崇明擬異小桿線蟲fak基因的功能鑒定

郭丹丹,包浩然,竇振國,張克云

(南京農業(yè)大學生命科學學院,江蘇 南京 210095)

昆蟲病原線蟲(entomopathogenic nematode,EPN)是一種腸道內攜帶共生菌的昆蟲寄生性線蟲,對許多經(jīng)濟害蟲都有良好的防治效果[1-2],且抗蟲譜廣、殺蟲效率高、對環(huán)境友好,因此受到廣泛的關注和研究,有著較好的發(fā)展前景[3-4]。然而,因在實際使用過程中存在諸多生物和非生物的影響,導致EPN的殺蟲效率受到制約,其中,生長發(fā)育成為制約其商品化應用的重要因素[5]。

崇明擬異小桿線蟲(Heterorhabditidoideschongmingensis)DZ0503CMFT(DZ)是小桿科昆蟲病原線蟲的新屬新種,與其共生的細菌菌株DZ0503SBS1T(S1)是Serratianematodephila的模式菌株[6-7]。DZ線蟲與S1及非自身共生菌S.nematodiphilaDR186(186)共培養(yǎng)時,存在顯著差異[8-9]。對前期構建的DGE文庫分析發(fā)現(xiàn),較多的差異表達基因與DZ線蟲的細胞增殖、分化、遷移及黏附等行為密切相關[9]。這些差異表達基因大都集中在黏著斑激酶通路(focal adhesion kinase pathway,fakpathway)[10]、細胞外基質通路(extracellular matrix pathway,ECM pathway)[11]、肌動蛋白細胞骨架調節(jié)(regulation of actin cytoskeleton)[12]、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)[13]及Wnt[14]等通路。其中,fak通過與整合素配體的結合實現(xiàn)酪氨酸位點的磷酸化而激活介導多條信號通路,整合來自整合素、生長因子以及機械刺激等的信號,還參與調節(jié)包括細胞運動、細胞骨架的重組、細胞生長或死亡及基因表達等生長發(fā)育所必需的過程,因此顯得尤為重要[15-17]。本研究以DZ線蟲中的fak基因作為研究對象,構建了RNAi干擾載體,檢測干擾的效果并統(tǒng)計干擾后的表型變化,了解該基因在DZ線蟲生長發(fā)育方面的作用,對fak基因在EPN中的首次研究提供參考,也為提高EPN的生物防治提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生型DZ(DZ0503CMFT)線蟲是本實驗室于上海崇明島采集鑒定的EPN新種Heterorhabditidoideschongmingensis的模式品系,采用大蠟螟(Galleriamellonella)老熟幼蟲進行傳代培養(yǎng),其共生菌株是SerratianematodephilaDZ0503SBS1T[6-7]。HT115(DE3)菌株購自美國線蟲遺傳中心,L4440質粒購自中國質粒載體菌株細胞株基因保藏中心-質?？茖W實驗室。

Trizol總RNA提取試劑、限制性內切酶PstⅠ和Hind Ⅲ、T-Vector pMD19(Simple)、SolutionⅠ、普通DNATaq酶預混液(2×TaqPCR Master Mix)、DL2000TMDNA Marker、DL5000TMDNA Marker、T4DNA連接酶等均購自大連TaKaRa公司;SuperQuick RT MasterMix、UltraSYBR Mixture、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒抽提試劑盒等均購自康為世紀生物公司;異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(Amp)、四環(huán)素(Tet)等均購自索萊寶;國產分析純試劑氯仿、無水乙醇、異丙醇、硫柳汞鈉、膽固醇等均購自南京杰汶達試劑生物公司。

