損傷至關(guān)重要[15]。

因此,本試驗采用水提醇沉法制備BSRPS,采用多聚磷酸鹽法對BSRPS進行修飾,經(jīng)體內(nèi)、外試驗研究BSRPS和pBSRPS的抗DHAV-1活性和對DHAV-1感染雛鴨的保護作用和雛鴨體內(nèi)氧化損傷變化,以評價其治療效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

RNA提取試劑盒購于AngleGene公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒(R223-01)和Real-time qPCR試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司。SOD、MDA、CAT檢測試劑盒購于Solarbio,GSH和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)檢測試劑盒購于南京建成生物技術(shù)公司。

四甲基偶氮唑藍(MTT),購于Solarbio公司;DMEM(Gibco公司),按說明書用去離子水配制,0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,加入100 IU·mL-1青霉素、100 IU·mL-1鏈霉素、0.75 mg·mL-1谷氨酰胺及10%(完全培養(yǎng)基)或1%(維持培養(yǎng)基,MM)小牛血清(杭州四季青公司),以56 g·L-1NaHCO3調(diào)pH值至7.4,4 ℃保存;正丁醇、乙醇、三偏磷酸鈉、三聚磷酸鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純,溴化鉀為國產(chǎn)光譜純。

Nicolet FT-IR 200型傅里葉紅外變換光譜儀、Applied Biosystems實時熒光定量PCR儀、Multiskan FC型多功能酶標儀均購自Thermoscientific(美國);UnicelDxC 600 Synchron全自動生化分析儀購自Beckmancoulter(美國)。

用于攻毒試驗和抗病毒檢測的DHAV-1(LQ2株)由山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所提供,并通過接種鴨胚單層肝細胞(DEH)進行增殖。采用Reed-Mueech法[16]測定病毒液的TCID50。用維持培養(yǎng)基(MM)將其稀釋成 5×10-2(50 TCID50·mL-1),用于抗病毒檢測。

1.2 BSRPS和pBSRPS的制備

1.2.1 BSRPS的提取和pBSRPS的制備采用水提醇沉法[17]提取山豆根粗多糖,用Sevage方法[18]對BSRPS進行純化后,用苯酚-硫酸法[19]測定多糖含量為89.56%。采用多聚磷酸鹽法[20]制備pBSRPS后,用苯酚-硫酸法測定多糖含量為60.42%,鉬藍比色法測定磷酸鹽含量為37.43%。

1.2.2 紅外光譜分析采用溴化鉀壓片法測定山豆根及其磷酸化產(chǎn)物在400～4 000 cm-1處的FT-IR光譜[7]。將100 mg溴化鉀(KBr)研磨、壓片后測得光譜背景,再將1.5 mg樣品與100 mg KBr混合研磨、壓片后再次測量光譜。

1.3 BSRPS和pBSRPS體外抗DHAV-1活性的比較

采用文獻[21]的方法制備鴨胚單層肝臟細胞(DEH)于96孔板中,設置細胞對照組(僅加入維持培養(yǎng)基)、病毒對照組和加藥組。將DHAV-1病毒100 μL加入到單層細胞中,放入CO2細胞培養(yǎng)箱2 h,使病毒吸附細胞,后用D-Hank’s溶液洗凈后備用。前期的研究以倍比稀釋的方式用MTT法測得BSRPS和pBSRPS的最大安全濃度分別為2 000和15.63 μg·mL-1,現(xiàn)將山豆根多糖及其磷酸化修飾物分別從藥物的最大安全濃度2 000和15.63 μg·mL-1再次以倍比稀釋加入藥物組中;細胞對照組和病毒對照組僅加入相同體積的MM。每組6個重復。共同培養(yǎng)72 h后用MTT法[22]測定細胞活力。病毒抑制率計算公式[23]:

病毒抑制率=(A藥物+病毒-A病毒對照)/(A空白對照-A病毒對照)×100%。

1.4 BSRPS和pBSRPS抗DHAV-1增殖作用比較

將制備好的鴨胚單層肝臟細胞接種于24孔板中,設置細胞對照組(CC)、病毒對照組(VC)和加藥組(BSRPS組和pBSRPS組)。細胞對照組加入1% DMEM,病毒對照組和加藥組加入用1%DMEM稀釋好的DHAV-1病毒400 μL,于 37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1.5 h后棄去培養(yǎng)液,用D-Hank’s溶液沖洗。將山豆根多糖及其磷酸化修飾物分別稀釋至最有效抗病毒濃度2 000和15.63 μg·mL-1后加入試驗組細胞中,每孔400 μL;細胞對照組和病毒對照組僅加入相同體積的MM。每組設置4個重復孔。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,棄去培養(yǎng)液,收集細胞,提取總RNA供病毒吸附分析使用。再培養(yǎng)12 h后棄去培養(yǎng)液,收集細胞,提取總RNA供病毒復制分析使用。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,吸取100 μL上清液,與100 μL DEH細胞混合(作為內(nèi)參),提取總RNA供病毒釋放分析用[24]。