1.2 基因克隆及氨基酸序列分析

在前期構建的DZ線蟲的DGE文庫中,選取與信號傳導相關的黏著斑激酶通路中的fak基因作為研究對象。取約500條DZ線蟲[5,8],用RNAiso Plus提取其總RNA,并用HiFiScript cDNA合成試劑盒反轉錄為cDNA,以此為模板擴增fak基因全序列。使用Primer Premier 5.0設計的fak基因全序列引物(fak全序列F:5′-ATCCGAGTCCGTCTGGTTGC-3′;fak全序列R:5′-AGCTCATAGGCCGATTGTGG-3′)、cDNA模板、2×Prime STAR Max DNA Polymerase、RNase-FreeWater進行擴增,PCR程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 10 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,循環(huán)35次;72 ℃ 10 min。

使用NCBI數(shù)據(jù)庫對fak的基因序列進行開放閱讀框(open reading frame,ORF)預測,并對其蛋白序列的保守區(qū)進行預測和分析。在NCBI數(shù)據(jù)庫中對FAK蛋白進行BLAST分析,選用進化關系最近的19個同源蛋白序列,利用MEGA 6.0進行序列比對,并采用鄰近法(Neighbor-joining method,NJ)(1 000次抽樣分析)構建系統(tǒng)進化樹。

1.3 RNAi載體的構建

參照文獻[18-20]的方法:對fak的氨基酸序列進行同源性分析,選取同源性較好的序列為目的序列,用Primer Premier 5.0設計RNAi引物,擴增cDNA模板。fakRNAi F:5′-AAGCTTAAGCACATAAGGCAT-3′(含有Hind Ⅲ限制性內切酶酶切位點);fakRNAi R:5′-CTGCAGGCAAGTGGACAATCA-3′(含有PstⅠ限制性內切酶酶切位點),將PCR產物與pMD19連接,并轉入DH5α感受態(tài)細胞中,將陽性克隆載體轉化子擴增后進行質粒提取,將質粒雙酶切后連接到載體L4440質粒上,并轉化到大腸桿菌HT115(DE3)中進行擴增。

1.4 fak dsRNA的最佳誘導條件

挑取構建好的RNAi載體單菌落接種于含有Amp、Tet抗性(100 μg·mL-1)的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r·min-1過夜培養(yǎng)后,以體積比為1∶100接種于NGM液體培養(yǎng)基(含有Amp、Tet抗性),過夜培養(yǎng)。加入IPTG,使其終濃度分別為0、0.01、0.10、0.50和1.00 mmol·L-1。在搖床里誘導培養(yǎng)6 h后,用STE法提取dsRNA[21],進行瓊脂糖核酸電泳,確定最佳誘導濃度。以同樣的方法,加入最佳濃度的IPTG,設定誘導時間分別為0、4、6、8和10 h,以確定最佳誘導時間。

1.5 單菌侵染期線蟲(IJs)的制備

1.5.1 無菌線蟲的制備參考詹成修等[5]的方法并改進。取活體大蠟螟培養(yǎng)的DZ懷卵雌蟲,用滅菌自來水清洗3遍后加入1 g·L-1硫柳汞,放置于暗處30 min進行體表消毒。收集消毒后的DZ線蟲,清洗3遍后加入0.4 mol·L-1NaOH(加入2.5%次氯酸鈉至終濃度為0.2 mol·L-1),渦旋振蕩至細砂狀。8 000 r·min-1離心2 min,棄上清液后用滅菌自來水清洗蟲卵,重復3次。最后用滅菌自來水將無菌卵稀釋至合適濃度,滴加在肝瓊脂平板上,用封口膜封口,正置于25 ℃線蟲培養(yǎng)箱,24 h后即可得到同期化的無菌L1期線蟲。

1.5.2 飼喂法制備RNAi組線蟲參考Tzelos等[17]和Xiao等[19]的方法并改進,通過飼喂法對DZ線蟲進行RNAi。分別取HT115(DE3)-L4440-fak質粒和HT115(DE3)-L4440質粒,用NGM液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),并用IPTG進行誘導。將上述無菌L1期線蟲與120 μL誘導后的菌液加入24孔板培養(yǎng),置于25 ℃線蟲培養(yǎng)箱培養(yǎng),獲得fakRNAi組和L4440對照組侵染期線蟲(IJs)。