參照文獻[25]設計的引物,采用RNApure總RNA提取試劑盒(Angle Gene)提取并確保提取后的總RNA濃度(D260/D280值)為1.8～2.1。反轉(zhuǎn)錄根據(jù)HiScript@Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒(Vazyme)說明書,按照50 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s的過程進行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應按照ChanQTM SYBR@qPCR Master Mix試劑盒(Vazyme)說明書進行操作。

1.5 BSRPS和pBSRPS對DHAV-1感染雛鴨的治療作用

1.5.1 動物分組處理和樣本采集240只1日齡未免疫櫻桃谷鴨,飼養(yǎng)至4～6日齡時,隨機均分為4組:BSRPS、pBSRPS、VC和空白對照(BC)組(單獨飼養(yǎng)),每組60只。BSRPS、pBSRPS、VC組每只分別肌肉注射0.2 mL DHAV-1病毒。在攻毒后,BSRPS組和pBSRPS組分別按每只5和3 mg·d-1將藥物混于飲水中給藥,連續(xù)給藥3 d。分別在攻毒后4、8和54 h時每組隨機抓取5只雛鴨,頸動脈采血4 mL(提前混有肝素鈉)并取肝臟組織約10 g,離心分離血清。肝臟組織5 g保存在凍存管并置于液氮中用于檢測抗氧化酶活性;另一部分組織約5 g置于多聚甲醛中固定,用于HE染色和觀察病理變化。每天觀察臨床癥狀并記錄死亡數(shù),連續(xù)觀察5 d。每當雛鴨死亡時立即解剖并觀察是否有明顯著病理變化。

1.5.2 動態(tài)存活率計算各組在最終統(tǒng)計存活率時剔除采樣樣本(每組共15只)。存活率=存活數(shù)/各組有效樣本數(shù)×100%。

1.5.3 肝損傷生化指標測定血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、谷氨酸-丙酮酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、高密度脂蛋白(HDLC)、低密度脂蛋白(LDLC)、總膽紅素(T-Bili)、總膽固醇(T-CHO)和總甘油三酯(TG)含量的測定采用全自動生化分析儀進行測定。

1.5.4 肝臟過氧化損傷評價指標的檢測GSH、MDA、SOD、CAT、iNOS活性或含量的檢測分別采用GSH、MDA、SOD、CAT、iNOS試劑盒。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 BSRPS磷酸化修飾結(jié)果鑒定

圖1 BSRPS和pBSRPS的紅外光譜分析結(jié)果Fig.1 Infrared spectrum analysis results of BSRPS and pBSRPS

2.2 BSRPS和pBSRPS的體外抗DHAV-1感染活性

各種藥物處理后,DEH被DHAV-1感染后的A570值和病毒抑制率見表1。VC組A570值均顯著低于CC組(P<0.05)。而BSRPS和pBSRPS處理后A570值顯著升高(P<0.05)。pBSRPS和BSRPS分別在15.63和500 μg·mL-1時的病毒抑制率最高,分別為57.87%和53.66%,前者稍高于后者。

表1 各藥物處理后鴨胚單層肝細胞(DEH)的A570值及病毒抑制率Table 1 A570 value and virus inhibition rate of DEH after each drug treatment

2.3 BSRPS及pBSRPS體外抗DHAV-1增殖作用效果比較

將VC組的病毒基因表達量設置為1,CC組未檢測到DHAV-1基因的表達,故其相對表達量為0。BSRPS和pBSRPS對DHAV-1吸附的影響結(jié)果如圖2-A所示,BSRPS和pBSRPS組的DHAV-1基因相對表達量分別為0.992 6和0.948 4,均與VC組無顯著差異(P>0.05),表示二者對病毒的吸附均無顯著作用。BSRPS和pBSRPS抑制病毒復制的結(jié)果如圖2-B所示。BSRPS和pBSRPS組DHAV-1基因相對表達量分別為0.546 1和0.316 1,二者均顯著低于VC組(P<0.05),pBSRPS組也顯著低于BSRPS組(P<0.05),說明2種藥物均可以顯著抑制病毒復制,pBSRPS作用優(yōu)于BSRPS。BSRPS和pBSRPS對病毒釋放的影響見圖2-C,BSRPS和pBSRPS組的病毒基因相對表達量均顯著低于VC組。pBSRPS組的病毒基因表達量略低于BSRPS組(P>0.05)。