1.6 熒光定量PCR(qPCR)

收集fakRNAi組及L4440對照組IJs各200條,用RNAiso Plus提取總RNA,用HiFiScript cDNA合成試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA。用Primer Premier 5.0設計熒光定量引物(fakF:5′-ATCCGAGTCCGTCTGGTTGC-3′,R:5′-AGCTCATAGGCCGATTGTGG-3′;18S rRNA F:5′-CATCCAAGGAAGGCAGCAGG-3′,R:5′-CCGCAGCAATGACGATTTACAC-3′),以18S rRNA為內參,使用Applied Biosystems(ABI)Prism 7300序列檢測系統(tǒng)進行熒光定量PCR分析。PCR反應體系(10 μL):模板cDNA 1 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,2×UltraSYBR Mixture(Low ROX)5 μL,RNase-FreeWater 2 μL。PCR反應程序:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,循環(huán)35次。

采用2-ΔΔCT相對定量法計算fak的相對表達量[22]。相對表達量=2-ΔΔCT,ΔΔCT=ΔCT(RNAi組)-ΔCT(對照組)。進行3次生物學重復,使用Graphpad prism 5進行t測驗并繪圖。

1.7 fak RNAi對DZ線蟲侵染力的影響

參照田成麗等[23]的方法并改進,分別收集10 μLfakRNAi組和L4440組IJs懸液,設置濃度分別為5、10、20、40和80 IJs·μL-1,空白對照組使用等量的滅菌自來水。每組選取10只個體大小一致、活潑健壯、質量約0.2 mg的大蠟螟老熟幼蟲,用25 μL微量注射器將懸液注射進大蠟螟的血腔(第1對腹足之間),放入墊有濾紙的培養(yǎng)皿,放置于25 ℃培養(yǎng)箱,每12 h記錄1次大蠟螟的死亡數(shù),直至96 h。每個試驗進行3次生物學重復。

1.8 fak RNAi對DZ線蟲存活率、生長階段的影響

參照Pietsch等[24]的方法并改進,取fakRNAi組和L4440對照組IJs,置于24孔板里,每孔1條,加入誘導完畢的1.2 mL菌液,封口后置于25 ℃培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。每隔24 h觀察并統(tǒng)計死亡情況(用10 μL的槍頭對線蟲的頭部進行輕微刺激,線蟲無反應則斷定為死亡)。

參照Huang等[25]的方法并改進,每隔12 h觀察并統(tǒng)計DZ線蟲進入各生長階段時的時間。Ⅰ繁殖階段:IJs恢復發(fā)育至產卵結束;Ⅱ 快速身體運動階段:繁殖期結束至每10 s擺尾次數(shù)小于10次;Ⅲ 快速咽吸階段:快速擺尾期結束至每10 s咽部抽吸次數(shù)小于10次;Ⅳ 咽抽吸階段:咽部泵送停止至生命結束。

每隔48 h更換1次培養(yǎng)液,每個試驗統(tǒng)計24組數(shù)據(jù),并進行3次生物學重復。

1.9 fak RNAi對DZ線蟲產卵量、孵化率、雌蟲率、體長的影響

參考文獻[26-27]的方法并改進。取fakRNAi組和L4440對照組IJs,待性別分化后取1雄1雌2條線蟲置于24孔板里,加入誘導完畢的1.2 mL菌液,封口后置于25 ℃培養(yǎng)箱進行培養(yǎng),記錄線蟲開始產卵后24 h內的產卵量。

收集蟲卵進行培養(yǎng),48 h后統(tǒng)計蟲卵的孵化情況,并計算孵化率。將孵化的DZ線蟲以每孔1條的比例加入新的24孔板,每隔48 h更換1次培養(yǎng)液,5 d后觀察并計算雌蟲率。