圖2 BSRPS和pBSRPS的抗DHAV-1增殖作用Fig.2 Anti-DHAV-1 proliferation effects of BSRPS and pBSRPS A. 對DHAV-1吸附的影響Effects on DHAV-1 adsorption;B. 對DHAV-1復制的影響Effects on DHAV-1 replication;C. 對DHAV-1釋放的影響Effects on DHAV-1 release.不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。Different superscript letters are significantly different(P<0.05)among different treatments.

2.4 BSRPS和pBSRPS對DHAV-1感染雛鴨的治療效果比較

由圖3可見:VC組雛鴨84 h全部死亡,空白對照(BC)組未發(fā)現(xiàn)雛鴨死亡。BC、VC、BSRPS和pBSRPS組雛鴨的最終生存率分別為100.0%、0%、26.7%、37.8%,2個藥物治療組的最終生存率明顯高于VC組,pBSRPS組較BSRPS組高11百分點。2個藥物組各時間點雛鴨存活率趨勢與VC組相似:第1個死亡高峰出現(xiàn)在24 h,然后下降。VC組的死亡高峰期為24～48 h,而藥物組的死亡數(shù)量較少。

圖3 BSRPS和pBSRPS對DHAV-1感染后 各組雛鴨存活率的影響Fig.3 Effect of BSRPS and pBSRPS on survival rate of ducklings infected with DHAV-1

2.5 BSRPS和pBSRPS對DHAV-1感染雛鴨肝臟病理變化的影響

由各組肝臟H&E染色結(jié)果(圖4)可見:BC組肝臟未見病理改變,脊索清晰整齊,未見炎癥滲出或壞死;VC組可見大范圍淋巴細胞浸潤(箭頭標記處),伴有脊髓紊亂,肝細胞壞死嚴重;BSRPS組和pBSRPS組僅存在部分淋巴細胞浸潤和壞死,pBSRPS組病變較BSRPS組輕。

圖4 BSRPS和pBSRPS對DHAV-1感染后各組肝臟病理變化的影響Fig.4 Effect of BSRPS and pBSRPS on pathological changes of liver in each group infected with DHAV-1箭頭指示淋巴細胞浸潤。The arrows indicate the lymphocylic infiltration.

2.6 BSRPS和pBSRPS對DHAV-1感染雛鴨肝損傷評價指標的影響

如表2所示:血清AST活性各時間點VC組均顯著高于其余各組(P<0.05,4 h BSRPS組除外)。在4和54 h時BSRPS組顯著高于pBSRPS組和BC組(P<0.05),后2組間差異不顯著;8 h時,3組間沒有顯著差異。血清ALT活性在8、54 h時VC組顯著高于其余各組(P<0.05);此變化趨勢與同時間點AST的活性趨勢相同。

表2 各組不同時間點肝損傷指標的變化Table 2 Changes of liver injury indexes in each group at different sampling time points

血清TG、T-CHO、HDLC、LDLC是血漿中血脂成分。各時間點VC組TG含量均顯著高于同期其余各組,其余3組間同時間點內(nèi)均無顯著差異(54 h時BSRPS組顯著高于BC和pBSRPS除外)。T-CHO含量,4 h時各組間沒有顯著差異;8 h時,除BC組顯著高于其余3組外,其余各組間無顯著差異;54 h時,VC組顯著低于BC組和pBSRPS組,其余各組間無顯著差異。HDLC含量,各組間各時間的趨勢基本一致;BC組各時間點均顯著高于其他3組;VC組均顯著低于pBSRPS組,低于BSRPS組。LDLC含量,4 h時,各組間無顯著差異;8和54 h,VC組均顯著高于其余各組,除8 h時BC組顯著低于BSRPS組和pBSRPS組外,其余未見顯著差異。T-Bili含量,4 h時各組間沒有顯著差異;8和54 h時,VC組均顯著高于同時間點其余3組(8 h時BSRPS除外),54 h時BSRPS組顯著高于BC組和pBSRPS組,其余未見顯著差異。

圖5 不同時間點肝組織氧化損傷評價指標變化Fig.5 Changes of evaluation indexes of liver tissue oxidative damage at different sampling time points

2.7 BSRPS和pBSRPS對DHAV-1感染雛鴨肝臟過氧化損傷評價指標的影響

如圖4所示:VC組GSH含量在各時間點均最低,4 h時顯著低于BC組和pBSRPS組,8和54 h時顯著低于其余各組;8和54 h時BSRPS組顯著低于BC組;pBSRPS組在各時間點與BC組均無差異。4 h時各組肝臟組織CAT活性無顯著差異;8和54 h時,VC組均顯著低于其余各組;8 h時BSRPS組與pBSRPS組接近并均顯著低于BC組,54 h時BSRPS組顯著低于pBSRPS組和BC組,BSRPS和pBSRPS組間無顯著差異。各時間點VC組SOD活性除在4 h時與BC組無顯著差異外,在8和54 h均顯著低于其余各組;4和8 h時,BC組、BSRPS組與pBSRPS組3組間無顯著差異;54 h時,pBSRPS組與BC組接近,并均顯著高于BSRPS組。MDA與iNOS的變化趨勢基本接近,4 h時各組間無顯著差異;8和54 h時VC組均顯著高于其他各組,其次是BSRPS組,均顯著高于BC組,pBSRPS組則與BC組均無顯著差異。

3 討論

鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒引起的一種急性傳染病,臨床表現(xiàn)為發(fā)病急、死亡快。病死雛鴨出現(xiàn)明顯的角弓反張,肝臟上有瘀斑和紫癜,是一種傳染性很強的疾病,給全球的養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的損失。而中藥的抗病毒作用在這一領(lǐng)域具有廣闊的應用前景[27-28]。

在本研究中,BSRPS在體外對病毒復制和釋放有較好的抑制作用,BSRPS治療后的雛鴨成活率也明顯提高,肝臟損傷和氧化損傷也明顯減輕。表明BSPRS在體內(nèi)外均具有抗病毒和抗氧化作用。但BSRPS在應用中存在許多問題,如溶液穩(wěn)定性差、應用濃度高、味苦等。許多研究報道,多糖的化學修飾可以提高其抗病毒和抗氧化活性。BSRPS和硫酸化山豆根多糖(sBSRPS)具有良好的抗DHAV-1活性,且sBSRPS比BSRPS具有更好的抗DHAV-1活性,說明多糖的修飾可以提高其生物活性[25,29]。但硫酸化修飾環(huán)境污染大,操作危險性高。而磷酸化修飾則反應緩和、無明顯污染,操作安全。

采用MTT法檢測藥物體外抗病毒活性,570 nm處吸光值越高,說明細胞活性越高,藥物抗病毒效果越好[30],病毒抑制率則直接反映藥物的抗病毒作用。BSRPS和pBSRPS在藥物有效濃度范圍內(nèi),病毒抑制率接近。而且2種藥物對DHAV-1復制均有顯著的抑制效果,pBSRPS作用效果優(yōu)于BSRPS;2種藥物對病毒釋放的抑制作用接近,說明pBSRPS具有較強的抗病毒復制能力。這可能是由于引入酸離子,增加了藥物的活性,增強了抗病毒復制能力[30]。而且磷酸化可以提高藥物的溶解穩(wěn)定性,減少沉淀和藥物的應用濃度和劑量。

體內(nèi)試驗是最終反映藥物生物活性的最佳和最終方式。通過雛鴨感染治療試驗,發(fā)現(xiàn)BSRPS和pBSRPS均顯著提高了感染雛鴨的存活率,且pBSRPS效果優(yōu)于BSRPS 11百分點,這個效果與本實驗室前期采用硫酸化修飾法獲得的sBSRPS基本一致[25]。H&E染色顯示,2種藥物均可以緩解被感染雛鴨肝臟損傷。為了進一步評價,我們檢測了肝損傷評價的生物標志物,包括ALT、AST、TG、T-CHO、HDLC、LDLC和T-Bili。血清總甘油三酯、總膽固醇和高密度脂蛋白是肝臟脂肪代謝的重要指標,反映肝臟的健康狀況[31]。肝臟也是內(nèi)源性膽固醇合成的主要器官,肝臟損傷會降低其合成量。HDLC的合成和LDLC的代謝也主要發(fā)生在肝臟,肝臟損傷可導致這2種成分相反的變化趨勢。試驗結(jié)果顯示,VC組的ALT、AST、TG、LDLC和T-bili均明顯高于BC組,HDLC和T-CHO則顯著低于BC組,而BSRPS組和pBSRPS組上述變化明顯減輕,尤其是pBSRPS組,各指標水平基本與BC組接近。提示DHAV-1感染造成了雛鴨明顯肝臟損傷,而且從感染初期就出現(xiàn);而BSRPS和pBSRPS均可有效緩減這種損傷,且pBSRPS的作用明顯優(yōu)于BSRPS,尤其在恢復期更明顯。