取fakRNAi組和L4440對照組IJs,置于24孔板里,每孔1條,加入誘導完畢的1.2 mL菌液,封口后置于25 ℃培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。每隔12 h吸取6條線蟲進行體長測定并記錄,直至各組線蟲體長不再發(fā)生變化。

每個試驗統(tǒng)計24組數(shù)據(jù),并進行3次生物學重復。

1.10 fak RNAi對DZ線蟲外界機械刺激的影響

參考Nahabedian等[28]的方法并改進。取fakRNAi組和L4440對照組IJs,每孔1條置于24孔板中,加入誘導完畢的1.2 mL菌液,封口后置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。12 d后,取每組線蟲各24條,用10 μL槍頭對線蟲的頭部施加輕微刺激,觀察并統(tǒng)計每10 s內線蟲的擺尾次數(shù)。3次生物學重復。

2 結果與分析

2.1 基因克隆及氨基酸序列分析

DZ線蟲中fak基因全序列長度為2 060 bp,凝膠電泳結果顯示條帶正確且單一明亮,經(jīng)測序鑒定擴增成功(圖1)。NCBI相關功能預測可知:fak基因全序列經(jīng)過轉錄、翻譯,共編碼687個氨基酸,FAK蛋白保守區(qū)主要包括ERM蛋白結構和蛋白激酶。ERM蛋白結構存在于肌球蛋白、蛋白酪氨酸磷酸酶中,在結構域的組裝和穩(wěn)定中起調控作用。蛋白激酶超級家族主要由絲氨酸/蘇氨酸特異性和酪氨酸特異性的蛋白激酶催化域組成,參與機體細胞的生長、增殖、遷移、分化等多種生理活動(圖2)。BLAST結果顯示:DZ線蟲FAK與犬鉤蟲(Ancylostomacaninum,GenBank登錄號:RCN28710.1)FAK相似性較高,氨基酸序列一致性為70.71%;與美洲鉤蟲(Necatoramericanus,GenBank登錄號:XP_013300540.1)的氨基酸序列一致性為69.34%;與捻轉血茅線蟲(Haemonchuscontortus,GenBank登錄號:CDJ97249.1)的氨基酸序列一致性為66.09%。利用MAGA 6.0進行比對并構建基于DZ線蟲FAK氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3),進化分析表明DZ線蟲FAK與Haemonchuscontortus的相應蛋白為姐妹群,具有高度的保守性。

圖1 fak片段凝膠電泳Fig.1 Gel electrophoresis of fak fragement M. DNA標準品DNA marker;fak. fak全序列PCR產物 fak sequence PCR product.

圖2 FAK蛋白保守區(qū)Fig.2 Conserved domain of FAK A. B41超家族B41 superfamily;B. 類PH超家族PH-like superfamily;C. PKc超家族PKc-like superfamily;①磷脂酰肌醇結合位點Phosphoinositide binding site;②磷酸肌醇/肌動蛋白結合位點Actin binding site;③多肽位點Peptide site;④RTP結合位點RTP binding site.

2.2 fak基因的克隆及RNAi載體的構建

對構建完成的HT115(DE3)-L4440-fakRNAi表達載體進行凝膠電泳,結果顯示干擾載體大小為 415 bp,條帶單一明亮(圖4),將質粒送至通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司,測序顯示載體構建成功,可以利用此載體對線蟲相關基因進行干擾。

圖4 PCR凝膠電泳Fig.4 PCR gel electrophoresis M. Marker;fak. HT115(DE3)-L4440-fak RNAi表達載體 Expression vector of HT115(DE3)-L4440-fak RNAi.

2.3 fak dsRNA的最佳誘導條件

HT115(DE3)-L4440-fakRNAi表達載體在IPTG終濃度為0.10 mmol·L-1(圖5-A)、誘導時間為4 h(圖5-B)時,誘導表達的dsRNA條帶最亮,表明fakdsRNA的最佳誘導表達條件為0.10 mmol·L-1IPTG誘導4 h。

圖5 fak dsRNA凝膠電泳Fig.5 Gel electrophoresis of fak dsRNA M為DNA標準品M indicates DNA marker;1～5分別為表達載體在0、0.01、0.10、0.50和1.00 mmol·L-1IPTG誘導 8 h 后的dsRNA產物1-5 indicate dsRNA products of expression vector with IPTG induction at 0,0.01,0.10,0.50 and 1.00 mmol·L-1 IPTG final concentration for 8 h,respectively;6～10 分別為表達載體在0.1 mmol·L-1 IPTG誘導0、4、6、8和10 h后的dsRNA產物6-10 indicate dsRNA products of expression vector with IPTG induction at 0.1 mmol·L-1 final concentration for 0,4,6,8 and 10 h,respectively.

2.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

以18S rRNA作為內參基因,進行RT-qPCR。結果(圖6)顯示:fakRNAi組線蟲的基因表達水平顯著低于L4440對照組,抑制率為39%,干擾效果顯著。

圖6 fak RNAi的相對表達量Fig.6 Relative expression level of fak RNAi L4440:L4440對照組L4440 control group;fak RNAi:fak 基因干擾組The interference group of fak gene;**P<0.01. 下同。The same as follows.

2.5 fak RNAi對線蟲侵染力的影響

從圖7可知:相同侵染時間大蠟螟的死亡率隨IJs濃度的增加而增加;在相同濃度的處理下,大蠟螟的死亡率隨IJs侵染時間延長而增加。在侵染96 h內,空白對照組大蠟螟的死亡率均為0%;在侵染12 h內,fakRNAi組、L4440對照組不同濃度下大蠟螟的死亡率無顯著差異;當侵染時間為36 h時,fakRNAi 組濃度高于400 IJs·larva-1以上大蠟螟的死亡率達80%以上,L4440對照組濃度高于200 IJs·larva-1大蠟螟的死亡率達80%以上;當侵染時間為72 h時,fakRNAi組全部大蠟螟的死亡率超過85%,L4440對照組全部大蠟螟的死亡率為93%,fakRNAi組與L4440對照組之間存在差異。這表明抑制fak基因的表達影響了DZ線蟲的侵染力。

圖7 不同濃度DZ線蟲侵染下大蠟螟的死亡率Fig.7 The mortality rate of larvae infected by different concentrations of DZ nematode

2.6 fak RNAi對DZ線蟲存活率與生長階段的影響

從圖8可知:fakRNAi組線蟲的最長壽命為27 d,L4440對照組線蟲的最長壽命為32 d;fakRNAi組線蟲的平均壽命為16.8 d,L4440對照組線蟲的平均壽命為21.4 d;fakRNAi組線蟲的存活率顯著低于L4440對照組(P≤0.001),這表明抑制fak基因的表達顯著降低了DZ線蟲的存活率(圖8-A)。fakRNAi組線蟲4個生長階段的時長分別為6.5、3.5、3.0和3.0 d,L4440對照組線蟲4個生長階段的時長分別為8.0、4.0、4.0和3.0 d,fakRNAi組線蟲比對照組在階段Ⅰ—Ⅲ 的時長縮短,這表明抑制fak基因的表達影響了DZ線蟲的生長(圖8-B)。

圖8 fak RNAi后DZ線蟲存活率(A)和生長階段時長(B)的變化Fig.8 Survival rate(A)and spans of physiological stages(B)of DZ nematodes after fak RNAi Ⅰ. 繁殖階段Reproductive stage;Ⅱ. 快速身體運動階段Fast body movement stage;Ⅲ. 快速咽吸階段Fast pharyngeal pumping stage;Ⅳ. 咽抽吸階段Pharyngeal pumping stage.