肝臟作為機體最大的代謝器官,代謝活動旺盛,正常生理活動下即有少量ROS產(chǎn)生,可被機體氧化防御系統(tǒng)所清除,但是DHAV-1感染后,會影響細胞內(nèi)代謝狀況,抑制線粒體呼吸鏈上的電子傳遞,使電子漏出,形成大量ROS。ROS一方面可以作為刺激信號激活雛鴨免疫系統(tǒng),激活吞噬細胞以增強機體的抗病毒能力;另一方面,病毒在胞漿中繁殖,持續(xù)感染產(chǎn)生的ROS可以作為殺傷因子,對病毒有直接損傷作用。但是,過多的ROS會增加抗氧化防御系統(tǒng)的壓力,破壞氧化還原平衡,進而損傷細胞結(jié)構(gòu)和功能,引起雛鴨嚴重的氧化應激并刺激炎性因子的釋放[10],抑制細胞凋亡,造成肝臟炎癥,創(chuàng)造出更適合病毒增殖的環(huán)境,這也成為DHAV-1感染雛鴨的一種主要致病機制[13]。本試驗也獲得相似結(jié)果。甚至在感染初期(4 h),雛鴨體內(nèi)SOD活性和GSH含量即顯著降低。揭示在病毒感染的早期階段,由于病毒進入和侵害機體,肝臟抗氧化物質(zhì)首先被消耗和過氧化物累積。而經(jīng)BSRPS和pBSRPS治療后,上述變化均不明顯,說明2種藥物可以有效減少抗氧化物質(zhì)消耗和過氧化物的累積。隨著病毒在體內(nèi)的逐漸增殖,過氧化物積累逐漸增多,抗氧化物質(zhì)逐漸消耗而進一步降低。我們的試驗結(jié)果顯示,到8 h時,各組雛鴨體內(nèi)病毒基因拷貝數(shù)增至最高水平[25],MDA含量和iNOS活性均逐步上升,血清SOD、CAT活性和GSH含量均進一步降低,以VC組變化最明顯,2個藥物組尤其是pBSRPS組變化基本與BC組水平一致,說明DHAV-1感染引起的肝損傷,與病毒增殖有關(guān),2種藥物尤其是磷酸化修飾物具有明顯的抑制病毒增殖,從而減輕雛鴨肝損傷作用。到恢復期(54 h),各組血液病毒基因拷貝數(shù)均顯著降低[32],但是MDA含量和iNOS活性均沒有下降,VC組的MDA含量甚至較8 h更高;而SOD、CAT活性和GSH含量與8 h相比有不同程度下降,2個藥物組尤其是pBSRPS組的上述變化明顯輕于VC組,甚至與BC組接近。這可能是在感染前期由于病毒大量增殖從而累積大量的氧化物質(zhì)和消耗大量的抗氧化物,造成機體不可逆損傷,因此在感染24和48 h出現(xiàn)死亡高峰,到54 h時尚未來得及修復,這種變化,也進一步印證我們前面的推斷。而 2個藥物組,尤其是磷酸化修飾物組出現(xiàn)明顯較輕的變化,說明其確實具有較好的抗DHAV-1感染作用和減輕肝損傷效果。

病毒是一種嚴格意義上的細胞寄生生物。它沒有酶系統(tǒng),只能依靠宿主細胞的代謝系統(tǒng)和能量來合成自己的蛋白質(zhì)和核酸,完成自己的生命過程。中藥的抗病毒作用主要分為直接抗病毒作用和間接抗病毒作用。中藥的直接抗病毒作用包括抗病毒、抗感染和抑制繁殖,而多糖及其磷酸化修飾對病毒的復制和釋放具有明顯的抑制作用。病毒在細胞內(nèi)的復制需要消耗大量的物質(zhì)和能量,不可避免地會對宿主細胞的新陳代謝產(chǎn)生不利影響。在我們的研究中也發(fā)現(xiàn)磷酸化修飾提高了BSPRS對病毒復制的抑制能力,因此BSRPS和pBSRPS也可能通過上述間接抗病毒途徑對病毒起到抑制作用,即調(diào)節(jié)代謝、減輕肝臟和氧化損傷。細胞內(nèi)存在復雜的代謝過程,包括線粒體能量代謝、自噬和凋亡。病毒對這些過程的任何影響都會引起細胞代謝紊亂,導致進一步的氧化損傷甚至死亡。因此,多糖對DHAV-1感染的治療作用及機制仍需進一步研究。