2.7 fak RNAi對DZ線蟲產卵量、孵化率、雌蟲率、體長的影響

從圖9可知:在產卵開始的24 h內,fakRNAi組線蟲的平均產卵量為140枚,L4440對照組線蟲的平均產卵量為143枚,無明顯差異(圖9-A)。在開始孵化的48 h內,fakRNAi組線蟲平均孵化109枚,孵化率為77.9%,L4440對照組線蟲平均孵化134枚,孵化率為93.7%,RNAi組比對照組下降15.8%,且差異極顯著(P<0.001,圖9-B)。對孵化后的線蟲進行性別統(tǒng)計,fakRNAi組線蟲的平均雌蟲率為50.4%,L4440對照組線蟲的平均雌蟲率為50.1%,無明顯差異(圖9-C)。從IJs開始,每隔24 h對線蟲的體長進行測量,在培養(yǎng)的7 d時,fakRNAi組線蟲的平均體長為2 114.83 μm,L4440對照組線蟲的平均體長為2 401.9 μm,RNAi組比對照組下降11.9%(P<0.05,圖9-D)。這表明抑制fak基因的表達對線蟲的產卵量和雌蟲率并無影響,但影響線蟲的孵化率和體長,在一定程度上影響線蟲的發(fā)育。

2.8 fak RNAi對DZ線蟲外界機械刺激的影響

施加外界輕微刺激后,fakRNAi組及L4440對照組擺尾次數(shù)的統(tǒng)計結果見圖10。L4440對照組線蟲在10 s內的平均擺尾次數(shù)為9.5次,fakRNAi組線蟲在10 s內的平均擺尾次數(shù)為8.3次,差異極顯著(P<0.01)。這表明抑制fak基因的表達對線蟲的機械刺激敏感性存在影響。

圖10 fak RNAi后DZ線蟲對機械刺激的敏感性Fig.10 The sensitivity to mechanical stimulus of DZ nematodes after fak RNAi

3 討論

EPN作為一種在歐美國家被廣泛應用的生物殺蟲劑,了解其生長發(fā)育可以更好地改善其殺蟲效率,提高商品化應用[2,5]。FAK是一種非受體蛋白酪氨酸激酶,在細胞信號轉導中處于十分重要的位置,是胞內外信號出入的中樞,介導多條調控生長發(fā)育的信號通路[13,15-16],但fak基因在EPN中的功能還不清楚。本研究以小桿科昆蟲病原線蟲Heterorhabditidoideschongmingensis的模式品系DZ線蟲為研究對象,研究發(fā)現(xiàn)干擾野生型DZ線蟲中fak基因表達后,與對照組相比,產卵量上沒有差異,但在孵化率、存活率、體長等方面均存在顯著差異,且同一時間相同濃度的RNAi組線蟲對大蠟螟的侵染力較低,提示其介入與生長相關的信號通路,并且一定程度上影響DZ線蟲的侵染能力。干擾Caenorhabditiselegans中相關基因的表達不會影響其生育能力,但是會通過影響相關通路信號分子的傳導影響線蟲的胚胎發(fā)育、細胞分裂等過程[29-30]。此外,干擾fak基因的表達也使線蟲對外界機械刺激的運動能力變差,這與Nahabedian等[28]研究的C.elegans中相關基因表達受到抑制而導致運動異常的結果一致。

本研究證明fak基因參與調控DZ線蟲的生長發(fā)育,也是該基因在EPN中參與調控生長發(fā)育功能的首次研究,但該基因在DZ線蟲的相關調控網(wǎng)絡中如何作用以及在DZ線蟲與共生菌共生相關的調控網(wǎng)絡中如何作用等問題仍不清楚。因此,DZ線蟲與生長發(fā)育相關基因的分子調控機制仍需要進一步探索,對其調控網(wǎng)絡的深入認識將為DZ線蟲商品化提供理論基礎,為運用生物技術手段改善EPN的殺蟲效率、促進其商品化發(fā)展提供依據(jù)。